现代生物技术与环境污染治理详解演示文稿

现代生物技术与环境污染治理详解演示文稿目前一页\总数一百二十六页\编于二十二点优选现代生物技术与环境污染治理目前二页\总数一百二十六页\编于二十二点—先进的工程技术手段：是指基因工程、酶工程、细胞工程和发酵工程等新技术。—改造生物体：是指获得优良品质的动物、植物或微生物品系。—生物原料：是指生物体的某一部分或生物生长过程中所能利用的物质，如淀粉、糖蜜、纤维素等有机物，也包括一些无机化合物，甚至某些矿石。—为人类生产出所需的产品：包括粮食、医药、食品、化工原料、能源、金属等各种产品。—达到某种目的：则包括疾病的预防、诊断与治疗，环境污染的检测与治理等。目前三页\总数一百二十六页\编于二十二点生物技术的内容细胞工程——包括一切生物类型的基本单位—细胞的离体培养、繁殖、再生、融合以及细胞核、细胞质乃至染色体与细胞器的移植改建等操作技术。酶工程——利用生物有机体内酶所具有的某些特异催化功能，借助固定化技术、生物反应器等新技术、新装置，高效优质地生产特定产品的一种技术。发酵工程——亦称为微生物工程，就是为微生物提供最适宜的发酵条件，生产特定产品的一种技术。这些技术并不是各自独立的，而是相互联系、相互渗透的。基因工程技术是核心技术，它能带动其它技术的发展，如通过基因工程对细菌或细胞改造后获得的工程菌或细胞，必须通过发酵工程或细胞工程来生产有用物质。基因工程——主要涉及一切生物类型所共有的遗传物质—核酸的分离、提取、体外剪切、拼接重组以及扩增与表达等技术。目前四页\总数一百二十六页\编于二十二点微生物工程菌发酵工程基因工程蛋白质或酶蛋白质工程或酶工程动植物个体或细胞细胞工程产品优良动植物品系基因工程、酶工程、细胞工程与发酵工程之间的关系目前五页\总数一百二十六页\编于二十二点生物技术的发展现代生物技术在1970s开始异军突起，近一、二十年来发展极为神速。它与微电子技术、新材料技术和新能源技术并列为影响未来国计民生的四大科学技术支柱，被认为是21世纪世界知识经济的核心。传统生物技术酿造技术近代生物技术微生物发酵技术现代生物技术生物工程目前六页\总数一百二十六页\编于二十二点★现代生物技术发展的主要事件1917KarlEreky(匈牙利)首次使用“生物技术”这一名词1943大规模工业生产青霉素（penicillin－盘尼西林）1944Avery，MacLeod和McCarty通过实验证明DNA是遗传物质1953Watson和Crick发现了DNA的双螺旋结构1958Crick提出了遗传信息传递的中心法则1961Monod和Jacob提出操纵子学说；《BiotechnologyandBioengineering》杂志创刊1966Nireberg等人破译遗传密码1967发现DNA连接酶目前七页\总数一百二十六页\编于二十二点★现代生物技术发展的主要事件1970Smith和Wilcox分离出第一个限制性内切酶HindⅡ；Baltimore和Temin等人发现逆转录酶，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能1971Crick对中心法则作了补充，提出了三角形中心法则1972Khorana等人合成了完整的tRNA基因（转录RNA）1973Boyer和Cohen建立了DNA重组技术（重要标志!!!）1975Kohler和Milstein建立了单克隆抗体技术1976第一个DNA重组技术规则问世；DNA测序技术诞生1977Itakura(板仓)实现了真核基因在原核细胞中的表达1978Genentech公司(美国)在大肠杆菌中表达出胰岛素目前八页\总数一百二十六页\编于二十二点★现代生物技术发展的主要事件1980美国最高法院对经基因工程操作的微生物授予专利1981第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生；第一个单克隆抗体诊断试剂盒在美国被批准使用1982用DNA重组技术生产的第一个动物疫苗在欧洲批准1983基因工程Ti质粒（植物根癌诱癌质粒）用于植物转化1988美国对肿瘤敏感的基因工程鼠授予专利；PCR技术问世1990美国批准第一个体细胞基因治疗方案1997英国培养出第一只克隆绵羊多莉1998美国批准艾滋病疫苗进行人体实验；日本培育出克隆牛，英美等国培育出克隆鼠目前九页\总数一百二十六页\编于二十二点★现代生物技术发展的主要事件2003人类基因组计划：1990年10月美国正式启动人类基因组计划，2003年4月14日，美国国家人类基因组研究项目负责人弗朗西斯·柯林斯博士在华盛顿宣布，美、英、日、法、德和中国科学家经过13年努力共同绘制完成了人类基因组序列图，人类基因组计划所有目标全部实现。基因组序列图首次在分子层面上为人类提供了一份生命“说明书”。美国英国日本法国德国中国国际人类基因组计划各国承担的工作量目前十页\总数一百二十六页\编于二十二点7.1.2环境生物技术（EnvironmentalBiotechnology）环境生物技术的产生现代环境生物技术是现代生物技术应用于环境污染防治的一门新兴边缘学科。它诞生于1980s末期，以高新技术为主体，并包括对传统生物技术的强化与创新。环境生物技术涉及众多的学科领域，主要由生物技术、工程学、环境学和生态学等组成。它是由生物技术与环境污染防治工程及其它工程技术紧密结合形成的，既具有较强的基础理论，又具有鲜明的技术应用特点。环境生物技术的定义直接或间接利用生物或生物体的某些组成部分或某些机能，建立降低或消除污染物产生的生产工艺，或者能够高效净化环境污染，同时又生产有用物质的工程技术。目前十一页\总数一百二十六页\编于二十二点环境生物技术的内容环境生物技术可分为高、中、低三个层次——

高层次是指以基因工程为主导的现代污染防治生物技术，如基因工程菌的构建、抗污染型转基因植物的培育等；

中层次是指传统的生物处理技术，如活性污泥法、生物膜法，及其在新的理论和技术背景下产生的强化处理技术和工艺，如生物流化床、生物强化工艺等；

低层次是指利用天然处理系统进行废物处理的技术，如氧化塘、人工湿地系统等。※环境生物技术的三个层次均是污染治理不可缺少的生物技术手段。为了解决日益严重的环境污染问题，需配合使用高、中、低三个层次的技术，针对不同的问题，采用不同的技术或不同技术的组合。目前十二页\总数一百二十六页\编于二十二点环境生物技术面临的任务

解决基因工程菌从实验室进入模拟系统和现场应用过程中，其遗传稳定性、功能高效性和生态安全性等方面的问题；

开发废物资源化和能源化技术，利用废物生产单细胞蛋白、生物塑料、生物肥料以及利用废物生产生物能源，如甲烷、氢气、乙醇等；

建立无害化生物技术清洁生产新工艺，如生物制浆、生物絮凝剂、煤的生物脱硫、生物冶金等；

发展对环境污染物的生理毒性及其对生态影响的检测技术。目前十三页\总数一百二十六页\编于二十二点7.2基因工程与环境污染生物治理7.2.1基因工程概述基因工程（GeneEngineering）的定义将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作称为基因工程。基因工程包括基因的分离、重组、转移以及基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程。基因工程又称DNA重组技术(RecombinantDNATechnique)，是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。目前十四页\总数一百二十六页\编于二十二点基因工程实施的四个基本条件工具酶基因载体受体细胞基因工程的基本内容

带有目的基因的DNA片段的获取

在体外将带有目的基因的DNA片段连接到载体上，形成重组DNA分子

重组DNA分子导入受体细胞（或称宿主细胞或寄主细胞）

带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体（即所谓克隆：英文Clone一词的单译，意为无性繁殖系，即通过无性繁殖（如细胞有丝分裂）可连续传代并形成的群体）

重组体的筛选目前十五页\总数一百二十六页\编于二十二点基因工程的基本过程质粒酶切位点限制酶切割外源DNA酶切位点限制酶切割DNA链接酶封口重组质粒重组质粒染色体受体细胞目前十六页\总数一百二十六页\编于二十二点DNA大肠杆菌细胞供体细胞目的基因质粒重组质粒

选择工具酶

选择合适的载体

目的基因的分离

目的基因导入受体

目的基因的筛选和检测基因工程的关键步骤：Ⅰ.从细胞中分离出DNAⅡ.限制酶截取DNA片段Ⅲ.分离大肠杆菌细胞中的质粒Ⅳ.DNA重组Ⅴ.再用重组质粒转化大肠杆菌细胞Ⅵ.培养大肠杆菌克隆大量目的基因以大肠杆菌质粒载体为例的基因工程过程目前十七页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙基因工程的工具酶①限制性内切酶—“基因手术刀”

识别和切割DNA双分子链内特殊核苷酸顺序的酶。目前已发现400多种限制酶，每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在其特定的切点上切割DNA分子，切开时形成长短不一的双链末端，称为“粘性末端（cohesiveend）”。目前几乎所有的在基因工程中使用的限制性内切酶都已商品化。DNA双链粘性末端基因工程的关键技术是DNA的连接重组。在DNA连接之前必须进行加工，把DNA分子切割成所需片段，有时为便于DNA片段之间的连接，还须对DNA片段末端进行修饰。把DNA分子切割、DNA片段修饰和DNA片段连接等所需的酶称为工具酶。主要有限制性内切酶、连接酶、修饰酶。目前十八页\总数一百二十六页\编于二十二点②连接酶—“基因的针线”用于将两段乃至数段DNA片段拼接起来的酶。基因工程中最常用的连接酶是T4DNA连接酶。它催化DNA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。GCATATTATACG③修饰酶

DNA聚合酶(DNApolymerase)：催化作用：催化的反应均为使两个DNA片段末端之间的磷酸基团和羟基基团连接形成磷酸二酯键。目前十九页\总数一百二十六页\编于二十二点DNA聚合酶的种类——A.

大肠杆菌DNA聚合酶IB.

大肠杆菌DNA聚合酶I大片段C.

T4噬菌体DNA聚合酶D.

T7噬菌体DNA聚合酶E.

耐高温DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）：由于其最佳作用温度为75～80℃，目前广泛用于聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,简称PCR)及DNA测序。DNA聚合酶的用途——A.

DNA分子的体外合成B.

体外突变C.

DNA片段探针的标记D.

DNA的序列分析E.

DNA分子的修复F.

聚合酶链式反应（PCR）目前二十页\总数一百二十六页\编于二十二点变性退火伸展DNA聚合酶链式反应(PCR)示意图PCR仪目前二十一页\总数一百二十六页\编于二十二点

逆转录酶：逆转录酶是一种有效的转录RNA产生cDNA(互补DNA)的酶。逆转录酶的用途——

以真核mRNA为模板，合成cDNA，用以组建cDNA文库以进而分离为特定蛋白质编码的基因。近年来将逆转录与PCR偶联建立起来的逆转PCR（RT-PCR）使真核基因的分离更加有效。逆转录DNARNAProtein转录翻译

T4多核苷酸激酶：

T4多核苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸基团转移至DNA或RNA片段的5′末端。目前二十二页\总数一百二十六页\编于二十二点T4多核苷酸激酶的用途——A.标记DNA片段的5'端，制备杂交探针；B.基因化学合成中，寡核苷酸片段5'磷酸化；C.用于测序引物的5'磷酸标记。

碱性磷酸酶：将DNA或RNA5’末端的磷酸基团变为羟基。碱基磷酸核糖5’3’γ目前二十三页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙基因工程的载体(Vector)—“基因的运输工具”

能承载外源DNA片段（基因）并带入受体细胞的传递者。载体决定了外源基因的复制、扩增、传代乃至表达。①载体的必备条件

能够进入宿主细胞；

载体可以在宿主细胞中独立复制；

要有筛选标记：携带有外源DNA的载体进入宿主细胞与否以及进入后复制与否全靠筛选标记提供帮助。

对多种限制酶有单一或较少的切点，最好是单一切点。限制酶切点是外源DNA插入、载体DNA开环和闭环的基础。目前二十四页\总数一百二十六页\编于二十二点②载体的种类目前已构建应用的基因工程载体有：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体以及由它们互相组合或与其它基因组DNA组合成的载体。

质粒载体★

质粒(Plasmid)：

能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一个DNA分子，其大小可从1kb（千碱基）到200kb。质粒广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列，它帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。质粒的复制和遗传独立于染色体，但其复制和转录依赖于宿主所编码的蛋白质和酶。目前二十五页\总数一百二十六页\编于二十二点大肠杆菌质粒的分子结构示意图

DNA大肠杆菌细胞质粒抗菌素抗性基因控制质粒DNA转移的基因目前二十六页\总数一百二十六页\编于二十二点

噬菌体（phage）载体噬菌体是感染细菌的一类病毒。λ噬菌体由头和尾构成，其基因组是长约49kb的线性双链DNA分子，组装在头部蛋白质外壳内部。

λ噬菌体整个基因组可分为三个部分：—左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。—中段：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列。—右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。

左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列。对溶菌生长来说，中段是非必需的。核酸外壳蛋白噬菌体结构简图目前二十七页\总数一百二十六页\编于二十二点左臂（长臂）右臂（短臂）中段（非必需区）COS末端（粘性末端）COS末端（粘性末端）利用λ噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。现在广泛使用的λ噬菌体载体是已做过许多人工改造的，主要的改造是：A.设计去除λDNA上的一些限制性酶切点。这是因为λDNA较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。B.在中段非必需区，替换插入某些标志基因如可供蓝白筛选lacI-lacZ’序列，和多克隆位点等。由此可构建出两类λ噬菌体作载体：一类是插入型载体，可将外来序列插中段，常用的λgt系列载体，一般容许插入5-7kb外来DNA；另一类是转换型载体，即可用外来DNA替代中段，如IMBL系列载体。目前二十八页\总数一百二十六页\编于二十二点

柯斯质粒载体（cosmidvector）

是将λ噬菌体的粘性末端（cos位点序列）和大肠杆菌质粒的抗氨苄青霉素和抗四环素基因相连而获得的人工载体，含一个复制起点、一个或多个限制酶位点、一个cos片段和抗药基因，能加入40～50kb的外源DNA。它综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优点。柯斯质粒载体pHC79形体图目前二十九页\总数一百二十六页\编于二十二点

人工染色体载体

其特点是可以容纳大片断外源DNA。以λ噬菌体为基础构建的载体能装载的外源DNA片段只有24kb左右，而柯斯质粒载体也只能容纳35～45kb，然而许多基因过于庞大而不能作为单一片段克隆于这些载体中。—酵母人工染色体（YAC）：

是在酵母细胞中克隆外源DNA大片段克隆体系，由酵母染色体中分离出来的DNA复制起始序列、着丝点、端粒以及酵母选择性标记组成的能自我复制的线性克隆载体。它以质粒的形式出现。

—细菌人工染色体（BAC）：是以细菌F因子（细菌的性质粒）为基础组建的细菌克隆体系。其特点为：拷贝数低，稳定，比YAC易分离，其对外源DNA的包容量可达300kb。BAC可以通过电穿孔导入细菌细胞，其不足之处是对无选择性标记的DNA的产率很低。目前三十页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙目的基因的分离

什么是目的基因？——基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组，获得具有高度应用价值的新品种。为此，须从现有生物群体中，根据需要分离出可用于克隆的此类基因。这样的基因通常称为目的基因。目的基因的获得方法——①从生物的基因组直接分离目的基因常用方法——鸟枪法：简单地说，它有点类似生活中玩的拼图游戏：将一个完整的画面分成杂乱无章的碎块，然后重新拼装复原。鸟枪法即用限制酶将某种生物的DNA切成片段并分别载入载体，对受体细胞进行转化，让外源DNA所有的片段都在宿主细胞中大量扩增，这其中必然含有所需目的基因的转化细胞，再用某些检测方法挑选有目的基因的转化细胞，把目的基因挑选出来。目前三十一页\总数一百二十六页\编于二十二点②从酶促合成法（基因文库法，或cDNA文库法）将真核细胞基因转录的全部RNA提取出来，在体外经逆转录酶的作用，生成与mRNA互补的DNA（cDNA），再将cDNA酶切后载入载体，建立cDNA文库，由于该生物中目的基因的转录活性强，所以cDNA文库中含目的基因的转化细胞比例较大，比较容易用某些检测方法把目的基因挑选出来。此外还可利用PCR技术，可使少量的目的基因片断在合适的条件下进行扩增，以获取目的基因片断。逆转录DNARNAProtein转录翻译目前三十二页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙目的基因导入受体细胞

目的基因能否有效地导入受体细胞，取决于是否选用合适的受体细胞、合适的克隆载体和合适的基因转移方法。

①

什么是受体细胞（或宿主细胞或表达系统）？基因工程发展到今天，从原核到真核细胞，从简单的真核如酵母菌到高等的动植物细胞都能作为基因工程的受体细胞，由于所用的基因载体不同，所选用的受体细胞也不同。

原核生物细胞是一类很好的受体细胞，容易摄取外界的DNA，增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作。——从实验技术上讲，是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；——从实验目的上讲，是有理论研究价值和应用价值的细胞。目前三十三页\总数一百二十六页\编于二十二点

大肠杆菌

假单胞菌——是目前用作基因克隆受体的主要原核生物——用于构建环境保护所需的具有多种降解能力的工程菌

真核生物细胞

如酵母菌和某些动植物的细胞。由于酵母菌的某些性状类似原核生物，所以较早被用作基因克隆受体；虽然动物细胞也被用作受体细胞，但由于体细胞不易再分化成个体，所以采用生殖细胞、受精卵细胞或胚胎细胞作为基因转移的受体细胞，由此培养成转基因动物。目前三十四页\总数一百二十六页\编于二十二点

②

目的基因导入克隆载体和受体细胞

目的基因导入克隆载体——目的基因导入受体细胞之前，一般须先把含目的基因的DNA片段导入合适的克隆载体。根据实验设计，确定了合适的克隆载体和含目的基因的DNA片段，选用限制性内切酶切割，并用DNA连接酶连接，则可以得到预期的重组DNA分子。

重组DNA分子导入受体细胞——转化

把外源DNA分子导入细菌细胞的过程。转化过程包括制备感受态细胞和转化处理。感受态细胞（competentcells）是指处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。转化方法有：

高压电穿孔法

多聚物介导法

磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染法

原生质体融合法

脂质体介导法

显微注射法目前三十五页\总数一百二十六页\编于二十二点

高压电穿孔法——

把宿主细胞置于一个外加电场中，通过电场脉冲在细胞壁或膜上打孔，DNA分子随即进入细胞。该法需专门仪器，目前已有多家公司出售。

多聚物介导法——

聚乙二醇（PEG）和多聚赖氨酸等是协助DNA转移的常用多聚物，尤以PEG应用最广。这些多聚物同二价阳离子（如Mg2+、Ca2+、Mn2+等）和DNA混合，可在原生质体表面形成颗粒沉淀，使DNA进入细胞内。这种方法常用于酵母细胞以及其它真菌细胞。

磷酸钙或DEAE（二乙基氨基）-葡聚糖介导的转染法——

这是将外源基因导入哺乳类动物细胞进行瞬时表达的常规方法。磷酸钙转染法的基本原理是：哺乳动物细胞能捕获粘附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。先将重组DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，随后与磷酸钙形成DNA-磷酸钙沉淀，粘附在细胞表面，达到转染目的。被感染的DNA同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后通过内吞作用进入受体细胞。目前三十六页\总数一百二十六页\编于二十二点

原生质体融合法——

将带重组质粒的细菌原生质体同受体细胞进行短暂的共培养，经过细胞膜融合，将重组DNA导入细胞。

脂质体介导法——

脂质体（liposome）是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，把用来转染的DNA分子包在其中，通过脂质体与细胞接触，将外源DNA分子导入受体细胞。其原理为：细胞膜表面带负电荷，脂质颗粒带正电荷，以电荷间引力将DNA、mRNA及单链RNA导入细胞内。

显微注射法——

利用哺乳动物细胞便于注射的特性，将外源DNA分子通过显微注射法直接注入细胞。目前三十七页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙对目的基因的筛选和检测

目的基因和载体重组并进入宿主后，并非能全部按照预先设计的方式重组，由于操作的失误及不可预测因素的干扰等，真正获得目的基因并能有效表达的克隆子一般来说只是一小部分，而绝大部分仍是原来的受体细胞，或者是不含目的基因的克隆子。必须从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子。

①生物学方法包括遗传学方法、免疫学方法和噬菌斑的形成等。

②核酸杂交法先制备含目的DNA片段的探针(probe)，然后通过DNA-DNA，DNA-RNA碱基配对的原理进行筛选，以探针的使用为核心，包括原位杂交、Southen杂交、Northen杂交等。

②物理方法

先进行PAGE电泳（聚丙烯酰氨电泳），然后将完成PAGE后的分离区带转移到特定的固相膜上产生印迹，然后再用各种方法检测（印迹法—Blotting）。目前三十八页\总数一百二十六页\编于二十二点7.2.2基因工程菌在环境污染生物处理中的应用基因工程菌可以达到的目的基因工程为改变细菌细胞内的关键酶或酶系统提供了可能，从而可以：

提高微生物的降解速率

拓宽酶对底物（有机污染物）的专一性范围

维持低浓度下的代谢活性

改善有机污染物降解过程中的生物催化稳定性目前三十九页\总数一百二十六页\编于二十二点用于污染治理的基因工程菌示例⊙降解卤代芳烃的基因工程菌—pD10质粒-假单胞菌细胞

IMP134菌体中的pJP4质粒上存在着降解氯代苯邻二酚的基因，将此基因克隆到广泛宿主质粒pKT231上。重组之后的质粒记为pD10。当它转移到受体细胞——假单胞菌细胞中后，菌体则能分解代谢氯代苯邻二酚。这个质粒已用于构建降解氯代-O-硝基苯酚的工程菌。pD10质粒分解代谢氯代苯邻二酚pJP4质粒IMP134菌体pKT231质粒克隆宿主受体细胞pD10质粒-假单胞菌细胞目前四十页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙分解尼龙寡聚物的基因工程菌—pOAD质粒-大肠杆菌

黄杆菌属、棒状杆菌属和产碱杆菌属具有分解尼龙寡聚物的质粒。但上述三个属的细菌不易在污水中繁殖。而污水中普遍存在的大肠杆菌又无分解尼龙寡聚物的质粒。冈田等人已成功地把分解尼龙寡聚物的质粒pOAD基因移植到受体细胞大肠杆菌内，使后者获得了该基因指令的遗传性状。大肠杆菌pOAD质粒⊙分解多糖的基因工程菌（兼具废物资源化作用）①将分解纤维素和木质素的基因组建到酵母菌体中，用于处理有机废水、生产乙醇。②将嗜热单胞酵母的纤维素酶基因组建到大肠杆菌中或将谷氨酸脱氢酶基因引入到大肠杆菌质粒pSS515中，再转入到产甲烷的受体菌中，使得发酵工艺成功地用于处理排放废水，生产出高生化需氧量的副产品，即乙醇或甲烷。目前四十一页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙抗金属的基因工程菌目前已发现抗Hg、抗Cd、抗Pb等多种菌株。但是，这类菌株多数生长繁殖并不迅速。把这种抗金属的基因，转移到生长繁殖迅速的受体菌中，构成繁殖率高，富集金属速度快的新菌株，可用于净化重金属污染的废水。例如有人将假单胞杆菌R4染色体中的抗镉基因，转移到大肠杆菌HB101中，使得大肠杆菌HB101能在100mg/L的含镉液体中生长，具有抗镉的遗传特征。大肠杆菌HB101抗镉基因⊙降解除草剂的基因工程菌目前已从细菌质粒中发现降解2,4-D除草剂的基因片段，将这段基因组建到载体质粒上，转移到另一种繁殖快的菌体宿主体内。新构建的基因工程菌，具有高效降解2,4-D除草剂的功能。目前四十二页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙杀虫的基因工程菌—细菌杀虫剂应用基因重组技术生产细菌杀虫剂，目前已经成功应用。苏云金杆菌具有毒性蛋白，能杀死鳞翅目害虫（菜青虫、小菜蛾、甜菜夜蛾、二化螟和棉铃虫幼虫）。把这种毒性蛋白的基因，转移到大肠杆菌和枯草杆菌中，能大量生产这种微生物杀虫剂。把这种杀虫剂微生物包附在种子表面，作物生长之后，根部布满了这种细菌，使植物免受虫害。继这项成果之后，科学家又将苏云金杆菌29个亚种的毒性基因，一起组建到大肠杆菌中去，开发出一种广谱的细菌杀虫剂。菜青虫——菜粉蝶二化螟目前四十三页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙基因工程菌的生态安全问题

关于基因工程应用的生态安全性是人们十分关注的问题，目前仍在研究之中。

至今还没有制定出一部广泛使用工程菌的国际化章程。

考查基因工程菌存活情况，基因工程菌新基因的稳定性能，新基因转移到其它生物体中或其它非目标环境之中的规律以及基因工程菌对生态系统的副作用等等，均是紧紧围绕着治理污染基因工程菌的安全性和有效性进行的。目前四十四页\总数一百二十六页\编于二十二点基因工程菌生态安全性及其优势的基本结论

基因工程菌对自然界的微生物或高等生物不构成有害的威胁，基因工程菌有一定的寿命，菌种可能分化为有效至无效多种类型；

基因工程菌进入净化系统之后，需要一段适应期，但比土著种的驯化期要短得多；

基因工程菌降解污染物功能下降时，可以重新接种；

目标污染物可能大量杀死土著菌，而基因工程菌却容易适应生存，发挥功能。目前四十五页\总数一百二十六页\编于二十二点7.3细胞工程与环境污染生物治理7.3.1细胞工程概述细胞工程(CellEngineering)的定义在细胞水平上（细胞增殖、分化、死亡）研究、开发和利用各类细胞的工程。细胞工程的发展主要建立在细胞融合（cellfusion）的基础上，人们可以根据需要，经过科学设计，在细胞水平上改造生物的遗传物质。它所要求的技术条件、实验设备及试剂、经费等均比基因工程要求的低一些。37℃40min促融剂人细胞小鼠细胞红色荧光染料标记的膜蛋白氯色荧光染料标记的膜蛋白融合细胞目前四十六页\总数一百二十六页\编于二十二点细胞工程的主要方法⊙细胞培养（cellculture）将细胞从生物体内取出，然后在特制的培养容器内给予必要的生长条件，使其在体外（invitro）继续生长与繁殖。细胞培养有动物细胞培养、植物的花粉、原生质体的培养。幼龄动物剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养⊙细胞融合（cellfusion）在一定的条件下，将两个或多个细胞融合为一个细胞的过程，细胞融合又称细胞杂交。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体。细胞的融合过程，最初是细胞在促融因子作用下，出现凝集现象，细胞之间的质膜发生粘连，细胞质开始融合，然后在培养过程中，进而发生核融合，形成杂种细胞。目前四十七页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙细胞重组在体外条件下，运用试验技术从活细胞中分离出各种细胞的结构或组件，再根据需要把它们在不同的细胞之间重新进行装配，成为具有生物活性的细胞。重组有核移植和细胞器移植：①

核移植——主要是借助显微操作仪，在显微镜下用微吸管把一个细胞中的细胞核吸出，直接移到另一个去核的细胞中。②

细胞器移植——通过原生质体对已分离纯化的叶绿体的胞饮作用，进行叶绿体移植，或通过微注射、载体转移以及胞饮摄入进行线粒体移植。显微操作仪目前四十八页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙遗传物质转移——基因在细胞水平的转移①

载体法——利用双子叶植物如番茄、甜菜、棉花和大豆等常用载体转移基因的方法，将含有外源基因的根瘤农杆菌与受体原生质体共同培养，或将含有外源基因的质粒和受体原生质体用聚乙二醇（PEG）处理转化，最后由转化体培育成转化植物。②

直接导入法——最常用的是微注射法，即在显微操作仪的帮助下，用微针直接对细胞进行注射，直接将外源基因注入到一个受体的受精卵的核内，然后合子便能发育成胚，并进一步发育成为成熟的个体。目前四十九页\总数一百二十六页\编于二十二点细胞工程的内容包括微生物细胞工程、植物细胞工程和动物细胞工程，目前主要应用微生物细胞工程进行污染生物治理。⊙微生物细胞工程微生物细胞工程应用微生物进行细胞水平的研究和生产，具体内容包括各种微生物细胞的培养（发酵工程）、遗传性状的改造（遗传学、发酵工程、基因工程）、微生物细胞的直接利用或获得细胞代谢产物等。其中微生物细胞原生质体融合技术是构建环境工程菌的基本技术。★微生物细胞原生质体融合技术——首先经培养获得大量菌体细胞，用脱壁酶处理脱壁，制成原生质体。然后将两种不同菌株的原生质体混合在一起，使原生质体彼此接触、融合，再使融合的原生质体在合适的培养基平板上再生出细胞壁，并生长繁殖，形成菌落，最后测定参与融合的性状重组或产量变化情况，以筛选出重组子。目前五十页\总数一百二十六页\编于二十二点微生物细胞原生质体融合的关键步骤：①原生质体制备→

原生质体（Protoplast）：细胞质壁分离后去掉细胞壁所余下那部分结构。原生质体具备原有细胞的全部内部结构与生理性能，但是它完全无细胞壁，失去了细胞的刚性而呈球形，对渗透压十分敏感。原生质体比较容易吸收外来的DNA、蛋白质等，同时，对外界理化因子比较敏感，在原生质体外面仅存原生质膜，在外界理化融合因子的诱导下，不同物种间的原生质体间的质膜相互融合杂交，并在适当的条件下，融合的原生质体再生出细胞壁并恢复原来完整的细胞形态与群落形态，构成具有多种遗传性状的新物种。

脱壁：为了进行细胞融合，必须先除去细胞壁。目前常用的方法是酶解法（主要采用溶菌酶、纤维素酶等）。目前五十一页\总数一百二十六页\编于二十二点②融合重组→

把两亲株的原生质体混合在一起，促进融合，然后将融合液涂布在平板上再生，检出重组子。融合重组示意图细胞壁溶菌酶细胞膜生长细胞原生质体培养融合的原生质体混合融合子原生质体原生质体融合细胞壁再生目前五十二页\总数一百二十六页\编于二十二点诱导原生质体融合的方法——化学诱导法：常用于细胞融合的化学促融剂是聚乙二醇（PEG），方法是：在得到两亲本原生质体后，等量混合两亲本的原生质体，加入适量的PEG和钙离子溶液，保温后，洗去多余的PEG，在选择培养基上筛选出融合子。——电融合法：借助电场的作用，引发细胞融合。③原生质体再生成细胞→

原生质体在等渗的培养基中重建细胞壁，恢复细胞完整形态，并能生长、分裂。④融合重组的测定→

通常采用染色体标记的遗传重组体来检测。目前五十三页\总数一百二十六页\编于二十二点7.3.2应用举例—利用原生质体融合构建环境工程菌芳香族化合物降解菌的构建PseudomonasalcaligenesCO可降解苯甲酸酯和3-氯苯甲酸酯，但不能利用甲苯和1,4-二氯苯甲酸酯PseudomonasputidaR5-3可以降解苯甲酸酯和甲苯，但不能利用3-氯苯甲酸酯和1,4-二氯苯甲酸酯融合子CB1-9可以同时降解上述4种化学污染物假单胞菌目前五十四页\总数一百二十六页\编于二十二点乙二醇降解菌：Pseudomonasmendocina3RE-15甲醇降解菌：Bacilluslentus3RM-2苯甲酸和苯降解菌AcinetobactercalcoaceticusT3的原生质体融合菌株TEM-1可同时降解苯甲酸、苯、甲醇和乙二醇DNADNA融合目前五十五页\总数一百二十六页\编于二十二点纤维素降解菌的构建脱氢双香草醛（DDV）降解菌Fusobacteriumvarium对DDV的降解能力为3-10%脱氢双香草醛降解菌Enterococcusfaecium对DDV的降解能力为3-10%融合细胞FE7菌株DDV降解率高达80%融合目前五十六页\总数一百二十六页\编于二十二点聚乙二醇（PEG）诱导原生质体融合制备细菌杀虫剂玉米螟球形芽孢杆菌BacillussphaericusTS-1：杀：淡色库蚊（双翅目）苏云金芽孢杆菌Bacillus

thuringiensisH4：杀：粘虫、玉米螟利用PEG融合融合菌株杀虫试验杀蚊试验获得6株双杀菌株粘虫制备原生质体目前五十七页\总数一百二十六页\编于二十二点电融合诱导选育利用木糖和纤维二糖生产乙醇的菌株酿酒酵母季也蒙假丝酵母利用融合仪进行电诱导融合融合子利用木糖和纤维二糖生产乙醇制备原生质体目前五十八页\总数一百二十六页\编于二十二点7.4酶工程与环境污染生物治理7.4.1酶工程概述什么是酶工程（EnzymaticEngineering）？利用生物有机体内酶所具有的某些特异催化功能，借助固定化生物反应器等新技术、新装置，高效优质地生产特定产品的技术——是将酶学原理与化工技术相结合而形成的新技术。酶工程的主要内容与任务

主要内容：酶的生产、酶的分离纯化、酶分子修饰、酶固定化、酶反应动力学、酶反应器、酶的应用等。

任务：通过预先设计，经过人工操作控制而获得大量所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其最大的催化功能，即利用酶的特定功能，借助工程学手段为我们提供产品或分解有害物质。目前五十九页\总数一百二十六页\编于二十二点7.4.2酶工程在环境污染生物治理中的应用酶固定化⊙为什么要对酶进行固定化？①酶的稳定性较差，在适当温度、pH值和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活。②酶一般都是在水溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有较高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使成本较高，而且难于连续化生产。目前六十页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙酶固定化技术①固定化酶及其特点→

固定化酶（ImmobilizedEnzyme）：

又称水不溶酶，是通过物理吸附法或化学键合法将水溶性酶和固态的不溶性载体相结合，使酶变成不溶于水但仍保留催化活性的衍生物。

固定化酶的特点：

固定化酶比水溶酶稳定，因为载体能有效地保护酶的天然构型，不易受酸、碱、有机溶剂、蛋白质变性剂、酶抑制剂及蛋白酶等的影响，可以在较长时间内保持酶的活性。

固定化酶适合于连续化、自动化和管道化工艺，还可以回收、再生和重复使用。

固定化酶可以设计成不同的形式，如在处理静态水时把酶制成酶片和酶布，处理动态废水时，可以制成酶柱。目前六十一页\总数一百二十六页\编于二十二点②酶的分离提纯→

菌种选育：根据需要筛选产酶量高并易于培养和分离提取的优良菌株。

发酵培养：按照微生物生长和产酶的最适条件进行培养。

分离提取：根据酶是蛋白质这一特征，可用一系列提纯蛋白质的方法对发酵液进行处理，如盐析（用硫酸铵或氯化钠）、调节pH、等电点沉淀、有机溶剂（乙醇、丙酮、异丙醇等）分级分离等方法提纯。

保存：常用的方法是：保持浓缩的酶溶液；将去除盐分的酶溶液冷冻干燥成酶粉，存放于冰箱；浓缩的酶溶液加入等体积的甘油于-20℃保存。目前六十二页\总数一百二十六页\编于二十二点③酶的固定化方法→

载体结合法：将酶结合在非水溶性的载体上，根据酶与载体的结合方式，可分为共价结合法、物理吸附法、离子结合法和生物特异结合法四种。其中物理吸附法操作最为简便。常用的载体有活性炭、多孔玻珠、高岭土、膨润土、氧化铝、硅胶、纤维素、胶原等。共价结合物理吸附离子结合生物特异性结合目前六十三页\总数一百二十六页\编于二十二点

交联法：利用双功能试剂或多功能试剂的作用，使酶与酶发生交联而进行固定的方法，这种方法可以使酶与带有两个以上的多功能基团试剂分子之间形成共价键，从而使酶固定。交联法不用载体，常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺、六甲撑二异氰酸酯等人工合成物。

包埋法：将酶包裹在凝胶格子中或由半透膜组成的胶囊中。包埋法又可以分为格子型和微胶囊型两种。格子型是将酶包埋在聚丙烯酰胺凝胶、硅胶等网格子中，使酶得以固定。微胶囊型是一种以尼龙、乙基纤维素、硝酸纤维素等薄膜包裹固定酶的技术，使酶存在于类似细胞内，不脱落于囊外。目前六十四页\总数一百二十六页\编于二十二点

逆胶束酶：反应系统中酶以逆胶束的形式被“固定”。所谓“逆胶束”是表面活性剂等两性分子在有机溶剂中自发形成的集聚体。两性分子的亲水性一端连续成逆胶束的极性核，水分子可插入核中；而疏水性一端则进入主体有机溶剂中。酶分子溶于逆胶束中，组成逆胶束酶系统进行酶促反应。

复合法：以上几种方法交叉使用。酶表面活性剂缓冲剂有机溶剂疏水端亲水端目前六十五页\总数一百二十六页\编于二十二点固定化酶④固定化酶反应器→

批量反应器：将固定化酶与需处理废水分批加入反应器中混和反应，废水达到处理要求的标准时，用过滤或离心法分离固定化酶，回收的固定化酶可供反复使用。此法装备简单，但不能进行连续反应，只适于少量废水的处理。常见的是序批式间歇反应器（SeriesBatchReactor，SBR）。

连续反应器：能进行连续进、出废水，效率较高。柱型填充床反应器使用最为普遍。目前六十六页\总数一百二十六页\编于二十二点目前六十七页\总数一百二十六页\编于二十二点细胞固定化⊙固定化细胞（ImmobilizedCells）的特点微生物细胞自身就是一个天然的固定化酶反应器。用制备固定化酶的方法直接将细胞加以固定，即可催化一系列的生化反应。细胞的固定化技术是固定化酶技术的延伸。①优点→

固定化细胞比游离细胞稳定性高；催化效率比离体酶高；比固定化酶操作简便，成本低廉，能完成多步酶反应，通常能保留某些酶促反应所必须的ATP、Mg、NAD等，因此，在参与反应时无需补加这些辅助因子。②缺点→

固定化细胞内含有庞大而复杂的酶系，其中有些酶对于人们所要求的某些催化反应则是不需要的，有时甚至是有害的。目前六十八页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙细胞固定化方法所有的酶固定化方法，如载体结合法、交联法和包埋法，均可直接应用于微生物细胞的固定。另外，由于细胞在结构和功能上有其自身的特殊性，特有的方法有自溶酶法和絮凝吸附法。①自溶酶法→

微生物细胞所具有的酶，从广义上讲是酶的一种固定化形式。只要使细胞自溶酶失活，细胞即可反复使用。②絮凝吸附法→

多聚电解质等絮凝剂有絮凝微生物细胞的作用。这类絮凝剂有聚丙烯酰胺、聚磺化苯乙烯、聚羧酸、聚乙基胺、聚赖氨酸和活性硅胶等。被絮凝的细胞再经冷冻或干燥处理后，可提高酶活性的稳定性和改善细胞壁的机械性能，使得固定化细胞可以反复使用，降低成本。目前六十九页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙固定化细胞制备流程微生物细胞包埋剂（聚乙烯醇PVA）按一定的重量比混合用注射器滴入交联剂（饱和硼酸）中交联取出固定化细胞用自来水冲洗后备用目前七十页\总数一百二十六页\编于二十二点废水处理中采用的常见酶类⊙含酚废水处理中的酶类①过氧化物酶（Peroxidase，POD）→

过氧化物酶是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶。它们能催化很多反应，但都要求有过氧化物，如H2O2的存在来激活。H2O2首先氧化酶，然后酶才氧化底物。

辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase，HRP）：

是酶处理废水领域中应用最多的一种酶。HRP的很多应用都集中在含酚污染物的处理方面，使用HRP处理的污染物包括苯胺、羟基喹啉、致癌芳香族化合物（如联苯胺、奈胺）等。而且，HRP可以与一些难以去除的污染物一起沉淀，去除物形成多聚物而使难处理物质的去除效率增大。目前七十一页\总数一百二十六页\编于二十二点

木质素过氧化物酶（LigninPeroxidase，LiP）也叫木质素酶（Ligninase），是白腐真菌细胞酶系统的一部分。LiP可以处理很多难降解的芳香族化合物和氧化多种多环芳烃、酚类物质。它的作用机理与HRP十分相似。去除酚类的优化条件是：酶的浓度高，pH值大于4.0，一定用量的过氧化氢。

聚酚氧化酶（PolyphenolOxidase）

——酪氨酸酶（Tyrosinase）：也叫酚酶或儿茶酚酶，催化两个连续的反应：(a)单分子酚与氧分子通过氧化还原反应形成邻苯二酚；(b)邻苯二酚脱氢形成苯醌，苯醌非常不稳定，通过非酶催化聚合反应形成不溶于水的产物，这样用简单的过滤即可去除。

——漆酶（Laccase）：由一些真菌产生，通过聚合反应去除有毒酚类。而且，由于它的非选择性，能同时减少多种酚类的含量。目前七十二页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙造纸废水处理中的酶类①过氧化物酶和漆酶→

辣根过氧化物酶和木质素过氧化物酶已应用于造纸废水脱色。它们的固定化形式的处理效果比游离形式好。LiP作用的机理为：通过将苯环单元催化氧化成能自动降解的阳离子基团而降解木质素。漆酶还可通过沉淀作用去除漂白废水中的氯酚和氯化木质素。②分解纤维素的酶→

这类酶主要用于造纸浆和脱墨操作中的污染处理。所使用的酶是由纤维二糖水合酶、纤维素酶和β-葡萄糖酶组成的混合酶系。目前七十三页\总数一百二十六页\编于二十二点据估计全世界每年使用的氰化物为300万t，主要是在化学合成、人造织物、橡胶工业、制药工业、矿石浸取、煤处理、电镀等领域。而且，很多植物、微生物和昆虫也能分泌自己体内的氰化物。因为氰化物是新陈代谢抑制剂，对人类和其它生物有致命的危害。⊙造氰废水处理中的酶类①氰化物酶→

氰化物酶能把氰化物转变为氨和甲酸盐。Alcaligenesdenitnficans（一种革兰氏阴性菌）可产生氰化物酶，该酶有很强的亲和力和稳定性，且能处理浓度低于0.02mg/L的氰化物。氰化物酶的活性既不受废水中常见阳离子（如Fe2+,Zn2+和Ni2+）的影响，也不受诸如醋酸、甲酰胺、乙腈等有机物的影响。最适pH范围是7.8～8.3。②氰化物水合酶→

能水解氰化物成甲酰胺。这类酶可由很多种真菌获得。目前七十四页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙食品加工废水处理中的酶类①蛋白酶→

是一类水解酶，在鱼肉加工工业废水处理中得到了广泛应用。蛋白酶能使废水中的蛋白质水解，得到可回收的溶液或有营养价值的饲料。②淀粉酶→

是一种多糖水解酶，多糖转变为单糖和发酵能同时进行，淀粉酶用于含淀粉废水处理，可使大米加工产生的废水中的有机物转化为酒精。淀粉酶还可减少活性污泥法处理废水的时间。目前七十五页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙微生物脂酶（甘油脂水解酶）脂酶广泛存在于自然界的动植物中，尤其在微生物体内，包括细菌、真菌。在生物技术领域中，人们更多地关注利用微生物作为酶源的脂酶。大量的微生物可以用来生产脂酶，其中以假丝酵母、假单胞菌和根霉为其重要的酶源。脂酶应用于被污染环境的生物修复以及废物处理是一个新兴的领域。脂酶来源处理对象脂酶来源处理对象米曲霉废毛发其它微生物脱水污泥假单胞菌石油污染土壤聚合物废物假单胞菌有毒气体废水米根酶棕榈油厂废物废食用油酵母食品加工厂废水生物膜沉积物目前七十六页\总数一百二十六页\编于二十二点固定化技术处理废水的应用⊙固定化酵母细胞降解酚—利用包埋法进行细胞的固定★海藻酸钠－氯化钙包埋法：用海藻酸钙包埋固定热带假丝酵母菌，在三相流化床反应器中连续处理含酚废水。★处理过程——将培养的细胞浓缩收集，与一定体积的海藻酸钠溶液混合，用注射装置将混合液推出，逐滴滴入100mL氯化钙溶液中，形成一定强度的海藻酸钙凝胶小球（细胞包埋固定在许多直径为4mm的小球中），在氯化钙溶液中浸泡数小时后，用无菌水洗去小球表面多余的钙离子，装入三相流化床反应器中，进行含酚废水的连续性处理试验（如下图所示）。目前七十七页\总数一百二十六页\编于二十二点酵母细胞浓缩液海藻酸钠溶液混合注射装置氯化钙溶液海藻酸钙凝胶小球细胞包埋浸泡洗涤三相流化反应器酚废水产物装柱目前七十八页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙固定化混合菌细胞对印染废水脱色以多孔陶珠作为固定化载体，固定一类具备脱色功能的细菌细胞（脱色混合菌WD－1筛选自印染废水污泥），对印染废水脱色。⊙固定化藻细胞去除氮磷利用氧化塘（含有悬浮藻类）可以去除氮磷，以固定藻代替悬浮藻细胞可解决目前氧化塘中藻体流失问题。将软性填料或人工水草置于氧化塘中，通过天然挂膜将藻细胞固定在填料上，形成的固定藻（藻类生物膜，需20~30d，是一种菌藻互生膜，藻为蓝绿藻）在自然光照条件下，以空气和水中的CO2作碳源，水中的氨氮作氮源进行光合作用并释放出O2，在去除氨氮的同时藻类增殖。过量（或老化）的藻类可作为食藻水生生物的饵料而被去除。由于固定藻的浓度稳定（不会被水带走），从而可以增加流量，缩短停留时间，达到稳定及强化氧化塘工作性能的目标。目前七十九页\总数一百二十六页\编于二十二点废水净化的生物强化技术（Bioaugmentation）—投菌法——向废水处理系统中投加从自然界中筛选的优势种群或通过基因组合技术产生的高效菌种，以去除某一种或某一类有害物质，促进系统内生物处理效率的方法。——生物添加剂或生物强化剂：经过筛选的具有特殊分解能力的菌种。⊙生物添加剂①生产→

★热风干燥方式：将麦麸表面浸以培养基，再将细菌接种于培养基上使其生长，然后加热诱导菌体形成孢子，以此方法制备的产品经干燥贮存。★冷冻干燥技术：冷冻干燥贮存未形成孢子的营养菌株。将具有优良特性的天然菌或变异菌株经热风或冷冻干燥后，添加营养剂、润滑剂、缓冲剂及其它增强剂等混合贮存。目前八十页\总数一百二十六页\编于二十二点②使用方法→

将干燥的生物制剂置于27～38℃的温水中浸渍一段时间（1～12h不等），使其活化后，以浆状添加到处理系统中。生物制剂与温水的比例，以及投入量等均按使用需要而定。如为液态成品生物制剂，则可直接投入处理系统中，毋需活化。⊙生物活液（LivingLiquorMicroorganism，LLMO）

含有经过筛选的天然菌种或人工培殖的变异菌种的生物制剂。产品分菌粉和菌液两种。菌粉中的细菌99.9%处于休眠状态，使用时有一活化过程，故效果稍差。菌液则相反，一经使用，能立即生效。菌液产品中以美国GES公司所生产的生物活液具有一定的知名度。美国GES公司——美国通用环保科技公司（GeneralEnvironmentScience），是最早从事研究应用微生物商业开发的公司，在环保领域开创了新天地，解决了很多实质性水污染问题，核心的利蒙LLMO系列产品正式应市始于1974年，此后不断完善发展，有多种系列产品行销全球。它与安信达环保科技（宁波）有限公司合作生产全系列LLMO，并授权南京美联环保有限公司为中国的总经销。目前八十一页\总数一百二十六页\编于二十二点美国利蒙LLMO微生物水质处理剂目前八十二页\总数一百二十六页\编于二十二点①生物活液的组成→

LLMO生物活液装在塑料罐内，使用和投加极为方便。活液中的细菌总数约为5×107个/mL。内含7种细菌，彼此可以他方的代谢产物为营养。

芽孢杆菌：无论在有氧或无氧情况下，均可分泌胞外酶，繁殖速度快、代谢能力强，能将不溶性脂肪分解为可溶性的短链脂肪酸和丙三醇，以利进一步厌气发酵或好气处理。

假单胞菌：具有较强分解各种有机物的能力并有脱氮作用。

亚硝化单胞菌：在硝化过程中能将NH3转化为亚硝酸盐。

硝化杆菌：在硝化过程中能将亚硝酸盐进一步转化为硝酸盐。

纤维单胞菌：具有分解植物性纤维的能力。

气杆菌：在厌气状况下具有较强的将碳水化合物转化为糖类的能力。

红色假单胞菌：厌光照下生长的一种能产生红色色素的假单胞菌，摇动，菌液呈杜鹃红色，肉眼可见。目前八十三页\总数一百二十六页\编于二十二点上述7种细菌是经筛选分离后，按一定比例混合，在30℃好气条件下培养22hr，添加硫化钠，然后在温度35℃下，再培养一段时间而制成。②生物活液的使用方法→

将生物活液投在进厂的截流干管或进水井内。投加量应根据进水水质（包括水质成分、BOD浓度和悬浮物量等）并经过试验来确定，这样可节约生物活液的用量。也可以细菌计数器监测池内细菌总数来控制LLMO投加量。一般以进水量的1～2mg/L计。目前八十四页\总数一百二十六页\编于二十二点7.5发酵工程与环境污染生物治理7.5.1发酵工程概述发酵的基本概念（Fermentation）⊙发酵的定义①巴斯德（LouisPasteur，1822~1895，法国微生物学家，化学家）：发酵是在厌氧条件下，糖在酵母等生物细胞的作用下进行分解代谢，向菌体提供能量，从而得到产物酒精和CO2的过程。②生物化学家：有机物分解代谢释放能量的过程。③工业微生物家：把利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程统称为发酵。目前八十五页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙发酵的实质发酵是依靠微生物体内或体外的酶，将基质包括有机污染物在内的大分子分解成微生物细胞能吸收的小分子化合物，并参与细胞的合成代谢。发酵提供细胞生命活动所需的能量和各种细胞结构物质，建造新的细胞。⊙发酵的环境意义利用发酵工程的原理与技术，净化处理环境污染物，同时产生有用的产品，可以达到减轻环境污染目的，同时实现废物资源化。

酵母

霉菌

细菌⊙参与发酵的微生物目前八十六页\总数一百二十六页\编于二十二点发酵工程的内容

菌体生产

代谢产物的发酵生产

微生物机能的利用现代发酵工程需要两方面专家的通力合作，即分子生物学家负责分离、鉴定、改造甚至创造可在微生物内高效表达的基因，以应用于工业生产。而生化工程技术人员则要保证改造过的微生物能在最适条件下大量生产，以获得最大的产率。——发酵工业的内容：

主要包括生产菌种的选育，发酵条件的优化与控制，反应器的设计及产物的分离、提取与精制等。目前八十七页\总数一百二十六页\编于二十二点发酵的类型主要包括菌体发酵、酶发酵、代谢产物发酵、转化发酵、生物工程细胞发酵。⊙微生物菌体发酵以获得具有某种用途的菌体为目的：——传统的菌体发酵工业包括用于制作面包的酵母发酵及用于人或动物食品的微生物菌体蛋白（单细胞蛋白）的生产。——新的菌体发酵可用来生产一些药用真菌，如香菇类、冬虫夏草菌、灵芝等。有的微生物菌体还可以用作生物杀虫剂，如苏云金杆菌。⊙微生物酶发酵微生物产酶的品种多，目前工业应用的酶大多来自微生物发酵。微生物酶制剂有着广泛的用途。黑曲霉菌发酵木霉菌发酵目前八十八页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙微生物代谢产物发酵微生物代谢产物的种类很多，已知的有37大类，其中16类属于药物。①初级代谢产物→

在微生物对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长繁殖所必需的。②次级代谢产物→

在菌体生长静止期，某些菌体能合成在生长期中不能合成的、具有一些特定功能的产物，如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，称为次级代谢产物。它们具有较大的经济价值。目前八十九页\总数一百二十六页\编于二十二点⊙微生物转化发酵

利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。

最古老的生物转化——利用菌体将乙醇转化为乙酸的醋酸发酵。

发酵工业上的生物转化——包括：异丙醇转化为丙醇，甘油转化为二羟基基丙酮，葡萄糖转化为葡萄糖酸，进而转化成2-酮基葡萄糖酸或5-酮基葡萄糖酸以及山梨醇转化为L-山梨糖等。

最突出的微生物转化——甾类转化：甾类激素包括醋酸可的松等皮质激素和黄体酮等性激素，是用途很广的一大类药物。⊙生物工程细胞的发酵利用生物工程技术所获得的生物细胞，如DNA-重组的“工程菌”、细胞融合所得到的“杂合细胞”以及动植物细胞、固定化细胞等，进行培养的新型发酵。其发酵产物多种多样，所用的发酵设备是各种类型的新型生物反应器。目前九十页\总数一百二十六页\编于二十二点发酵的方法⊙表面发酵将菌种接种到灭过菌的液体（或固体）培养基上，在一定温度下进行培养。一般地，好氧微生物菌体在液体表面上形成一层微生物膜，在固体培养基上也能形成这种膜，经过一定时间培养后，菌体产生的代谢产物，或扩散到培养基中，或留在微生物细胞内，或两者都有，这要据菌体和产物的特性而定，产物产量达到高峰后，进行提取。该法劳动强度大，占地面积大，产量低，易污染，目前基本不用了。⊙深层发酵深层发酵是微生物细胞在液体深层中进行培养的方法。随供气方式的不同，好氧深层发酵可分为振荡培养和深层通气（搅拌）培养：目前九十一页\总数一百二十六页\编于二十二点①振荡培养→

即所谓的摇瓶振荡培养（摇床），培养微生物所需的氧气是在外界空气与培养液在振荡时进行自然交换提供的。摇瓶法培养酵母②深层通气培养→

强制通入无菌空气到密闭发酵罐中进行（搅拌）培养的方式，微生物所需的氧是外界通入空气中的氧经过溶解后提供的。深层发酵法的优点——具有生产效率高，占地小，可人为控制，广泛应用于抗生素、维生素、有机酸、酶制剂等生产中。目前九十二页\总数一百二十六页\编于二十二点发酵过程发酵生产的具体过程一般为：

菌种（或生物细胞）→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取精制→成品检测→成品包装。目前九十三页\总数一百二十六页\编于二十二点发酵生物反应器按照所使用的生物催化剂，生物反应器可分为酶反应器和细胞反应器两类。发酵罐是一种微生物细胞反应器，是最重要的一种生物反应器。以发酵罐为主体，半个多世纪以来，已形成一整套生化工程设备，其进步表现在以下几个方面：

染菌率极低：现代发酵多为纯种培养。培养基的彻底灭菌、空气的灭菌、设备的严密度和科学管理形成了防止杂菌污染的基础。

发酵设备大型化：发酵罐的体积从几十立方米增加到几百至几千立方米，设备大型化有利于提高经济效益。

利用生物技术优化发酵过程：大幅度提高产量和降低成本

改进后处理工艺和设备：采用先进设备提高产品的回收率和质量。目前九十四页\总数一百二十六页\编于二十二点几种发酵罐目前九十五页\总数一百二十六页\编于二十二点发酵生物反应器的类型：

搅拌式生物反应器——内设搅拌装置。使用最广。

鼓泡柱式反应器——

搅拌主要依赖于引入的空气或其他气体。

气升式反应器——

内设内置或外置的循环管道，由于引入气体的运动，导致反应器内培养液进行混合，并保持循环流动。目前九十六页\总数一百二十六页\编于二十二点排气口培养基气流管进气口排气口气－液分离器培养基下行柱上行柱进气口基底内循环气升式生物反应器外循环气升式生物反应器搅拌电机排气口培养基搅拌叶轮进气口搅拌式生物反应器鼓泡柱式生物反应器排气口培养基进气口目前九十七页\总数一百二十六页\编于二十二点7.5.2发酵工程在环境污染治理中的应用——废物资源化亚硫酸盐纸浆废液乙醇发酵发酵技术在环境保护领域中应用十分广泛，废水生物处理装置实际上可以看作一个大型发酵罐，有机污染物在微生物作用下，转化成CO2和水。固体废物的堆肥，垃圾的填埋以及废物资源化等过程均为发酵过程。亚硫酸盐纸浆废液（俗称红液）中含有较多的木质素盐和相当数量的糖类（亚硫酸盐纸浆废液中可发酵性糖的来源主要是半纤维素）。可用以生产乙醇。目前九十八页\总数一百二十六页\编于二十二点亚硫酸盐纸浆废液通入空气SO2石灰水中和酸沉淀去除CaSO4等澄清液N和P发酵罐絮状酵母澄清罐发酵液酵母回流澄清液蒸馏预处理发酵目前九十九页\总数一百二十六页\编于二十二点废纤维素的资源化⊙纤维素酶解糖化工艺生产葡萄糖