多糖的分离纯化及生理作用

多糖的分离纯化及生理作用多糖包括植物多糖、动物多糖和微生物多糖。人们已发现多糖不仅是机体的能量来源和骨架成分，而月还具有多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用等多种生物活性。多糖的提取和纯化多糖的提取1.1热水浸提法：其步骤为：原料一粉碎一脱脂一粗提（2—3次）一吸滤或离心一沉淀一洗涤一干燥首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1—3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1%醋酸和1%苯酚或0.1—1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90—100°C，搅拌4—6小时，反复提取2—3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2—5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或漠化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥），干燥后可得粉末状的粗多糖。1.2微波辅助提取法：其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中。由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清。聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取［18］中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46%）。1.3超声辅助法：其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取16］。超声波辅助法与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点［17］。1.4索氏提取法：将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60C-90C条件下提取至无色（一般为6小时）。过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋白，醇沉，除色素。60C干燥，称重。1.5醇提法：先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇，至于4C冰箱中过夜。减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60C通风干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。醇提法方法简单，易于操作，但提取率较低，乙醇使用量大，不宜大规模提取使用。多糖的纯化方法纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程，纯化的方法主要有以下几种：2.1分部沉淀法根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。为了多糖的稳定，常在PH7进行，唯酸性多糖在pH7时-COOH是以-COO'离子形式存在的，需在pH2-4进行分离，为了防止苷键水解，操作宜迅速。此外也可将多糖制成各种衍生物如甲醚化物、乙酰化物等，然后将多糖衍生物溶于醇中，最后加入乙醚等极性更小的溶剂进行分级沉淀分离。2.2盐析法在天然产物的水提液中，加入无机盐，使其达到一定浓度或饱和，促使有效成分在水中溶解度降低沉淀析出，与其它水溶性较大的杂质分离。常做盐析的无机盐的有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。2.3季铵盐沉淀法季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂，可与酸性糖形成不溶性沉淀，常用于酸性多糖的分离。通常季胺盐及其氢氧化物并不与中性多糖产生沉淀，但当溶液的PH增高或加入硼砂缓冲液使糖的酸度增高时，也会与中性多糖形成沉淀。常用的季铵盐有十六烷基三甲胺的溴化物(CTAB)及其氢氧化物(cetyltrimethylammoniumhydroxide，CTA—OH)和十六烷基毗啶(cetylpyridinmhydroride，CP-OH)。CTAB或CP-OH的浓度一般为1%-10%(W/V)的多糖溶液中，酸性多糖可从中性多糖中沉淀出来，所以控制季铵盐的浓度也能分离各种不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小于9,而且不能有硼砂存在，否则中性多糖将会被沉淀出来。2.4柱层析：包括纤维素柱层析、纤维素阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、亲和层析、高压液相层析和其它柱层析。如用活性炭及硅胶做载体的柱层来分离多糖；或用硼砂型的离子交换树脂分离中性多糖。纤维素柱层析纤维素柱层析对多糖的分离既有吸附色谱的性质，又具有分配色谱的性质，所用的洗脱剂是水和不同浓度乙醇的水溶液，流出柱的先后顺序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最后出柱，与分级沉淀法正好相反。举例说明多糖的分离纯化及生理作用3.1板栗多糖的分离纯化及抗氧化活性研究板栗粗多糖的提取称取原料粉末50甘，加入去离子水1000ml在100C水浴中回流2h.先用纱布过滤，然后离心除去不溶物质。将提取液减压浓缩全约200ml然后将体积比为4:1的三氯甲烷/正丁醇混合液等体积加入多糖溶液中。振荡30min后，静置，除去中间层变性蛋白质，并收集上层清液，重复以上操作3次去除蛋白。向滤液中加入95%乙醇至含乙醇量达到80%，边加边搅拌，得灰白色絮状沉淀。静置6h后，倾出上层清液，余下进行离心分离沉淀，回收上层乙醇溶液。固体部分用少量无水乙醇洗涤2次，再用无水乙醚洗涤2次，自然晾干即为粗多糖(CPS)。板栗粗多糖的纯化将二乙胺基乙基纤维素(DE-AE-52)处理后填充3.0x50cm层析柱，用2倍量蒸馏水平衡。取0.5甘多糖用蒸馏水溶解后上样，蒸馏水洗脱后分别用0.1.0.3.0.5mol/氯化钠溶液梯度洗脱，洗脱液流速为60ml/h分部收集，每管10ml隔管取0.2ml洗脱液用苯酚-硫酸法检测洗脱液中多糖的含量。以480nm处吸收值为纵坐，分部收集的管数为横坐标，做出多糖的洗脱曲线。将柱层析分出的各个组分分别合并收集，减压浓缩至100-200ml，自来水流水透析48h,去离子水透析24h,每4—6h换一次水。离心除去不溶性杂质后，用4倍体积的95%乙醇进行沉淀，固体部分用少量无水乙醇洗涤2次，再用无水乙醚洗涤2次，自然晾干后得纯化多糖(CPS1)3.2胡萝卜多糖的分离纯化及抑制小鼠酒精肝损伤作用研究胡萝卜粗多糖的制备(1)将胡萝卜洗净，切丝，于50C烘干，粉碎。按料液比1:10,超声波处理时间为25min，超声波功率800W，纤维素酶用量为0.8%(w/w)，酶解温度50C，酶解pH为4.5,酶解时间50min.6层纱布过滤，4500r/min离心15min，取上清液，浓缩，用3倍量浓缩体积的95%乙醉沉淀24h,4500r/min离心10min，收集沉淀，冷冻干燥，得到胡萝卜粗多糖胡萝卜多糖的分离纯化胡萝卜粗多糖经除蛋自后，既得精制胡萝卜多糖CP。采用DEAE-cellulose52柱层析对精制胡萝卜多糖进行初步分级分离，为获得精制多糖，将分离所得组分分别经过SephadexG-100凝胶柱层析进一步纯化.3.3玉米花粉多糖的分离纯化玉米花粉多糖提取预处理过的玉米花粉加水，在一20°C冷冻24h以上(或加碱或不作处理)，取出后迅速加人到600C以上的热水中搅拌，使花粉内部的物质自萌发孔处溢出，经真空抽滤或离心收集滤液;滤渣再经此操作数次。合并提取液并浓缩。浓缩液加3~5倍体积95%以上乙醇，收集沉淀物，经过低温真空干燥或常压80C干燥，即为玉米花粉粗多糖PPM。玉米花粉多糖纯化PPM通过Savag法脱蛋白后透析、离心。上清液加人乙醇使之体积分数达到30%，离心得沉淀PPMA;继续向上清液中加乙醇使之体积分数达到60%，离心得沉淀PPMB;再向溶液中继续加乙醇使之体积分数达到75%，离心得沉淀PPMC。然后将PPMC经过DEAE-SephadexA-25柱层析，得到多糖PPMC-1。后者再用DEAE-Sepha-dexU-200凝胶柱层析，进行纯度鉴定。玉米花粉多糖的药理作用玉米花粉多糖(PPM)系从玉米花粉中提取的水溶性多糖，研究表明:PPM可提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数;其对大鼠肺泡巨噬细胞具有激活作用;PPM可以抑制肿瘤，对高血脂也有一定疗效。3.4油松花粉多糖分离纯化及生理作用热水提取油松花粉多糖取一定量经破壁脱脂、酒精浸提处理的油松花粉，按料液比(g/mL)1:10加水，60C下提取。离心，合并上清液，减压浓缩，加入4倍量的95%乙醇过夜沉淀，离心取沉淀，用无水乙醇、丙酮洗涤，得油松花粉粗多糖。水提多糖的分离纯化将油松花粉粗多糖溶于水，用10%三氯乙酸(TCA)除蛋白，剧烈振荡，离心收集上清液，减压浓缩，重复操作直至不再产生白色沉淀。然后取多糖浓缩液流水透析48h，减压浓缩，加入4倍量的95%乙醇过夜沉淀，离心取沉淀，用无水乙醇、丙酮洗涤，得油松花粉精制多糖。先用DEAE一纤维素52柱进行初步分离，分离组分再用SephaerylS-200。柱进一步细分即得精制油松花粉多糖油松花粉多糖的生理作用油松花粉营养丰富、全面，含多种维生素、蛋白质、氨基酸，不饱和脂肪酸，单糖，多糖，其中多糖含量丰富，含量达1.2%~2.5%。目前国内外药理学研究证明松花粉能增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降血糖等作用。3.5豌豆多糖的抗氧化与抑菌活性研究豌豆水溶性多糖的提取称取干燥豌豆豆渣20.0甘，加入200ml六偏磷酸钠水溶液，在80C水浴加热回流4.5h，过滤，将豆渣放回蒸馏烧瓶中，重复上述步骤2次(每次加200ml六偏磷酸钠水溶液作为提取液)，合并3次的滤液，将所得溶液用旋转蒸发仪蒸发浓缩全体积约100ml离心(4000r/min，10min)弃去残渣，上清液为多糖水溶液。将上清液移入100ml烧杯，加入三氯甲烷:正戊醇=5:1(体积比)溶液，剧烈振荡，摇20min离心，分去水层和溶液层交界处的变性蛋自质，得脱蛋自多糖溶液，重复2次。向脱蛋白多糖溶液中加入4倍体积的浓度95%乙醇沉淀，静置24h，离心(4000r/min，10min)，取上清液，固态物用浓度95%乙醇、无水乙醇、丙酮依次进行洗涤，于50oC恒温干燥24h即为豌豆多糖。豌豆多糖的生理作用豌豆多糖在体外对・OH,DPPH•和()丁•都有一定的清除作用。在豌豆多糖浓度为1.0mg/ml时，对•OH,DPPH•,0-.的清除率分别为53.34%,30.