硕士研究课现代分子生物学海藻多糖降解酶胡忠

海藻多糖降解酶的研究胡忠2009-10-26目前一页\总数七十六页\编于二十点主要内容一、海藻多糖二、海藻多糖降解酶三、本课题组的相关研究目前二页\总数七十六页\编于二十点海带

裙带菜

龙须菜

紫菜一、海藻多糖1、来源目前三页\总数七十六页\编于二十点

8000多种海藻：蓝藻、绿藻、红藻和褐藻。海藻胶是海藻细胞壁内的主要填充物质，约占细胞干重的20%－30%。琼胶卡拉胶褐藻胶世界产量(万吨)1-2约33-4中国产量(万吨)0.3-0.41.2约2目前四页\总数七十六页\编于二十点近年来，各国的科学家大力开展从海洋开发新药物的研究计划。因此，对海藻、海藻多糖及其多糖类代谢产物进行了大规模的化学分离、结构确定及生物活性筛选研究。至今，已经从海藻中分离到了具有抗菌、抗肿瘤等活性的多糖类代谢产物，海藻寡糖的生理作用也不断被揭示，引起了人们更大的兴趣。目前五页\总数七十六页\编于二十点2、特性一类多组分混合物，由不同的单糖基通过糖苷键相连而成，是海藻细胞间和细胞内所含的各种高分子碳水化合物的总称。一般为水溶性，大多含有硫酸基，多具高黏度或凝固能力种类很多，根据其来源不同，分为红藻多糖、绿藻多糖、褐藻多糖等，其中褐藻多糖的种类和数量最多。目前六页\总数七十六页\编于二十点三大海藻多糖：

琼胶(agar)、卡拉胶(carrageenan)、褐藻胶(algin)

褐藻胶：来自海带、羊栖菜等褐藻。卡拉胶：角叉菜、杉藻、江篱等红藻；有13种类型，主要有κ-卡拉胶、-卡拉胶、ι-卡拉胶等。琼胶：江篱、石花菜等红藻，由琼胶糖和硫琼胶两部分组成。目前七页\总数七十六页\编于二十点3、海藻多糖的化学结构

褐藻胶是由多聚D-甘露糖醛酸(M)n和多聚L-古罗糖醛酸(G)n以不同规则的排列顺序分布于分子链中，两者中间以交替的MG或多聚交替(MG)n相连接3.1褐藻胶目前八页\总数七十六页\编于二十点琼脂糖结构

琼脂糖(Agarose)和硫琼胶(Agaropectin)的混合物。琼脂糖是以(1,3)-β-D-半乳糖基-(1,4)-3,6-内醚(或不内醚化)-α-L-半乳糖为重复二糖的多糖。

硫琼胶，又称硫酸脂琼胶、琼脂果胶，是带有硫酸脂（盐）、葡萄糖醛酸和丙酮酸的复杂多糖。3.2琼胶目前九页\总数七十六页\编于二十点卡拉胶以(1,3)-β-D-半乳糖基-(1,4)-3,6-内醚(或不内醚化)-α-D-半乳糖为重复二糖的多糖。根据硫酸根数量和位置分为不同类型3.3卡拉胶目前十页\总数七十六页\编于二十点琼脂糖和卡拉胶的二糖组成比较卡拉胶和琼胶均来自于红藻，结构非常相似琼胶中的琼脂糖不含有硫酸根，不带电，应用于核酸电泳；琼胶中的硫琼胶含有硫酸根如何去除硫琼胶是琼脂糖制备中的关键。总体上：卡拉胶中的硫酸基明显多于琼胶目前十一页\总数七十六页\编于二十点agarplate琼脂糖agarose核酸电泳4.1琼胶琼胶可用作增稠剂、凝固剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、保鲜剂、粘合剂和生物培养基。4、海藻多糖的应用目前十二页\总数七十六页\编于二十点4.2卡拉胶具有形成亲水胶体，凝胶、增稠、乳化、威膜、稳定分散等特性，因而被广泛应用于乳制品、冰淇淋、果汁饮料、面包、水凝胶（水果冻）、肉食品、调味品、罐头食品等方面。4.3褐藻胶广泛应用于食品、医药、纺织、印染、造纸、日用化工等产品，作为增稠剂、乳化剂、稳定剂、粘合剂、上浆剂等使用。目前十三页\总数七十六页\编于二十点5、海藻低聚糖褐藻胶被广泛应用于各种工业生产中，褐藻胶或其分级产物经特定的方式改性后，有特殊的生理活性，如：治疗缺血性心脑血管疾病的海洋新药－－藻酸双酯钠(PSS)，已创产值近20亿元，产生了巨大的社会效益和经济效益，治疗缺血性心脑血管疾病的甘糖酯等。（管华诗）5.1褐藻胶低聚糖目前十四页\总数七十六页\编于二十点5.3卡拉胶低聚糖

抗肿瘤；对放射性损伤的保护作用；抑制血管生长；抗氧化；抗菌等皮肤保湿、增白天然防腐剂益生元5.2琼胶低聚糖

作为淀粉老化抑制剂、高甜度甜味剂的充填剂及分散剂、抗氧化剂；功能性食品基料等食品添加剂；在药物方面的应用：抑制癌细胞的发生、抗病毒等。目前十五页\总数七十六页\编于二十点？如何制备海藻低聚糖目前十六页\总数七十六页\编于二十点两种方法：酸法：降解海藻多糖反应剧烈、工艺条件难以控制，酸解法制备低聚褐藻胶已不能适应市场的需要。酶法：降解具有高效性和专一性的特点，而且降解条件温和，水解产物不易被破坏，利于产物分析和回收，因而逐渐代替了传统的酸解法。目前十七页\总数七十六页\编于二十点二、海藻多糖降解酶1、分类褐藻胶裂合酶、卡拉胶酶、琼胶酶2、来源海洋中的一些软体动物鲍、海胆、螺等目前十八页\总数七十六页\编于二十点微生物来源相关细菌可来自：海洋植物体表、动物肠道、海水及海洋沉积物卡拉胶酶：海洋细菌噬纤维菌属、假单胞菌属等褐藻胶裂合酶：固氮菌属和假单胞菌属等海洋细菌以及真菌等

琼胶酶：噬纤维菌属、假单胞菌属、链霉菌属、弧菌属、别单胞菌属等目前十九页\总数七十六页\编于二十点3、海藻多糖降解酶的作用机制3.1褐藻胶裂合酶(alginatelyase)专一作用于多聚D2甘露糖醛酸(M)n的甘露糖醛酸酶；专一作用于多聚L2古罗糖醛酸(G)n的古罗糖醛酸酶(占多数)；某些海洋细菌甚至可以同时产生具有降解多聚D2甘露糖醛酸(M)n和多聚L2古罗糖醛酸(G)n的酶系。1998年，Ertesvag等人从维涅兰德固氮菌(Azotobactervinelandii)中得到一种褐藻胶酶，该酶可以降解MM和MG键的多糖，但不能降解GM和GG键。目前二十页\总数七十六页\编于二十点poly(G)poly(M)

MG褐藻胶裂合酶催化β-消去反应，断裂褐藻胶分子链，在新的非还原端产生具有不饱和双键的糖醛酸，此单元在230~240nm有强烈的紫外吸收。因此，酶活力的测定可在此范围内的波长内测定。poly(G)MM

GG褐藻胶裂合酶的作用机制目前二十一页\总数七十六页\编于二十点与三糖GGG的绑定与三糖MMG的绑定Sphingomonassp.A1的褐藻胶裂合酶A1-II′与底物作用的结构模型Oguraetal.2008,J.Mol.Biol.380,373–385目前二十二页\总数七十六页\编于二十点催化部位氨基酸残基与三糖GGG之间的作用，蓝色代表G单元，绿色代表与底物有氢键作用(黑色虚线)的氨基酸残基。催化部位氨基酸残基与三糖MMG之间的作用，蓝色代表G单元，红色代表M单元目前二十三页\总数七十六页\编于二十点3.2卡拉胶酶(carrageenase)

根据卡拉胶酶的底物专一性不同可将卡拉胶酶分为：-卡拉胶酶、-卡拉胶酶和-卡拉胶酶目前二十四页\总数七十六页\编于二十点

ι-卡拉胶酶裂解部位ι-卡拉胶酶的晶体结构MichelG.etal.2001,JBiolChem.276(43):40202-9目前二十五页\总数七十六页\编于二十点ι-卡拉胶酶的催化部位及其与底物结合示意图催化部位的关键氨基酸目前二十六页\总数七十六页\编于二十点琼脂糖-琼胶酶3.3琼胶酶(agarase)目前二十七页\总数七十六页\编于二十点β-琼胶酶α-琼胶酶Reportedagarasesβ－琼胶酶

α－琼胶酶

琼寡糖agarooligosaccharides新琼寡糖neoagarooligosaccharides目前二十八页\总数七十六页\编于二十点Pseudoalteromonasatlantica菌的β－琼胶酶酶系目前二十九页\总数七十六页\编于二十点

琼胶酶降解琼胶机制Allouch在研究ZobelliagalactanivoransDsij所分泌的β-琼胶酶降解琼胶糖的琼胶酶-琼胶寡糖复合物晶体结构时发现，在琼胶酶蛋白质体上结合了两条寡糖链，一条在其催化活性部位处，蛋白体结合了寡糖链上四个糖单体，另一条接合在与催化活性部位相对应平行的部位上，蛋白体上结合另一条寡糖链上的8个糖单体；由此推断，这种含有两个平行的糖链接合位点的琼胶酶意味着该酶可能在催化降解琼胶糖之前能解开琼胶糖的双螺旋结构。目前三十页\总数七十六页\编于二十点4、海藻多糖降解酶的生化性质目前三十一页\总数七十六页\编于二十点5、海藻多糖降解酶的应用如：制备原生质体（4）其他应用（1）制备海藻低聚糖，为新药、新功能食品的开发提供新的手段（2）作为海藻遗传工程酶（3）研究海藻多糖结构如：琼胶酶可用于DNA胶回收目前三十二页\总数七十六页\编于二十点6、海藻多糖降解酶的研究概况20世纪90年代前：少数的研究，少量酶得到纯化90年代后：许多酶得到纯化，广泛应用分子生物学技术构建基因工程菌近几年：更注重研究酶的空间结构、酶降解海藻多糖的机理，以期提供在分子水平上改造酶的可能性。目前有关海藻多糖降解酶三维结构的报道还比较少。目前三十三页\总数七十六页\编于二十点海藻多糖降解酶的基因克隆及结构研究代表了这一领域最新、最重要的进展。通过将海藻多糖降解酶的基因克隆到适于工业化生产的宿主细胞，可使海藻多糖降解酶的发酵产率发生量的飞跃。此外，对海藻多糖降解酶结构的详细了解使得设计适合工业化应用的酶种成为可能。目前三十四页\总数七十六页\编于二十点

欧美最早开展海藻多糖降解酶研究，进入20世纪90年代日本广泛开展这方面研究，到目前为止，日本在国际上发表的相关论文最多，法国其次。中国在近几年才开始注重海藻多糖水解酶的研究，目前在国际上发表的相关论文还较少。目前三十五页\总数七十六页\编于二十点目前三十六页\总数七十六页\编于二十点三、本课题组的相关研究1、产琼胶酶菌株目前已经筛选得到多株产琼胶酶以及褐藻胶裂解酶的海洋细菌，其中有五株细菌高产琼胶酶，分别命名为HZ105、ZC1、X3、LA1、LA2。

目前三十七页\总数七十六页\编于二十点2216E平板碘液活性染色HZ105Agarivoranssp.HZ105目前三十八页\总数七十六页\编于二十点2216E平板碘液染色ZC1目前三十九页\总数七十六页\编于二十点X3碘液染色2216E平板目前四十页\总数七十六页\编于二十点以琼胶为唯一碳源Vibriosp.LA1Agarivoranssp.LA2目前四十一页\总数七十六页\编于二十点菌株ZC1的16SrRNA基因，相似性最高的只有95.5％Bar,0.02substitutionspernucleotideposition.目前四十二页\总数七十六页\编于二十点菌株形态生理生化碳源利用脂肪酸组成G＋Cmol％菌株鉴定16SrRNA基因序列分析代谢类型菌落形态醌类物质目前四十三页\总数七十六页\编于二十点

菌株HZ105琼胶酶的分离、纯化将菌株HZ105胞外粗酶液进行PAGE电泳凝胶后的卢哥氏碘液活性染色表明HZ105产生三种胞外琼胶酶，分别为琼胶酶a、b、c。1：胞外粗酶液的碘液活性染色2：胞外粗酶液的PAGE2、琼胶酶的分离纯化目前四十四页\总数七十六页\编于二十点1－2：琼胶酶b（1）、c（2）的活性染色3－4：琼胶酶b（3）、c（4）的非变性电泳5－6：琼胶酶b（5）、c（6）的变性电泳M：蛋白标准纯化后琼胶酶的SDS将PAGE电泳凝胶中的琼胶酶条带回收，SDS表明琼胶酶a,b,c的分子量分别为105kDa、58kDa、54kDa。b

c目前四十五页\总数七十六页\编于二十点琼胶酶b、c的质谱(LCMS/MS)鉴定结果：琼胶酶b与来自菌株Vibriosp.JT0107的一个β-琼胶酶最为匹配目前四十六页\总数七十六页\编于二十点琼胶酶c与来自菌株Agarivoranssp.JAMB-A11的一个β-琼胶酶最为匹配目前四十七页\总数七十六页\编于二十点方案1：采取随机切割产琼胶酶细菌总DNA的策略，回收1-10kb的DNA片段与酶切的质粒载体连接构建重组质粒，然后转化到大肠杆菌中。

重组子的筛选策略方案2：比较已报道的琼胶酶基因已得到保守区域，并以此设计引物通过合适的PCR得到琼胶酶基因。3、琼胶酶基因的研究目前四十八页\总数七十六页\编于二十点02468101214161820475257626772反应温度（℃）酶活力（U/mL）菌株X3所产琼胶酶的最适反应温度较高3.1部分基因组文库克隆琼胶酶基因菌株X3目前四十九页\总数七十六页\编于二十点部分基因组文库线路图：p-BluescriptSKBamHI酶切菌株基因组DNASau3AI酶切同尾酶目的片断转化筛选3000bp目前五十页\总数七十六页\编于二十点■部分基因组文库克隆菌株X3的琼胶酶基因

大约20000个阳性克隆子，出现20个左右的凹陷的琼胶水解圈；阳性克隆子经验证，分别有2种插入片段：插入片段1：1260bp，其中含有一个612bp的ORF，推测其编码琼胶酶目前五十一页\总数七十六页\编于二十点插入片段2：3656bp，其中含有一个长1590bp的ORF，Blastp比对，推测是琼胶酶。目前五十二页\总数七十六页\编于二十点1590bpORF的Blastp比对结果目前五十三页\总数七十六页\编于二十点重组菌DH5α-X3a染色前用卢戈氏碘液染色后的重组菌DH5α-X3a

1590bp的ORF与pET-32a构建重组表达载体，转化大肠杆菌，重组菌表现琼胶酶活性目前五十四页\总数七十六页\编于二十点3.2利用序列同源性克隆基因根据已报道的琼胶酶基因序列的同源性or保守区域，设计引物通过PCR得到琼胶酶基因。Agarivoranssp.HZ105目前五十五页\总数七十六页\编于二十点以下菌株的琼胶酶基因序列存在较大相似性Agarivoranssp.JA-1,Agarivoranssp.JAMB-A11，Agarivoranssp.QM38,Vibriosp.PO-303,Vibriosp.JT0107Agarivoranssp.HZ105是否也具有类似的琼胶酶基因？根据所报道的上述菌株的琼胶酶基因序列设计引物Agarivoranssp.HZ1054个琼胶酶基因HZ1,HZ2,HZ3,HZ4目前五十六页\总数七十六页\编于二十点琼胶酶基因HZ12988bpBlastnHighestidentify：98%Highestidentify：99%琼胶酶基因HZ1氨基酸序列BlastpHZ1目前五十七页\总数七十六页\编于二十点NCBIconserveddomaindatabase（CDD）没有搜索到保守区序列琼胶酶基因HZ1氨基酸序列InterProScan数据库搜索：蛋白质结构域和功能位点表明该序列编码的琼胶酶的功能结构域与以往报道的琼胶酶有所不同，可能存在着新的结构功能特性。目前五十八页\总数七十六页\编于二十点琼胶酶基因HZ1在大肠杆菌的重组表达pET-32a碘液染色LB琼脂平板目前五十九页\总数七十六页\编于二十点BlastnresultofagarasegeneHZ2(2868bp)HZ2目前六十页\总数七十六页\编于二十点BlastpresultofagaraseHZ2糖基转运和代谢目前六十一页\总数七十六页\编于二十点BlastnresultofagarasegeneHZ31437bpBlastpresultofagaraseHZ3NoputativeconserveddomainshavebeendetectedHZ3目前六十二页\总数七十六页\编于二十点琼胶酶基因HZ3在大肠杆菌的重组表达pET-32a碘液染色LB琼脂平板目前六十三页\总数七十六页\编于二十点BlastnresultofagarasegeneHZ41362bpBlastpresultofagaraseHZ4HZ4目前六十四页\总数七十六页\编于二十点agaraseHZ4的保守区糖水解酶16家族-琼胶酶亚家族的催化区PutativeconserveddomainshavebeendetectedRicin-typebeta-trefoil;

Carbohydrate-bindingdomain

糖基绑定？重组表达，验证糖基绑定作用目前六十五页\总数七十六页\编于二十点琼胶酶基因HZ4在大肠杆菌的重组表达pET-32a碘液染色LB琼脂平板目前六十六页\总数七十六页\编于二十点各个琼胶酶及其可能的降解琼脂糖的产物：

HZ1：菌株HZ105agaD01：A.QM38agaE11：A.JA-1agaA11：A.JAMB-A11产生2、4、6糖，最终2糖

agaA：V.JT0107产生2、4糖

agaB：V.PO-303

HZ3：菌株HZ105agaD03：A.QM38agaC：V.PO-3038、10、12、14糖agaB：P.CY24

HZ4：菌株HZ105agaA：P.CY24主要产物8、10糖agaD：V.PO-303

HZ2：菌株HZ105agaD02：A.QM38agaB：V.JT01072糖agaE：V.PO-303菌株HZ105的琼胶酶HZ1和HZ2可能锚定在膜上，主要负责将高聚合度的琼胶寡糖降解为二糖。菌株HZ105的琼胶酶HZ3和HZ4可能主要被分泌到胞外，主要负责将琼脂糖降解为高聚合度的琼胶寡糖。有糖基绑定模块可能攻击固态琼胶目前六十七页\总数七十六页\编于二十点染色体HZ12988bpH