机械搅拌罐培养大肠杆菌

微生物发酵工程实验中南民族大学工商学院环境与生物工程实验教学中心第一页，共十三页。1实验六、机械搅拌罐培养大肠杆菌

一、实验目的二、实验原理三、实验材料四、实验步骤五、实验结果六、注意事项七、思考题第二页，共十三页。21、学会发酵参数的设置。

2、掌握发酵液参数的测定方法。一、实验目的第三页，共十三页。3微生物在发酵培养的过程中其体系参数会发生变化。本实验通过使用机械搅拌罐发酵培养大肠杆菌后测定其发酵液的菌体量、葡萄糖浓度、pH值。

采用分光光度计法在波长620nm下测定其浊度进行菌体量分析；利用pH计测定其pH值；葡萄糖浓度的测定采用3,5-二硝基水杨酸比色定糖法，其原理为

3，5一二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。二、实验原理第四页，共十三页。4三、实验材料1.菌种：大肠杆菌。2.培养基：①种子活化培养基：牛肉膏3g/L

；蛋白胨10g/L

；氯化钠5g/L

；pH7.0-7.2。

②发酵培养基：6g/LNa2HPO4，3g/LKH2PO4，0.5g/LNaCl，1g/LNH4Cl，0.5g/LMgSO4•7H2O，0.011g/LCaCl2，10g/L葡萄糖,pH7.0

。3.葡萄糖标准溶液和3，5-二硝基水杨酸试剂。

第五页，共十三页。5四、实验步骤（一）种子培养用接种环从保存斜面中接一环至盛有种子活化培养基的三角瓶中，37℃振荡培养。（二）大肠杆菌的培养调小气量，燃烧酒精，旋松接种口盖，在火焰保护下，打开接种口盖，倒入种子，旋紧接种口盖子。开始发酵，发酵条件为35℃、300r/min。每隔2小时取样。第六页，共十三页。6（三）取样每次取样时将管口先流出的10ml培养液作为废液，取随后流出的20ml。（四）发酵结束处理剩余菌液进行灭菌处理，排放到指定地点，进行罐的清洗。

四、实验步骤第七页，共十三页。7（五）取样分析1.取样菌体量的分析：测定620nm浊度。2.葡萄糖浓度的测定：3,5-二硝基水杨酸比色定糖法（DNS法）

（1）标准曲线的制作取九支试管，编号，按下表加入各种试剂。将各管快速摇动混匀，在沸水浴中加热5min,取出后立即用水冷却到室温，再向每支试管中加入21.5ml蒸馏水,摇匀,于520nm波长测A值,以葡萄糖mg数为横坐标,光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

四、实验步骤第八页，共十三页。8

（2）样品测定

取离心的上清夜稀释，取1ml于试管中，加蒸馏水1ml，加3,5-二硝基水杨酸试剂1.5ml，加完试剂后同以上操作，测定吸光值，在标准曲线上查出葡萄糖的含量，计算培养基中葡萄糖的量。项目0123456781mg/ml溶液(ml)00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖量(mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.60.43,5-二硝基水杨酸试剂(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.51.53.pH值的测定将不同时段取样离心的上清夜用pH计进行测量,观察发酵过程中pH值的变化,并以时间为横坐标,相应pH值为纵坐标作图。第九页，共十三页。9(1)以时间为横坐标，菌体数量，浊度，葡萄糖浓度，pH为纵坐标作图，观察各参数的变化。

(2)计算最大比生长速率和葡萄糖的比消耗速率。五、实验结果第十页，共十三页。101.机械搅拌罐培养大肠杆菌接种和取样过程中应注意避免造成污染和正确使用设备。

2.注意正确使用离心机并注意安全。

3.酸度计的正确使用。六、注意事项第十一页，共十三页。11七、思考题

机械搅拌罐在培养大肠杆菌的过程中和发酵液参数的测定要注意哪些问题？第十二页，共十三页。12内容总结微生物发酵工程实验。本实验通过使用机械搅拌罐发酵培养大肠杆菌后测定其发酵液的菌体量、葡萄糖浓度、pH值。利用pH计测定其pH值。葡萄糖浓度的测定采用3,5-二硝基水杨酸比色定糖法，其原理为3，5一二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。②发酵培养基：6g/LNa2HPO4，3g/LKH2PO4，0.5g/LNaCl，1g/LNH4Cl，