遗传重组的学习资料

遗传重组的学习资料第1页/共79页概述第一节同源重组第二节位点专一性重组第三节细菌中的转座成分第四节真核生物中的转座成分第2页/共79页概述：◘

只要有DNA，就会发生重组减数分裂高等Euk.体细胞核基因、叶绿体和线粒体温和噬菌体转座子转座◘生存→变异→突变，重组损伤修复、适应环境、加速进化◘广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程第3页/共79页◘

重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）◘狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流◘遗传重组与重组DNA技术异常第4页/共79页第一节同源重组第5页/共79页1、

同源重组（homologousrecombination）:

发生在同源DNA序列之间一、特征2、

特征：◘涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大◘涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程

异源双链区的生成◘存在重组热点◘需要重组酶◘单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号第6页/共79页细线期合线期粗线期双线期终变期◘e.g.Euk.减数分裂时的染色单体之间的交换细菌的转化，转导，接合，噬菌体重组第7页/共79页双倍体染色体交换第8页/共79页二、同源重组的机制1、

断裂复合及Holliday中间体的形成◘

Holliday结构同源重组中连接两个DNA双链的交换中间物含有4股DNA链，在连接处为了转换配对所形成交叉链的连接点为…◘Holliday结构形成的分子机制（断裂复合起始机制）

有双链侵入模型、单链侵入模型、双链断裂修复模型等多种◘同源重组都涉及到DNA分子内的－－断裂—复合第9页/共79页3‘5‘5‘3‘Meselson-Radding模型单链入侵模型（链转移模型）置换侵入Loop切除同化异构化分支迁移5’切割第10页/共79页5‘5‘（1）（2）其中－－所有模型和假说都包括切断、链置换、连接等过程双链侵入模型－－P143第11页/共79页双链断裂修复模型P145第12页/共79页2、分枝迁移和Holliday结构的拆分◘分枝迁移（branchmigaration）－－双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散第13页/共79页Holliday的异构化产生重组体的拆分Holliday结构一经生成即可不断地处于异构化－－异源双链

heteroduplexDNA重组结果取决于拆分时配对链上的切口位置第14页/共79页（1）（2）（1）（2）◘Holliday结构的拆分产生含异源双链的亲本DNA分子产生重组体第15页/共79页“亲本链”“重组体”第16页/共79页三、原核同源重组（E.coli）◘发生在双方DNA的同源区域

部分复制的染色体DNA之间或染色体DNA与外源DNA之间细菌的转化、结合和转导

1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和Chi位点◘具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、

序列特异性的单链内切酶活性◘单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链－－－RecA的作用位点◘RecBCD有固定切割位点第17页/共79页3‘◘RecBCD的识别和切割位点a、RecBCD结合在DNA的平头末端（产生机制不清楚）b、外切、解链、移动（ATP）c、兔耳状loop结构产生（再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD在loop单链区的

chi位点3‘方4～6NT处切断单链（单链内切酶）☀

chi位点：GCTGGTGG

目前发现的重组热点

E.coli

含1000个、Euk.第18页/共79页e、RecBCD切割产生3’单链末端第19页/共79页

2、RecA蛋白

（1）

活性a、RecA有单、双链DNA

结合活性b、RecA有NTPase活性（底物差异活性）与单链DNA结合时活性最大---依赖于DNAc、RecA有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子的能力，即联会同源DNA

（但其靶DNA必须有缺口－－结合DNA）第20页/共79页第21页/共79页RecA入侵单链被置换连RecA引发链侵入模型第22页/共79页RecApromotestheassimilationofinvadingsinglestrandsintoduplexDNAsolongasoneofthereactingstrandshasafreeend.

RecA启动的单链入侵第23页/共79页RecA引起的链交换和Holliday结构的生成

第24页/共79页

（2）RecA蛋白催化双链和单链DNA

的反应阶段a、联会前阶段（缓慢）

RecA与单链结合b、单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子

Holliday（5‘侵入）c、从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链DNA

反应结束时，RecA结合到双链上◘其中—单链同化有固定的方向入侵单链为5’－3‘

双链DNA的互补链是3’－5‘第25页/共79页第26页/共79页◘RecBCD和

RecA的共同作用第27页/共79页

3、原核同源重组的其它蛋白

需要E.coli中三个基因ruvA,ruvB和ruvC的产物a、RuvA识别Holliday结构的连接点b、RuvB为分枝迁移提供动力（ATPase10～20bp/s）c、RuvC核酸内切酶---专一性识别Holliday结构的连接点体外切段连接点以拆分重组体第28页/共79页◘E.coli重组的各阶段（损伤修复）损伤DNA复制产生缺口RecA链交换第二次链交换DNApol通过DNA合成填满缺口RuvA,B分枝迁移RuvC切割Holliday连接点第29页/共79页第二节位点专一性重组第30页/共79页一、位点专一性重组（

site-specificrecombination）1、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间的重组噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组2、特征：◘在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接

----产生精确的DNA重排◘都具有整合作用的两个基本特征a、典型的保守性重组---交换是相互的和保存原先的DNAb、发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的专一性核苷酸上Euk.中专一性抗体基因的构建第31页/共79页二、λphage的整合与切除1、实现机制：均是通过---细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组2、特定位点-----附着位点（attachmentsiteatt）◘E.coliattB

含BOB’三序列23bp◘λphage

attP

含POP’三序列

240bp◘核心序列“O”完全一致

（同源部分）

---位点特异性重组发生的地方◘B,B’,P,P’---臂第32页/共79页3、整合过程◘整合后的附着位点为

attL（BOP’）

attR（POB’）◘整合位点---attB、attP

切除位点---attL、attR◘整合过程需要λ整合酶

（integraseInt）（λ编码）和寄主的整合宿主因子IHF

（integrationhostfactor）共同作用第33页/共79页溶源性细菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌体第34页/共79页第35页/共79页4、整合分子机制◘核心序列O全长15bp，富含A-T◘发生在O内的重组交换位点相距

7bp◘整合酶的结合位点：attP240bp、attB23bp(两者的作用不同)◘attP位点的负超螺旋为重组所必须---加强了Int和IHF的亲和力

-----高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构◘Int结合

----核心序列的反向位点（切割位置）

----结合在att臂上（臂与核心区靠近）第36页/共79页intIHFXis第37页/共79页◘整合体及其作用整合体（intasome）---Int和IHF结合到attP时的复合物◘整合体捕获attB

说明-----

a、attB和attP的最初识别靠Int

识别两序列的能力

b、两序列的同源性在链交换时为重要因素第38页/共79页◘Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分◘重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交第39页/共79页5、整合与切除的控制（1）整合◘CⅡ---促使阻遏蛋白CⅠ的产生

---与intgene

的PI结合，转录产生Int蛋白

---且PI位于xis基因内，CⅡ与PI结合导致xisgene失活（2）切除◘寄主SOS反应时---RecA大量产生，促使阻遏蛋白CⅠ的水解

---把OL和OR从阻遏状态释放出来

---从PL转录使int和xis表达第40页/共79页四、依赖于同源重组的位点特异性的序列代换

-----酵母MAT序列的转换1、酵母结合型的转变---DNA序列的代换，而不是互换

---依赖于序列的同源性（被代换的序列命运是被降解调---突变试验）第41页/共79页2、同源序列

匣子WXYZ1Z2totalHML723704747

239882501MAT723704747

239882501MATa723704642239882369HMRa704642239881585第42页/共79页3、转换过程◘内切酶(HO)识别、切割--Y/Z1交界处---起始MAT序列的转换

(双链断裂)

［HM匣子受Sir阻遏蛋白的保护］①第43页/共79页◘Y区域被降解，直到Yα和Ya相同的部分或一直到X区域①②第44页/共79页◘四个断头侵入供体匣子的同源部分并与其中互补链配对◘以供体DNA为模板复制Y区域，holliday结构形成③④第45页/共79页◘Holliday结构的拆分，产生新的MAT匣子和这次转换中的供体匣子第46页/共79页4、特征---同源重组和位点特异性重组特征都具有◘需要大范围的同源序列◘需要重组酶系（rad52基因产物、位点特异性的HO内切酶）第47页/共79页第三节细菌中的转座成分一、转座成分概述1、转座子(元)或转座元件(transposonortransposableelement):

基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）转座（transposition）：转座元的转移过程（不十分确切）2、发现和发展◘1914A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes

玉米果皮、糊粉层花斑突变

玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理

跳跃基因（jumpinggene）◘1947冷泉港实验室（美）BarbaraMcClintock第49页/共79页◘基因转座现象的再次发现与证实

在一个操纵子中，与操纵基因毗连的结构基因发生终止突变后，它除了影响该基因本身产物的翻译外，还影响其后结构基因多肽的翻译，并且具有极性梯度的特征。

插入型极性突变的发现与机理Operon&PolarityMutation

极性突变的基本概念第50页/共79页A酶活性

OgeneZ基因终止突变位

点离O基因的距离

IpoZYA第51页/共79页a)不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性b)转座不是简单的转移，涉及转座子的复制Hotspots(热点)Regionalpreference(在3kb区域内的随机插入)d)某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性

（免疫性）e)靶序列在转座因子两侧会形成正向重复f)转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应3、转座重组的特点c)转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）第52页/共79页二、Prok.转座子种类◘两种类型：简单转座子（simpletransposon）（插入序列insertionsequenceIS）复合转座子（compositetransposon）◘共同特征：a）两端有20～40bp的IRb）具有编码转座酶（transposase）的基因1、插入序列◘最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分◘命名：IS＋编号（鉴定类型）长度700～2000bp第53页/共79页◘特点：a）两端IR为转座酶的识别位点（突变）

b）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（3～9bp）第54页/共79页◘IS可以正反方向插入到DNA（宿主、质粒或某些噬菌体），常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应第55页/共79页a)Tn/TnAfamily

l具有IR、转座酶基因、调节基因（解离酶）、抗抗生素基因

l

Tn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)

2.5kb20kb

Tn3IRTnpAResTnpRAmpRIR38bp38bp转座酶

regulatorβ-内酰胺酶

2、复合转座子◘两种类型第56页/共79页b）两端重复序列为IS的复合转座子

e.g.

IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子ISISISISL

ISR臂中心区臂transposition第57页/共79页◘当两个IS组件相同时，其中任一个都可行使转座功能◘不同时，主要依靠一个◘两侧的IS既可以是IR，又可以是DR状态（IR多）第58页/共79页3转座噬菌体Muphage

（巨型转座子）

C

repressorforA,BB33kd与转座有关A70kd转座酶U,S

毒性蛋白attL,attR

与寄主同源，反向重复，转座必需GinG区倒位酶attLCABSUattR150bp1.5kb

G倒位区38kbPgin◘以E.coli为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解）第59页/共79页◘Mu的插入途径a）侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄主DNA

（两侧各5bp的靶位点序列重复）b）进入裂解生长后，复制产生后代MuDNA几乎全部插入寄主

DNA中，并可继续转座（形成寄主DNA和Mu的共合体），噬菌体成熟时，切段共合体包装第60页/共79页三、转座子的转作机制及模式◘三种类型：复制型、非复制型和保守型1、复制型转座模式◘实质：转座子元件被复制并被移动到受体位点，最终转座过程扩增了转座子的拷贝（供、受点）◘需两种酶：转作酶（作用于原拷贝两末端）解离酶（作用于复制后的拷贝）◘模式：第61页/共79页◘两大步a)共合体形成切口－连接－复制第62页/共79页b)拆分

靶位点的DR形成第63页/共79页第64页/共79页2、非复制型转座模式◘供体上最终产生双链断裂◘供体位点如不能被修复则有致死效应第65页/共79页3、保守型转座模式◘另一种非复制型◘与λ整合机制相似其转座酶与λ整合酶家族有关第66页/共79页4、TnA转座模式◘复制型转座转座酶(tnpA)、解离酶(tnpR)◘解离酶需要特异的内部位点双重功能：解离功能

tnpA及自身的阻遏物◘拆分位点–res

共合体拆分位点◘转座结果产生5bp

的正向重复序列第67页/共79页

第68页/共79页四、转座子转座频率的调控◘每个转座子控制自身转座的核心----控制转座酶的水平不到一个转座酶分子／世代／细胞1、Tn10转座机制◘Tn10为复合型转座子◘IS10R元件提供转座酶活性-----合成转座酶的序列◘自发转座频率---10－7◘Tn10转座酶水平是控制转座的关键◘有两种控制转座的方式第69页/共79页a）通过反义RNA的翻译水平控制◘IS10R外侧边缘两个启动子◘PIN控制IS10R的转录弱启动子◘POUT—强启动子