光动力联合vp3基因治疗能显著增强鼻咽癌移植瘤的疗效

光动力治疗联合VP3治疗能显著增强鼻咽癌移[]构建好的VP3质粒稳定转染至人鼻咽癌细胞CNE-2，建立细胞系，并移植至鼠致瘤，将组：PDTCNE-2组；E组：PDT+空载体转染组；F组：PDT+VP3质粒转染组。在肿瘤形成后行光动力治疗（photodynamictherapyPDTPDTVP3质粒转染组肿瘤治疗或者光动力治疗有更显著的鼻咽癌效应。[]鼻咽癌VP3光动力治疗治PDT是治疗的一种新的激光医疗技术，它利用光敏剂能选择性在肿瘤组而肿瘤细胞，达到治疗的目的。VP3是鸡贫血（chickenanemiaCAV）中发现（apoptinapoptin治疗的两者联合治疗可能会明显提高的治疗疗效本实验小组前期已经在体外实验中PDT联合凋亡VP3较单一的方法PDT或过表达VP3能明显增强对细胞CNE-2的效果，本实验拟在体内实验中观察该治疗方法对移植瘤pcDNA3.1(-)-His质粒由中南大学病理生理学教研室提供，PcDNA3.1(-)Hre2.Grp78p.VP3-细胞由中南大学肿瘤提供。BALB/C鼠，4~6，雄性，体重18~22g，购自实验动物中心。鼠抗VP3单克隆抗体购自SantaCruzBiotechology，羊抗小鼠IgG购自BosterBiologicalTechnology。光敏剂5-ALA，购自Sigma公司。半导体激光LA-D-635-500，波长为635nm，购自中国广州光电1.2.细胞培养CNE-2细胞在加入10%胎牛GIBICO的RPMI1640培养（GIBICO）37℃、5％CO2，培养箱中孵育。稳定转染法采用脂Lip2000(invitrogen)分别将真核质粒PVP3和空白质粒164014天，筛选出稳定转染的细胞系。RT-PCR检测、空载体转染E-2CNE-2三种细胞和移植瘤组织中VP3mRNA的表达。使用Trizol(invitrogen）一步法提取细胞或组织的总RNA,步骤按完成。VP3引物序列为上游引物5‘-CGGAATTCATGAAGGCTCTCCAAGAAG-3’下游引物5‘-CGGAATTCTTACAGTCTTG-3’由invitrogen公司合成。PCR反应条件如VP3、GAPDH扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，应用自动电泳凝胶成像分析系统(Chemilmager5500，AlphaInnotech公司)图像，测定条带积分光密度值(MetaMorph，UIC公司)，以GAPDH内参照值标准化VP3值，得到VP3相对含量，3次取平均值。Western-blottingVP3组织加入适量裂解液及蛋白酶抑制剂，超声破碎后，4℃、12000×g15min取上清液。5min40ug580V、15min12120V、80min进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶(SDS)80V100min将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上。将膜取出后经5％脱脂奶粉封闭，洗膜后加入一抗(抗apoptin，1：1000稀释)，4℃孵育过夜。次日加入二抗(IgG，1：2000稀释)常温孵育1h，加入ECL试剂暗室，经显影定影后应用自动电泳凝胶成像分析系统图像，β-actinapoptin／β-actinVP3的相对表达3次取平均值。免疫组织化学染色检测凋亡素（Apoptin）表达采用S-P法,移植瘤组织切片经二甲苯30mL／L的H20210minPBS冲洗后，将其置入0．0lmol／L，pH6.0的柠檬酸缓冲液沸水浴10min，以充分抗原．切片室温冷却后．PBS冲洗，滴加非免疫，室温封闭15min，然后滴加小鼠抗人Apoptin抗体(1：15min，PBSDAB2-3min后，PBS终止细胞膜和细胞质出现均匀分布的棕黄色颗粒为表达阳性，并用以下标准评价表达程度强度评分：未(0分)、浅黄色(1分)、浅棕色(2分)和深棕色(3分)；观察结果评分，即阳(3分)和>75％(4分)．染色强度评分和观察结果评分的乘积为表达程度，≥2分认为是表达阳．流式细胞仪测定肿瘤凋亡将肿瘤组织块标本用生理盐水漂洗干净，剪切200500rpm/min的速度离心5,2次,弃上5µlAnnexinV-FITC，轻轻混匀。室温鼠移植瘤模型的建立及培养将36只成瘤鼠分成6组，每组6只，分别为A组：野CNE-2组；BCD+CNE-2E组：光动力+空载体转染组；F组：光动力+质粒转染组。鼠致瘤前1天，取对数生长期细胞，更换细胞培养液，细胞融合90%左右时，用胰酶消化，无1640培基洗涤并计数，用无1640培基将3种细胞稀释到2×106/200ul，将200ul细胞悬液注入鼠单侧腋部皮下，致瘤后10天，肿瘤直径达到0.5±0.2cm时进行分组。鼠由中南大学实验动物部瘤体积=1/2长径×2。肿瘤抑制率=(1-实验组平均瘤体积/对照组平均瘤体积)×100%。所30天处死动物，取出肿瘤称瘤重，此后将瘤组织放入预冷的生理盐水内，洗3—480"CRT-PCRWestern-blotting检测。用于免疫组化分析的标本经40g／L固定。制光敏剂5-ALA所需浓度1mg/ml,依据鼠体重，按5mg/kg体重注射至肿瘤周围。48小2cm,1cm220min,120J/cm2[2-4]1次、共三次。不需2.0SPSS13.0统计软件包进行数据处理，均数以X±S表示。两个样本均数Independent-SampleTtestOne-wayANOVA分析，多样本均数两两比较采用LSD法。P＜0.05表示差异有显著性意义。22.1mRNA与蛋白水平检测CNE-2细胞质粒转然后VP3的表达情况利用RT-PCR检测VP3mRNAPVP3CNE-2VP3mRNA的表达量分AapoptinPVP3CNE-2apoptin蛋白表达CNE-25.66.3倍(P<0.001,1B）2.3各组移植瘤中VP3的表达情况利用RT-PCR检测VP3mRNA水平表达结果发现PDT+质粒转染组和质粒转染组VP3mRNA表达最高，为其他组的3.2~3.6（P<0.001，图A（P<0.001apoptin的表达，结果发现apoptin主要表达在细胞核内，PVP3质粒转染组表达强度（P<0.001，DT+载体转染组和野生型E-2组（P<0.001PDT+质粒转染组表达强度为最高（图3，表12.3各组移植瘤体积及重量比较通过对各组鼠移植瘤体积测量，结果发现PVP3质粒转（P<0.001PDT+ （P<0.001，转染组生长曲线为最低（图4A。通过对各组鼠移植瘤重量的测量，结果发现PVP3质（P<0.001 E-2组的0.39和（P<0.01，PD+图2.4各组移植瘤凋亡情况PDT+（P<0.001PD+36.5%，PVP331.7%（43鼻咽癌（nasopharyngealcarcinoma）是我国南方地区常见的，占头颈部恶性肿瘤首位，已严重地危害了人们的生命健康［5］95%以上的为非角化癌,对差，副作用大，5年生存率不到20%[]。再者鼻咽部部位隐蔽，周围有重要组织，手术，手术效果不佳。因此增强放射敏感性，提高5年生存率及生活质量是临非常棘手的难题。自从1978Dougherty首次用PDT治疗皮肤和皮下以来，光动力学疗法已直接作用肿瘤部位。PDT为治疗提供了一个新的方法。但PDT也存在一些不足之及光敏剂的光敏活性等都可影响PDT对肿瘤细胞的效应；②PDT对氧具有依赖性，PDT的耗氧将使受照射肿瘤组织进一步缺氧从而大大削弱PDT对肿瘤的效应；③PDT光敏剂5-ALA进行PDT治疗并联合凋亡素VP3进行鼻咽癌移植瘤的体内实验研究。本实验先用前期实验中已经验证好的PVP3质粒转染细胞CNE-2，以空白质粒为胞株构建鼠移植瘤模型，鼠移植瘤模型分为6组，分别为A组：野生型CNE-2组；B组：空载体转染组；C组：质粒转染组；D组：野生E-2组；E组：PDT+空载体转染组；F组：PDT+10D组、EF3次PDT治疗。通过对各组鼠移植瘤的体积测量绘制出生长曲线图，发现F组的生长曲线最FPDT+空载体转染。这些结果说明PDT+VP3对鼻咽癌的治疗疗效高于单独使用PDT或VP3治疗。PVP3Hresgrp-78PDT+质粒转Hres能乏氧和放射应急下能显著增强下游基肿瘤-放射治疗研究，证实启动子Hres.Egr-1有乏氧和放射诱导性。葡萄糖调节蛋白-78（glucose-regulatedprotein-78,grp-78）启动子是一种应急敏感的启动子，其在应急反应时能选择性调控的表达。Luna等[11]构建的G1NaGrpTK逆转录载体转染细胞，联合PDT治疗，发现PDT能够诱导TK在细胞中强烈表达。类似的结果在Dong等[12]的实验中也得到了证实。本实验组期的体外实验中观察到构建了Grp78PDTGrp78启动子的联合PDT。作为一种实体瘤，存在相当部分的乏氧细胞，尤其是放疗后复发或残灶的肿瘤组织乏氧细胞，再者PDT治疗过程中造成氧耗，因此在grp-78启动子前嵌合乏氧敏感性的反应元件HresVP3转录活性。总之，PDT联合VP3治疗较单独的VP3治疗或者光动力治疗对鼻咽癌有更强的效果，1ShenYQ,ShenkTE.esandapoptosis.CrurentOpinGenetDevelop,1995,5:105-2IvanaCecic,BrandonStott,MladenKorbelikAcutephaseresponse-associatedsystemicneutrophilmobilizationinmicebearingtumorstreatedbyphotodynamictherapyInternationalImmunopharmacology6(2006)1259–1266NobuhiroNishiyamaYujiMorimotoWoo-DongJangKazunoriKataokaDesignanddevelopmentofdendrimerphotosensitizer-incorporatedpolymericmicellesforenhancedphotodynamictherapyAdvancedDrugDeliveryReviews61(2009)327–338NinaDragicevic-CuricSusannaGra¨feVolkerAlbrechtAlfredFahrTopicalapplicationoftemoporfin-loadedinvasomesforphotodynamictherapyofsubcutaneouslyimntedtumoursinmice:ApilotstudyJournalofPhotochemistryandPhotobiologyB:Biology91(2008)41–50ChowE,PayneD,O'SullivanB,etal.Radiotherapyaloneinpatientswithadvancednasopharyngealcancer:comparisonwithanintergroupstudy.Iscombinedmodalitytreatmentreallynecessary?RadiotherOncol2002;63:269–74.GomerCJ,RuberN.FerrarioA,etal.PropertiesandapplicationsofPDT.Radiat罗乐,邹俊,邓善熙,等.光动力学疗法[J].合肥工业大学学报(自然科学版HprnungR,WaltH,CromptonNE,eral.m2THPC-medictedphotodynamictherapy(PDT)doesnotinduce atochemotherapy,radiotherapyonPDTonhumanbreastcancercellinLunaMC,ChenX,WongS,eral.Enhancedphotodynamictherapyefficacywithinduciblesuicidegenetherapycontrolledbythegrppromoter.CancerRes.2002Mar1;62(5):1458-1461.DongD,DubeauL,BadingJ,etal.Spontaneousandcontrollableactivationofsuicidegeneexpressio