真核生物的遗传分析

第六章

真核生物的遗传分析目前一页\总数一百五十九页\编于二十二点第一节

真核生物基因组一、C值悖理二、N值悖理三、真核生物基因组DNA序列的复杂度目前二页\总数一百五十九页\编于二十二点

♣

基因组(genome)：一个物种单倍体的染色体数目及其所携带的全部基因称为该物种的基因组。

一、C值悖理

含有一个染色体组的细胞目前三页\总数一百五十九页\编于二十二点6-125000目前四页\总数一百五十九页\编于二十二点♣

C值(CValue)

：一个物种单倍体基因组的DNA含量是相对恒定的，它通常称为该物种DNA的C值。最小的C值:支原体(106bp)最大的C值:显花植物、两栖动物(1011bp)☻C值是生物种的一个特征，不同生物之间差别很大。☻

生物结构和功能复杂程度增加,需要的基因数目和基因产物的种类也越多,因而C值越大。目前五页\总数一百五十九页\编于二十二点目前六页\总数一百五十九页\编于二十二点7-1不同门类生物的C值分布(仿B.Lewin,2000)哺乳类硬骨鱼类

两栖类显花植物Go支软骨鱼类

目前七页\总数一百五十九页\编于二十二点

♣

C值悖理(Cvalueparadox):

C值的大小不能完全说明生物进化的程度和遗传复杂性的高低，即物种的C值和它进化复杂性之间没有严格的对应关系，这种现象称为C值悖理，或C值佯谬。高等生物的C值不一定高于比它低等的生物目前八页\总数一百五十九页\编于二十二点

C值悖理表现在两个方面★

结构与功能相似的同一类生物之间的C值差别很大，或低等生物的C值较高等生物的C值高很多;两栖类、被子植物不同种之间C值差异很大；肺鱼比人C值高出100倍↑与预期的编码蛋白质的基因数目相比，基因组DNA的含量过多。★目前九页\总数一百五十九页\编于二十二点C值悖理现象？真核生物基因组必然存在大量不编码基因产物的DNA序列？目前十页\总数一百五十九页\编于二十二点真核生物的基因组比较庞大

人：基因组共有3.16×109bp按1000个碱基编码一种蛋白质计算，理论上应有约300万个基因，实际大约只有2.5万个。

非结构基因的DNA序列的功能？C值巨大差异在进化中的意义？目前十一页\总数一百五十九页\编于二十二点对C值悖理的解释Petroy:

各种生物基因组的大小是由于基因组中长期积累起来的过量非编码DNA被清除的速率不同所造成的结果，即DNA丢失的速率愈慢，基因组DNA含量越高。目前十二页\总数一百五十九页\编于二十二点N值(N

value):

一个物种基因组的基因数目称为N值。

二、N值悖理

N值悖理(N

valueparadox):生物的基因数目与生物在进化树上的位置不存在正相关的事实称为N值悖理，或N值佯谬。人：2.5万果蝇：1.4万线虫：2.0万目前十三页\总数一百五十九页\编于二十二点N值悖理现象说明：

生物体的复杂性不仅仅是基因数目的函数，随着生物复杂性的增加，基因的大小和基因结构的复杂性亦增加。如：复杂的生物存在机制能使一个基因产生多个蛋白质分子，满足生理功能的需要。生物的复杂性不能仅用基因数目衡量，而应该用整个基因组的理论上的转录物组衡量。目前十四页\总数一百五十九页\编于二十二点

三、真核生物基因组DNA序列的复杂度

♣重复序列的检测方法：通过复性动力学检测基因组DNA序列的复杂性。即通过DNA的变性和复性反应的动力学过程分析DNA序列的性质。如果基因组中每一种基因只有一个，即都是单拷贝序列，那么基因组愈大则基因组的复杂性愈大，复性速率愈小。单拷贝序列中度重复序列高度重复序列目前十五页\总数一百五十九页\编于二十二点DNA复性的影响因素DNA序列的复杂性初始浓度片段大小温度离子强度目前十六页\总数一百五十九页\编于二十二点

真核生物DNA序列的类别

1.单拷贝序列(uniquesequence)：

亦称非重复序列(nonrepetitivesequence),在一个基因组中只有一个拷贝或2-3个拷贝。结构基因大多是单拷贝;单拷贝基因具高度表达能力；不是所有单拷贝序列都编码多肽链。目前十七页\总数一百五十九页\编于二十二点目前十八页\总数一百五十九页\编于二十二点2.中度重复序列(moderatelyrepetitivesequence)：

中度重复序列中的重复单位平均长度约300bp,重复次数为10～102。多为非编码序列，也有编码基因产物的，如人珠蛋白基因；复性速度比单拷贝顺序快，比高度重复顺序慢。

目前十九页\总数一百五十九页\编于二十二点3.高度重复序列(highlyrepetitivesequence)：在基因组中的拷贝数一般在106以上。通常这些序列的长度为6～200bp，如卫星DNA。大部分集中在异染色质区;复性速度很快;无转录能力；多数高等真核生物含20％以上高度重复序列；重复序列的确切生物学意义有待阐明。

目前二十页\总数一百五十九页\编于二十二点高度重复顺序的功能①

维持染色体结构许多反向重复序列是一些蛋白质与DNA的结合位点。②调节基因表达参与基因表达调控的DNA的重复顺序可以转录到核内不均一RNA（hnRNA）分子中，并形成发夹结构，这对稳定RNA分子，使其免遭分解有重要作用。

目前二十一页\总数一百五十九页\编于二十二点③参与转位作用几乎所有转位因子的末端都包括反向重复顺序，长度由几个bp到1400bp，形成回文结构，在转位作用中既能连接非同源的基因，又可以被参与转位的特异酶所识别。目前二十二页\总数一百五十九页\编于二十二点④与进化有关不同种属的高度重复顺序，具有种属特异性，但相近种属又有相似性。如：人与非洲绿猴的α卫星DNA长度仅差1个碱基（前者为171bp，后者为172bp），而且碱基序列有65％是相同的，表明它们来自共同的祖先。目前二十三页\总数一百五十九页\编于二十二点⑤同一种属中不同个体的高度重复顺序的重复次数不一样，这可以作为每一个体的特征，即DNA指纹。⑥卫星DNA成簇的分布在染色体着丝粒附近，可能与减数分裂时染色体配对有关，即同源染色体之间的联会可能依赖于具有染色体专一性的特定卫星DNA顺序。目前二十四页\总数一百五十九页\编于二十二点

DNA在氯化铯中作密度梯度离心，此时DNA分子将按其大小分布在离心管内不同密度的氯化铯介质中，小的分子处于上层，大的分子处于下层；从管外看，不同层面的DNA形成了不同的条带。

DNA分子的浮力密度取决于GC含量,

GC含量越高,浮力密度越大。

卫星DNA(satelliteDNA)

目前二十五页\总数一百五十九页\编于二十二点卫星DNA定义

是一类高度重复序列，通常由2-10bp组成重复单位串联排列而成。由于其碱基组成（G-C含量）不同于其它部分，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开，常在主体DNA带的前面或后面形成次要小区带，就像卫星一样围绕着DNA主带，因而称为卫星DNA。

目前二十六页\总数一百五十九页\编于二十二点CsCl离心目前二十七页\总数一百五十九页\编于二十二点卫星DNA分类●人基因组中，卫星DNA约占5-6％。按其浮力密度不同

Ⅰ

：1.687g/cm3

Ⅱ

：1.693g/cm3

Ⅲ

：1.697g/cm3

Ⅳ

：1.700g/cm3

按其重复单元的核苷酸的多少

小卫星DNA(minisatelliteDNA)：几百bp单元重复组成。微卫星DNA(microsatelliteDNA)：由2-20bp重复上千次。目前二十八页\总数一百五十九页\编于二十二点●果蝇的卫星DNA分为三类，都是由7bp单元重复形成：Ⅰ：5’ACAAACT3’Ⅱ：5’ATAAACT3’Ⅲ：5’ACAAATT3’●

蟹的卫星DNA大部分为只有AT两个碱基的重复顺序组成。目前二十九页\总数一百五十九页\编于二十二点卫星DNA位置●卫星DNA分布于着丝粒附近的异染色质区。●卫星DNA在染色体上的位置可以用放射性探针作DNA分子的原位杂交来鉴定。目前三十页\总数一百五十九页\编于二十二点第二节真菌类的四分子分析与作图一、顺序四分子的遗传分析二、非顺序四分子的遗传分析目前三十一页\总数一百五十九页\编于二十二点单倍体世代：

无性繁殖（为主）二倍体世代：

有性繁殖（短暂）真菌的生活史无性繁殖：

成熟子囊孢子(n,性孢子)萌发→有丝分裂→菌丝体目前三十二页\总数一百五十九页\编于二十二点二倍体时期非常短暂，很快进行减数分裂→四分子→有丝分裂→8个单倍体子囊孢子→顺序地排列在一个子囊中：一个子囊中的8个孢子是单一减数分裂的产物。有性繁殖:两亲本必须是不同交配型A，B，各自的无性子囊孢子落在不同交配型子实体的受精丝上→核融合→2n核。目前三十三页\总数一百五十九页\编于二十二点

(一)四分子与8子囊孢子

1.四分子(tetrad)：脉孢菌减数分裂形成的4个单倍体子囊孢子在一起，称为四分子。2.八子囊孢子：四分子经一次有丝分裂，每一成熟子囊中含8个孢子。

一、顺序四分子的遗传分析

目前三十四页\总数一百五十九页\编于二十二点

3.顺序四分子(orderedtetrad)由于脉孢霉子囊非常狭窄，以致纺锤体不能重叠，减数分裂所产生的四分子只能纵立于其长轴之中顺序直线排列，称为顺序四分子。目前三十五页\总数一百五十九页\编于二十二点

4.脉孢霉8子囊孢子的特点：8子囊孢子中邻接的每对孢子具有相同基因型(有丝分裂产生)。即第1、2对子囊孢子分别来自一条染色体的姊妹染色单体；第3、4对子囊孢子分别来自其同源染色体的姊妹染色单体。目前三十六页\总数一百五十九页\编于二十二点

5.

顺序四分子的作用：子囊中子囊孢子的严格对称性质，证明减数分裂是一个交互过程(reciprocalprocess)。可以把着丝粒作为一个座位(locus)，计算某一基因与着丝粒的重组率。证明双交换不仅可以包括4线中的两线，还可以包括一个二价体的三或四线。可以检验染色单体的交换是否有干涉现象。目前三十七页\总数一百五十九页\编于二十二点（二）着丝粒作图(centromeremapping)

1.

概念:利用四分子分析法，以着丝粒作为一个座位，测定某一基因与着丝粒之间的距离，称为着丝粒作图。

2.

原理：在一对非姊妹染色单体间没有发生着丝粒和某杂合基因间交换的减数分裂和发生了交换的减数分裂，其产物（四分子）中的等位基因在排列方式上是不同的。可通过顺序四分子的排列方式直接观察出来目前三十八页\总数一百五十九页\编于二十二点

如果着丝粒与某一对杂合基因之间未发生交换,则该基因与着丝粒不同步分离。此时，一对等位基因的分离为第一次分裂分离(first-divisionsegregation)

，即M1，形成非交换型子囊。指一对等位基因在第一次减数分裂时发生分离的现象目前三十九页\总数一百五十九页\编于二十二点第一次分裂分离（M1）及非交换型子囊的形成

●减Ⅰ时，同源染色体分离→A和a分离(分别进入两个子细胞)。

●

减Ⅱ时，染色单体分离，A-A(a-a)分离，各自分别进入2个孢子。有丝分裂→8子囊孢子→呈(AAAAaaaa)或(aaaaAAAA)有序排列目前四十页\总数一百五十九页\编于二十二点

如果基因与着丝粒之间发生了交换,则该基因与着丝粒的分离同步。此时，一对等位基因的分离为第二次分裂分离(second-divisionsegregation)

，即M2，形成交换型子囊。指一对等位基因在第二次减数分裂时发生分离的现象目前四十一页\总数一百五十九页\编于二十二点

●若在减Ⅰ时，A-a之间发生了交换，使一条染色体的两条姐妹染色单体分别带有A和a，则尽管同源染色体分离，但两个子细胞仍同时具有A和a—未分离。第二次分裂分离（M2）及交换型子囊的形成

●直到减Ⅱ姐妹染色单体分离，A和a才随之各自进入一个子囊孢子中。有丝分裂→8子囊孢子呈两两相间排列(AAaaAAaa）或其镜像排列（aaAAaaAA)一半四分子产物发生重组目前四十二页\总数一百五十九页\编于二十二点如果一对等位基因的分离发生在第一次减数分裂，则基因与着丝粒之间未发生重组；如果两个基因的分离发生在第二次减数分裂，则说明基因与着丝粒之间发生了重组。

鉴别第一次或第二次减数分裂的分离,可根据8个子囊孢子基因型的排列顺序。目前四十三页\总数一百五十九页\编于二十二点3.着丝粒距离的计算●染色体上两个基因座的距离愈远，发生重组的频率愈高。●

MⅡ子囊所占比例越多，说明该基因和着丝粒的距离愈远。●由于每次单交换只涉及4条染色单体中两条，产生两个重组型和两个非重组型的染色单体，即一个子囊中只有半数孢子发生重组。因此在重组型子囊孢子中，只有两对孢子交换位置，其余两对维持原位。目前四十四页\总数一百五十九页\编于二十二点着丝粒与某一基因间RF=

×1/2×100%或：RF（着丝粒—基因）=×100%每个交换型子囊中，基因位点与着丝粒间发生一次交换，其中半数孢子是重组型(重组型配子)。因此，交换值（重组率RF）的计算公式为：目前四十五页\总数一百五十九页\编于二十二点4.着丝粒作图实验：

链孢霉突变型与表型：

原养型：子囊孢子按时成熟，子囊黑色。营养缺陷型：子囊孢子成熟慢，呈灰白色赖氨酸缺陷型(Lys-)与野生型(Lys+)杂交→二倍体杂合子(Lys+

/Lys-)。杂合子减数分裂后，子囊的黑色孢子和灰色孢子有6种可能的排列方式。目前四十六页\总数一百五十九页\编于二十二点表6-2Lys+×Lys-杂交子代子囊类型(1)(2)(3)(4)(5)(6)子囊类型++－－－－+++－+－－+－++－－+－++－子囊数105129951016分裂类型MⅠMⅠMⅡMⅡMⅡMⅡ非重组型重组型着丝粒-lys+基因的重组率=

×100%

7.3cM目前四十七页\总数一百五十九页\编于二十二点（三）两个连锁基因的作图粗糙链孢酶有两个突变型：烟酸依赖型(nic)----需在培养基中添加烟酸才能生长腺嘌呤依赖型(ade)----需在培养基中添加腺嘌呤才能生长

Pnic+×+ade

n++a(2n)

减数分裂36种不同组合可归纳为７种基本的子囊型忽略着丝粒在减数分裂中的随机趋向造成的不同目前四十八页\总数一百五十九页\编于二十二点

PD：亲二型（parentalditype)，2种基因型，都为亲本型，包括①和⑤。

NPD：非亲二型（non-parentalditype)：2种基因型，都为重组型，包括②和⑥。

T：四型（tetratype),

4种基因型，2亲本2重组，包括③、④和⑦。表粗糙脉孢菌n+

×

+a

杂交结果子囊型（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）四分子基因型顺序+a+an+n+++++nana+++an+na+ana++n++an++an+++na++na++na+an+分离发生时期M1M1M1M1M1M2M2M1M2M2M2M2M2M2四分子类型PDNPDTTPDNPDT实得子囊数80819059015目前四十九页\总数一百五十九页\编于二十二点分析方法：7种子囊型中的四个基因型次序是各不一样的，分别由7种不同的交换方式而来。●分离发生的时期：分别判断每一对基因分离发生的时期（M1或M2），用于计算基因与着丝粒的图距。●两个基因是否连锁？

若连锁，通过计算两基因之间图距以及每个基因与着丝粒之间图距确定它们在染色体上的排序。对于该实验结果的分析方法：目前五十页\总数一百五十九页\编于二十二点子囊型分类：只考虑性状组合，不考虑孢子排列顺序（即只考虑两对基因间是否发生重组），用于计算两对基因间的重组值。⑴亲二型（PD）：两种基因型，与亲代相同。⑵非亲二型（NPD）：两种基因型，与亲代不同。⑶四型（T）：四种基因型，两种与亲代相同，两种为重组型。●目前五十一页\总数一百五十九页\编于二十二点1.

连锁关系的判断自由组合连锁本实验实际结果

PD/NPD＝1PD/NPD＞1898/2结论：nic与

ade

连锁目前五十二页\总数一百五十九页\编于二十二点2.重组值的计算（基因与着丝粒之间的图距）=5.05%目前五十三页\总数一百五十九页\编于二十二点3.判断着丝粒-nic-ade间的位置目前已知nic和ade在同一条染色体上以及它们和着丝粒的距离，但还不知道具体的顺序排列。

①nic、adc分别在着丝粒两侧—异臂②nic、adc在着丝粒同侧—同臂目前五十四页\总数一百五十九页\编于二十二点

两种方法确定：利用nic和ade都在MⅡ状态下时PD和NPD四分子类型出现的频率来判断这两个基因在同臂还是异臂上。分析nic、ade分别与着丝粒的重组率。nic、adc在着丝粒同侧还是异侧？目前五十五页\总数一百五十九页\编于二十二点实验数据显示：MⅡMⅡ的PD子囊数为90，MⅡMⅡ的NPD子囊数为1,PD＞＞NPD。故排除异臂，同臂成立。若nic、ade在异臂，则PD与NPD都是由双交换形成，且机会应相等，因而PD与NPD的频率相等。?目前五十六页\总数一百五十九页\编于二十二点MⅡ的不一致率：若nic、ade分别位于着丝粒两侧，则nic、ade与着丝粒的重组互不干扰(独立)，这种机率只与它们分别与着丝粒的位置(重组率)有关。已知RF(0-nic)=5.05％,RF(0-ade)=9.3％，两者相差不到一倍。那么各自独立交换(MⅡ)的子囊数也应相差不到一倍。分析nic、ade分别与着丝粒的重组率目前五十七页\总数一百五十九页\编于二十二点但实际上，nic是MⅠ,ade是MⅡ(仅着丝粒-ade间交换)的子囊有90个(③)；nic是MⅡ,ade是MⅠ(仅着丝粒-nic间交换)的子囊只有5个(④)。两者的比值远远超过重组值比值，故推翻两基因在着丝粒两侧的排列方式。目前五十八页\总数一百五十九页\编于二十二点

MⅡ的一致率：若两个座位在着丝粒同侧，一旦nic和着丝粒间发生交换，ade和着丝粒也应相应随着产生重组。实验结果：nic-着丝粒间重组(MⅡ)的子囊为101个(4、5、6、7型)，其中96个子囊(5、6、7型)同时发生ade和着丝粒重组，证明nic和ade位于着丝粒同侧。

目前五十九页\总数一百五十九页\编于二十二点已知RF（0-nic)+RF（nic-ade)=5.05%+5.2%=10.25%RF（0-ade)=9.3%

即:RF（0-nic)+RF（nic-ade)≠RF（0-ade)原因：着丝粒和ade间发生过双交换，但在计算RF(0-ade)时却没有计算在内，而在计算RF

(0-nic)和RF(nic-ade)时都各计算一次。目前六十页\总数一百五十九页\编于二十二点

1.酵母的生活史

●酵母的生活史中，有单倍体世代和二倍体世代，两种世代均可通过出芽生殖方式进行无性繁殖。

二、非顺序四分子的遗传分析

目前六十一页\总数一百五十九页\编于二十二点目前六十二页\总数一百五十九页\编于二十二点●酵母的有性生殖：

两个不同交配型的单倍体细胞接合→二倍体→减数分裂→4个单倍体孢子，包含在囊状的子囊中，子囊破裂形成单倍体细胞。2.非顺序四分子(unorderedtetrad)像酵母，减数分裂产生的四分子在子囊内无特定顺序，这种四分子称为非顺序四分子。目前六十三页\总数一百五十九页\编于二十二点3.非顺序四分子分析

对酵母这类真菌的子囊孢子进行遗传分析称非顺序四分子分析。(1)观察一对等位基因，尽管有两种分离的方式：无交换发生,有交换发生。只能形成2种孢子，呈2：2的比值。2：22：2目前六十四页\总数一百五十九页\编于二十二点(2)观察二对基因如Aa、Bb，连锁?图距?AB×ab杂交，无论连锁与否，只能产生3种四分子。因为子囊孢子无序排列，所以仅考虑基因组合，不考虑分离类型(MⅠ或MⅡ)。PD：亲本二型(非交换型）NPD：非亲二型(重组型）T：四型，2种亲本型，2种重组型目前六十五页\总数一百五十九页\编于二十二点确定连锁与非连锁—根据重组率(RF)

RF=0.5，A、B基因不连锁；

RF＜0.5，则两基因座连锁。在3种子囊类型中，T有1/2重组，NPD全部重组，则A-B间的重组率(RF)为：目前六十六页\总数一百五十九页\编于二十二点例如：AB×ab结果：PD=0.56，NPD=0.03，T=0.41

RF＜0.5∴两对基因间连锁。0.235=23.5%=23.5cM遗传距离目前六十七页\总数一百五十九页\编于二十二点连锁基因作图通过计算重组率得AB间相对距离为23.5cM。不够准确。因可能存在双交换和多交换，导致RF值降低，图距减小。确切的基因间距离应是：实际测得的两基因重组值+2×双交换值？准确否？目前六十八页\总数一百五十九页\编于二十二点

第三节真核生物重组的分子机制

一、同源重组发生在减数分裂前期二、同源重组的分子模型——Holliday模型目前六十九页\总数一百五十九页\编于二十二点前言意义：是变异的来源保证了遗传多样性为选择奠定了物质基础使生物得以进化发展遗传重组：造成基因型变化的基因交流过程称为遗传重组，是遗传的基本现象。真核生物、原核生物；减数分裂性细胞内、体细胞内；核基因、叶绿体基因、线粒体基因间都可发生重组前提条件：不同基因型的遗传物质彼此能够转移目前七十页\总数一百五十九页\编于二十二点依据对DNA序列和所需蛋白质因子的要求:

同源重组遗传重组位点专一性重组异常重组

其共同点是双股DNA间的物质交换，但发生的情况不同目前七十一页\总数一百五十九页\编于二十二点同源重组（Homologousrecombination）

又称普遍性重组(generalizedrecombination)

，依赖大范围的DNA同源序列的联会，重组过程中，两个染色体或DNA分子相互交换对等的部分。例如：真核生物同源染色体非姐妹染色单体交换细菌的转化、转导、接合噬菌体的重组一、同源重组发生在减数分裂前期目前七十二页\总数一百五十九页\编于二十二点目前七十三页\总数一百五十九页\编于二十二点3.

特点●需要蛋白质参与（如：大肠杆菌需RecA蛋白、RecBCD蛋白）。●蛋白质因子对DNA碱基序列的特异性要求不高，只要求两条DNA序列相同或接近。●存在重组热点。

●同源序列长度影响重组。

●真核生物染色质的状态影响重组的频率。2.

发生条件

2个DNA分子序列同源，且同源区域越长越容易发生。目前七十四页\总数一百五十九页\编于二十二点证据：①在细胞水平上，人们已经证明了在减数分裂前期，同源染色体配对，两条非姊妹染色单体之间发生断裂、重接和交叉，交叉就是断裂与重接发生的位置。4.同源重组涉及到参与重组的双方DNA分子的断裂与重接

目前七十五页\总数一百五十九页\编于二十二点非姊妹染色体交换目前七十六页\总数一百五十九页\编于二十二点

②在分子水平上，M.Meselson和J.J.Wergle用两个双标记λ噬菌体感染大肠杆菌的实验也证明了染色体断裂并发生再连接。

(c.mi)λ噬菌体1

13C和14N“重”链(+.+)λ噬菌体2

12C和14N“轻”链同时感染大肠杆菌子代噬菌体CsCl密度梯度离心重链重链和轻链接合体轻链目前七十七页\总数一百五十九页\编于二十二点B目前七十八页\总数一百五十九页\编于二十二点重链轻链目前七十九页\总数一百五十九页\编于二十二点

5.几个概念

①杂种DNA（异源双链DNA）：在重组处,每个双链都有一段区域是由亲本DNA分子的各一条链组成的，这个区域称为杂种DNA（hybridDNA）或异源双链DNA（heteroduplexDNA）。

②

分支迁移：重组接点沿双链移动。

③交互重组：一条亲本双螺旋分子和另外一条亲本双螺旋分子共价连接，中间有一段异源双链区，这种重组称为交互重组。目前八十页\总数一百五十九页\编于二十二点分枝迁移——双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散目前八十一页\总数一百五十九页\编于二十二点细线期合线期粗线期双线期终变期

减数分裂时的染色单体之间的交换

目前八十二页\总数一百五十九页\编于二十二点

RobinHolliday于1964年提出了重组的DNA模型（hybridDNAmodel），又称Hollidaymodel。既说明了同源重组的过程，又解释了基因转变现象。二、同源重组的Holliday模型目前八十三页\总数一百五十九页\编于二十二点b:同源非姐妹染色单体DNA中两个方向相同的单链，在DNA内切酶的作用下，在相同位置同时切开c:切开的单链交换d:重接e:形成交联桥结构a:同源的非姐妹染色单体联会

Holliday模型对重组过程的解释目前八十四页\总数一百五十九页\编于二十二点f:交联桥沿配对DNA分子“移动”。两个亲本DNA分子间造成一大段异源双链DNA(Holliday结构)g:和f相同h:绕交联桥旋转1800i:形成Holliday异构体J:通过两种方式之一切断DNA单链，若左右切，则形成非重组体，若上下切则形成重组体。

异源双链的形成目前八十五页\总数一百五十九页\编于二十二点由图可知：无论Holliday结构断裂是否导致旁侧遗传标记的重组，两DNA分子都含有一个异源双链DNA区。目前八十六页\总数一百五十九页\编于二十二点“含异源双链的亲本DNA分子”“重组体”

Holliday结构的拆分目前八十七页\总数一百五十九页\编于二十二点同源重组的Holliday模型ABabABabABabABab1目前八十八页\总数一百五十九页\编于二十二点同源重组的Holliday模型ABabABabABabABab2目前八十九页\总数一百五十九页\编于二十二点ABabABabABabaABb同源重组的Holliday模型3目前九十页\总数一百五十九页\编于二十二点ABabABabABabaABbCGATGGACTGACTGACT同源重组的Holliday模型不管Holliday结构断裂是否导致旁侧遗传标记的重组，两个DNA分子都含有一个异源双链DNA区4目前九十一页\总数一百五十九页\编于二十二点目前九十二页\总数一百五十九页\编于二十二点目前九十三页\总数一百五十九页\编于二十二点Holliday模型的意义:解释了遗传学交换的相互性解释了环连分子产生的原因部分解释基因转变目前九十四页\总数一百五十九页\编于二十二点第四节

基因转变及其分子机制

一、异常分离与基因转变二、基因转变的类型三、基因转变的分子机制目前九十五页\总数一百五十九页\编于二十二点

在一个杂合体中，如果一染色体把基因A交给它的同源染色体，则它的同源染色体必定把基因a交回给它，所以在真菌杂合体中，一个座位上的两个等位基因分离形成子囊时，形成6种正常分离类型，A和a呈现2：2或1：1：1：1或1：2：1的分离，

异常分离（abnormalsegregation）：

一、异常分离与基因转变可是在面包酵母中发现有的子囊含有（3A+1a）或（1A＋3a）的异常分离的子囊孢子。目前九十六页\总数一百五十九页\编于二十二点目前九十七页\总数一百五十九页\编于二十二点Mitchell杂交试验：粗糙脉孢菌基因转变pdx＋＋pdxppdx＋＋pdxp×

pdxp－吡哆醇pH敏感pdx－吡哆醇pH不敏感基因转变好象是一个基因转变成为另一个基因，其邻近的基因仍然是2：2分离pdxpdxpdxppdxp＋＋＋＋＋理论结果pdxpdxpdxp＋＋＋＋＋实际结果目前九十八页\总数一百五十九页\编于二十二点Mitchell杂交试验孢子对子囊1234第一对+pdxppdx+++pdx+第二对++pdx+

+pdxp+pdxp第三对

+pdxp++pdx+++第四对pdx++pdxppdx+pdx++pdxpxpdx+发生原因：基因突变？因为频率远比基因正常突变率高得多。目前九十九页\总数一百五十九页\编于二十二点

由于重组，出现了完全野生型的孢子对(＋,＋)，但没有重组的对应产物—双突变型的孢子(pdx,pdxp)，尽管pdxp出现异常的3:1分离，但紧密连锁的pdx基因却显示出正常2:2分离。这些反常的情况，好像是一个基因转变为它的等位基因，这种现象称为基因转变（geneconversion）。基因转变与遗传重组有关目前一百页\总数一百五十九页\编于二十二点粪生粪壳菌子囊目前一百零一页\总数一百五十九页\编于二十二点粪生粪壳菌的基因转变目前一百零二页\总数一百五十九页\编于二十二点染色单体转变（chromatidconversion):

减数分裂的4个产物中只有一个发生转变，出现6：2分离；

2.

半染色单体转变（half-chromatidconversion)：

减数分裂的4个产物中有一个产物的一半或两个产物的各一半发生转变，出现5：3分离或3：1：1：3分离。减数分裂后分离：等位基因的分离发生在减数分裂后的有丝分裂中二、基因转变的类型目前一百零三页\总数一百五十九页\编于二十二点1个产物转变1个产物的一半转变2个产物的各一半转变目前一百零四页\总数一百五十九页\编于二十二点目前一百零五页\总数一百五十九页\编于二十二点

基因转变的实质：

重组过程中留下的局部异源双链区，在细胞内的修复系统识别下不同的酶切/不酶切产生的结果(一个基因转变为它的等位基因)。两种校正方式：

不配对的碱基对由核酸外切酶切除，新合成的互补短链在连接酶的作用下连接上去。由于切除的不配对区段的不同，校正后或出现野生型或出现突变型。三、基因转变的分子机制目前一百零六页\总数一百五十九页\编于二十二点G(=+)A(=g)或AT突变型

(g)丢失G图

不配对碱基对的两种修复校正方式CG野生型

(+)丢失A目前一百零七页\总数一百五十九页\编于二十二点1.两个杂种分子均未校正（图6-18a）,复制后出现异常的4＋∶4g（或3∶1∶1∶3）分离半染色单体转变。根据切除修复原理，基因转变的分子机制如下:2．一个杂种分子校正为+或g时（图6-18b），出现5∶3或3∶5异常分离半染色单体转变。目前一百零八页\总数一百五十九页\编于二十二点4．两杂种分子都按原来两个亲本的遗传结构进行修复时，则减数分裂4个产物恢复成G-C、G-C、A-T、A-T的正常配对状态，子囊孢子分离呈现正常

4＋∶4g的结果，如图6-18d所示。3.两杂种分子都被校正到+（或g）时（图6-18c），修复后出现6＋∶2g（或2＋∶6g）的异常分离

染色单体转变。目前一百零九页\总数一百五十九页\编于二十二点＋G＋＋＋＋+CAGGCTTAG/C:+A/T:g目前一百一十页\总数一百五十九页\编于二十二点共转变（coconversion）：几个基因发生同时转变的现象称为共转变。两个基因越近，共转变频率越大。

极化子基因转变是有极性的：从单链断裂点开始，基因转变从高到低形成一个梯度。

极化子：在染色体上呈现基因转变极化现象的一个区域称为一个极化子。目前一百一十一页\总数一百五十九页\编于二十二点

第五节

体细胞交换与基因定位

一、单倍体化与体细胞交换二、有丝分裂交换与基因定位目前一百一十二页\总数一百五十九页\编于二十二点例:构巢曲霉

营养缺陷菌株1(n)×营养缺陷菌株2(n)

↓

原养型菌落(2n)异核体（heterocaryon）：两不同基因型的体细胞融合,形成同时含有两个细胞核的细胞、孢子或菌丝体等称为异核体。一、单倍体化与体细胞交换目前一百一十三页\总数一百五十九页\编于二十二点合核体（synkaryon）:大量异核体中的核保持单倍体状态,少数单倍体细胞核融合成为二倍体细胞核,即合核体.如:构巢曲霉，绿色孢子(w+y+)

黄色(w+y-)

白色(w-y+)

A-B+w+y-×A+B-w-y+↓A-B+w+y-产生的分生孢子有黄色、

A+B-w-y+白色、也有绿色（合核体）目前一百一十四页\总数一百五十九页\编于二十二点分离子（segregant）：重组体、非整倍体或单倍体的总称。产生途径:

有丝分裂不分离

单倍体化

染色体丢失

体细胞交换目前一百一十五页\总数一百五十九页\编于二十二点MM+MMM+M基因型表型基因型表型MMM+

MM+

野生型或M+M+MMMM+M+MM+MM+MMM+M+MMM+M+有丝分裂不分离Ｍ正常Ｍ不分离2n2n2n-12n+1M目前一百一十六页\总数一百五十九页\编于二十二点单倍体化（haploidization）：体细胞在有丝分裂过程中,由于染色体不分离产生非整倍体或单倍体的过程。三体：2n+1

单体：2n-1目前一百一十七页\总数一百五十九页\编于二十二点abcabcabcABC

ABCABCABCa2n+1

bc2n-1abcABCABCcn+1ABCABC①②③④①有丝分裂(a)不分离;②丢失a染色体;③丢失b染色体；④失去c染色体。2nn单倍体化过程目前一百一十八页\总数一百五十九页\编于二十二点aaa+a+aaa+a+(丢失)aaa+有丝分裂染色体丢失2n2n2n-1有丝分裂染色体丢失（mitoticchromosomeloss）：杂合体细胞中在有丝分裂后的子细胞重建时，发生一条染色体丢失的现象。目前一百一十九页\总数一百五十九页\编于二十二点体细胞交换（somaticcrossingover）：体细胞在有丝分裂过程中,同源染色体间发生的染色体交换。paba:对氨基苯甲硝酸y：黄色孢子ad16：嘌呤16ad8：嘌呤8bi：生物素目前一百二十页\总数一百五十九页\编于二十二点Stern在果蝇有丝分裂中发现了连锁基因交换。黄体（y），焦刚毛（sn）。目前一百二十一页\总数一百五十九页\编于二十二点(y-sn)(sn-·)

(y-sn-·)y++sny++sny++sny++sny++snysn++y+y++sn+sny+++ysn+sn单纯黄体野生型黄体焦刚毛野生型焦刚毛1234果蝇体细胞有丝分裂交换目前一百二十二页\总数一百五十九页\编于二十二点二、有丝分裂交换与基因定位有丝分裂交换进行基因定位的原理：是依据体细胞同源染色体的交换使得染色体远端的杂合基因纯合化的规律，用来确定基因的排列位置和距离。

离着丝粒愈近的基因纯合的机会愈小，愈远的愈大，而且，着丝粒一端的基因纯合不影响着着丝粒另一端基因的纯合。如果两个染色体臂的基因同时出现纯合化，有可能是一条染色体丢失的结果。目前一百二十三页\总数一百五十九页\编于二十二点

有丝分裂基因定位原理

dabc++++1234

dabc+++c

dabc++++

dabc++bc

dabc++++

dabc+abc131313目前一百二十四页\总数一百五十九页\编于二十二点如：构巢曲霉ad，pro，pab，y以及它们的显性等为基因的杂合体。y隐性纯合子中：pro，pab的纯合子：5.5%pab的纯合子：72%原养型：22.5ad纯合子：0y的相对纯合率为100%，说明y离着丝点最远说明pro和pab中有一个离着丝点很近说明pab离y很近，则pro离着丝点很近说明pab与y之间发生交换的机率是22.5%说明ad在着丝点的另一侧目前一百二十五页\总数一百五十九页\编于二十二点adpropaby++++adpropaby++++5.5%adpropaby++++72%adpropaby++++22.5%目前一百二十六页\总数一百五十九页\编于二十二点adpropaby22.5725.5(41)(20)(39)准性生殖（parasexuality）：真菌在二倍体的有丝分裂过程中，偶尔发生同源染色体交换，导致连锁基因的重组，这一遗传变异过程称为准性生殖。目前一百二十七页\总数一百五十九页\编于二十二点第六节

体细胞融合与基因定位

一、细胞融合与基因定位目前一百二十八页\总数一百五十九页\编于二十二点细胞融合（cellfusion）：两个或几个体细胞融合成为一个细胞的过程。是体细胞遗传学的核心内容，是应用体细胞遗传学技术进行基因定位的基础。一、细胞融合与基因定位目前一百二十九页\总数一百五十九页\编于二十二点

1958年Okada第一次将两个不同的肿瘤细胞＋仙台病毒（日本血凝病hemagglutinatingvirusofJapan，HVJ）→体细胞融。

融合后的细胞称为杂种细胞（hybridcell），它含有两种细胞的染色体。

仙台病毒（sendaivirus）在这里是促融因子，UV灭活的仙台病毒介导细胞融合过程，该病毒可进入细胞膜内，在邻近的细胞之间形成细胞质桥（cytoplasmicbridge）目前一百三十页\总数一百五十九页\编于二十二点仙台病毒，亦称HVJ，乙型副流感病毒。属副粘病毒属。曾主要应用于细胞工程中的细胞融合技术，基本原理在于HVJ含有细胞表面受体的结合位点，可以促使不同细胞凝聚，最终使细胞膜相互融合。直接产生这种作用的部位是HVJ病毒的外壳，而不是内部的RNA。但是应用HVJ技术有很多缺陷，如细胞感染率低，融合速度慢，反应条件高，融合体的去病毒困难。目前一百三十一页\总数一百五十九页\编于二十二点目前一百三十二页\总数一百五十九页\编于二十二点聚二乙醇(polyethyleneglycol,PEG)：也可显著地提高细胞融合频率，将一定浓度的PEG加入到培养液内，就可使细胞发生凝集。由于PEG是非生物试剂，融合效率高，易于标准化，且价格便宜，因此PEG已成为广泛采用的融合剂，现已取代仙台病毒，它可使细胞膜部分降解，并在细胞间形成细胞质桥，可提高细胞融合的效率。目前一百三十三页\总数一百五十九页\编于二十二点细胞融合过程可分为异核体（heterokaryon）和杂种（hybrid）细胞形成两个阶段。在异核体阶段融合的细胞内含有来自两个亲本的细胞核。随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。目前一百三十四页\总数一百五十九页\编于二十二点杂种细胞具有染色体消减（chromosomediminution）现象：随着分裂的不断进行，最初几代中包含了两种亲本细胞的全部染色体，在以后的增殖传代过程中要失落一部分染色体。例：

小鼠－大鼠杂种细胞丢失大鼠的染色体10％－20％

人－小鼠杂种细胞丢失人的染色体，最后可能只剩下少数的几条或1条人的染色体。目前一百三十五页\总数一百五十九页\编于二十二点目前一百三十六页\总数一百五十九页\编于二十二点通过分析某一基因产物与某一人的染色体是否共同存在而进行基因定位。例：在杂种细胞中人的染色体是随机丢失的，在HAT培养基上只有携带有TK＋基因的人染色体的杂种细胞才能生长，丢失TK＋基因的不能生长。分析了许多杂种细胞克隆知道，凡是能在HAT培养基上生长的杂种细胞克隆都共同具有人的第17号染色体，这表明TK基因就在人染色体17上。目前一百三十七页\总数一百五十九页\编于二十二点1、HAT选择系统含Hypoxanthine–aminopterin-thymidine

次黄嘌呤

氨基喋呤胸腺（胸腺嘧啶脱氧核苷）利用只有杂种细胞由于合成核苷酸的从头合成途径被氨基喋呤阻断后，可利用补救途径合成DNA，细胞能够分裂繁殖生存，而非杂种细胞因其补救途径被HGPRT－、TK－阻断，不能合成DNA，不进行生长而死亡，来选择杂种细胞。目前一百三十八页\总数一百五十九页\编于二十二点（1）DNA的生化合成途径：在细胞中核苷酸的生物合成有两条途径：一条是从头合成的主要途径，是由糖（核糖或脱氧核糖）加氨基酸进行合成。如果代谢拮抗物氨基喋呤存在时，则这一途径受阻。在酶的作用下，启动补救途径（salvagepathway）。补救途径主要依赖于胸苷激酶TK

，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRT，分别由基因TK＋和HGPRT＋编码。只有同时具有这两种酶的细胞才能进行补救途径的合成。目前一百三十九页\总数一百五十九页\编于二十二点（2）用小鼠的肿瘤细胞和人的成纤维细胞进行融合人的细胞：基因TK＋和HGPRT-小鼠细胞：基因TK－和HGPRT＋存在氨基喋呤时，小鼠细胞和人细胞单独都不能生长，融合了的杂种细胞能够在含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基上生长，因为发生互补（complementation）。即小鼠的染色体贡献一个正常的HGPRT基因，人的染色体贡献一个正常的TK基因。目前一百四十页\总数一百五十九页\编于二十二点2、营养缺陷突变型标记系统

CHO细胞已产生了许多营养缺陷突变型，已知在人-中国仓鼠细胞突变型杂种细胞中，人染色体也优先丢失。由于这种中国仓鼠细胞突变型属于营养缺陷突变型，因此只要将融合细胞群培养在不含有这一突变型所需成分的培养基上，就可去除未被融合的突变型细胞。在这种条件下选出的杂种细胞不仅可保留能够与CHO细胞营养缺陷突变型发生互补的人类特异性染色体，而且还能保留其他人体染色体。利用含多条人染色体的杂种细胞更便于快速、系统地进行基因定位。目前一百四十一页\总数一百五十九页\编于二十二点二、同线分析用体细胞杂种进行基因定位有两个步骤：第一，将某个基因定位于某一条染色体上，这称为染色体定（配）位（chromoso