第一章分子克隆技术概述

第一章分子克隆技术概述第1页，共34页，2023年，2月20日，星期三本课程的主要内容分子克隆概述基因克隆工具酶基因克隆载体和宿主目的基因的分离基因克隆操作过程基因克隆的策略目的基因在宿主中的表达第2页，共34页，2023年，2月20日，星期三参考书目资料《分子克隆实验指南》（第三版）：美J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译，科学出版社，2008.《GeneIX》：BenjaminLewin编著.《基因工程原理》：吴乃虎，科学出版社，1998.《分子生物学实验指导》：郜金荣，叶林柏，武汉大学出版社，2007.《基因工程》：张惠展，华东理工大学出版社，2005.生物网址通：/螺旋网：/bbs/生命科学论坛：/bbs/index.php丁香园：/bbs/index.html第3页，共34页，2023年，2月20日，星期三第4页，共34页，2023年，2月20日，星期三第5页，共34页，2023年，2月20日，星期三课程考核方式考试要求：闭卷笔试考试目的：测评运用分子克隆技术原理设计实验解决实际问题的能力总评成绩：考试成绩（80%）平时成绩（20%，课堂+考勤）第6页，共34页，2023年，2月20日，星期三第一章分子克隆技术概述第7页，共34页，2023年，2月20日，星期三一、基本概念基因

从化学上说，指的是一段DNA或RNA序列，该序列可以产生或影响某种表型（phenotype）；从遗传学上说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。第8页，共34页，2023年，2月20日，星期三第9页，共34页，2023年，2月20日，星期三分子克隆技术

又称为重组DNA技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。

供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。第10页，共34页，2023年，2月20日，星期三基因工程（geneticengineering）

基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。

第11页，共34页，2023年，2月20日，星期三第12页，共34页，2023年，2月20日，星期三第13页，共34页，2023年，2月20日，星期三

我们应该记住他们——1.第一个实现DNA重组的人－Berg1972年，Berg用E.coRⅠ切割SV40DNA和λphageDNA，经过连接组成重组的DNA分子。Berg是第一个实现DNA重组的人。

2.第一个取得基因工程成功的人－Cohen

1973年，CohenGroup将E.coli的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒进行体外限制酶切割，并连接成一个新的质粒，转化E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrNer的转化子,实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆并取得成功的例子，这一年被定为基因工程诞生的元年。第14页，共34页，2023年，2月20日，星期三PscloltetrRb-3nersrtetrnertetr

nerOtetrnerCohenGroup第一次实现了细菌遗传性状转移示意图第15页，共34页，2023年，2月20日，星期三二、分子克隆技术的理论基础19世纪中孟德尔豌豆杂交试验确定遗传因子20世纪初摩尔根果蝇杂交实验确定基因20世纪40年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是DNA20世纪50年代，Watson-crick提出了DNA结构的双螺旋结构模型，揭示了生物遗传物质的分子机制20世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式：DNA→RNA→Protein,破译了全部遗传密码第16页，共34页，2023年，2月20日，星期三三、分子克隆的技术准备1．“基因剪刀”－限制性内切酶的发现

（1）20世纪40－60年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。（2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilusinffuenzae）分离纯化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。第17页，共34页，2023年，2月20日，星期三

2．(“交通工具车子”)——载体

（1）有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个“车子”将重组DNA送到宿主细胞中去。（2）1946年起，Lederberg开展了细菌性因子（F因子）的研究。50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。（3）然而，直到1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。第18页，共34页，2023年，2月20日，星期三

3．逆转录酶－1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。（原因如下）（1）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。（3）经过逆转录mRNA→cDNA(complementoryDNA)得到的cDNA文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。有了这些理论和技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg和Cohen两位科学的“助产士”，把基因工程接到了人间。第19页，共34页，2023年，2月20日，星期三四、分子克隆的技术支撑核酸凝胶电泳技术核酸分子连接技术细菌转化技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术第20页，共34页，2023年，2月20日，星期三核酸凝胶电泳第21页，共34页，2023年，2月20日，星期三细菌转化技术（包括感受态细胞制备）第22页，共34页，2023年，2月20日，星期三DNA序列分析技术第23页，共34页，2023年，2月20日，星期三聚合酶链反应（PCR）技术第24页，共34页，2023年，2月20日，星期三五、分子克隆技术的应用分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种第25页，共34页，2023年，2月20日，星期三分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源第26页，共34页，2023年，2月20日，星期三大规模生产生物活性物质野生细胞野生细胞分离工程酶分离工程基因工程蛋白质工程途径工程

工程细胞发酵工程酶工程细胞工程生物活性物质第27页，共34页，2023年，2月20日，星期三第28页，共34页，2023年，2月20日，星期三

TheteamthatclonedDollywaiteduntilshewassevenmonthsoldtoannounceherexistence.Creatinghertook277tries,andrightupuntilherbirth,scientistsaroundtheworldweresayingthatcloningamammalfromanadultcellwasimpossible.Theveryfactthatatthismoment,theresearchisproceedingunderground,unaccountable,posesarealthreat设计、构建生物的新性状甚至新物种第29页，共34页，2023年，2月20日，星期三多利诞生的过程

为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞克隆和体细胞克隆的区别这两个基本问题，对我们学习后面内容或许有所帮助和启发。多利诞生的过程：

1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。

2.取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一只羊乳腺细胞基因（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。

3.将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一样），最后产下多利。这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。

第30页，共34页，2023年，2月20日，星期三Itchallengesthelawsofnature,theevolutionofalllivingthings.第31页，共34页，2023年，2月20日，星期三基因工程克隆技术是人类对自然的干预

经典的遗传学千百万年才能积累出现的有利的变异，通过基因工程手段几