基因工程原理考前突击

名词解释测序酶：是经修饰过的T7噬菌体DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使得T7DNA聚合酶完全失去了3~-5~外切酶活性，只有5~-3~聚合酶活性，而且聚合能力很强，测序时常用此酶。与klenow相比优点是：是双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基系列的核酸水解酶。限制-修饰系统中的限制和修饰作用：限制-修饰系统中的限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA（如噬菌体DNA等），使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞（如宿主）自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用，在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制■修饰系统中的修饰作用。载体（vector）:在基因操作中携带外源基因进入受体细胞的工具。克隆载体：主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。主要有：质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、人工染色体（YAC和BAC）。YAC（酵母人工染色体）：是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。BAC（细菌人工染色体）：是基于大肠杆菌（E.coli）的F质粒构建的高通量低拷贝的质粒载体。表达载体是可携带外源基因进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译的载体。病毒表达载体：是以病毒基因组序列为基础，插入必要的表达元件所构建成的真核基因转移工具。Ti质粒：是在根癌农杆菌中发现的可决定冠瘿病（即可诱发寄主植物产生冠瘿瘤）的质粒。大小在200kb左右。粘粒载体：由人工构建的、大小一般在5~7kb左右、含有入DNA的cos序列和质粒复制子的一类特殊的质粒载体。一元载体：含目的DNA的中间表达载体与改造后的受体（Ti质粒）通过同源重组所产生的一种复合型载体。双元载体：是指由两个分别含有T-DNA和vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。T-DNA:能导入宿主细胞并插入其DNA中发挥作用的Ti质粒部分DNA片段。T-DNA区：即转移DNA，能转移并整合在植物细胞核基因组上的、决定植物形成冠瘿瘤的一段DNA。LTS和RTS对于T-DNA的转移和整合是不可缺少的。噬菌粒：一些载体中有许多结合了质粒和噬菌体两者的元件并且还有M13复制起始点区域，故成为噬菌粒。a-互补：指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的|3-半乳糖苷酶（8-galactosidase，由1024个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。端粒重复序列（TEL）:定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。多克隆位点：含有紧密排列的多个限制性内切酶识别位点的一段DNA片段。荧光原位杂交（FISH）:对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，后用原位杂交方法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体（单个细胞增殖形成的细胞群所产生的抗体）来确定该DNA序列在染色体上的位置。凝胶阻滞试验：又叫DNA迁移率变动试验（EMSA），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。盒式诱变：就是用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代野生型基因中的相应序列。这就好象用各种不同的盒式磁带插入收录机中一样，故而称合成的片段为“盒”，这种诱变方式为盒式诱变。定点诱变(寡核苷酸介导；重叠延伸PCR、大引物PCR):是使已克隆基因或DNA片段中任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失突变的过程。体外随机诱变：指随机的在克隆化DNA中引入碱基置换突变。探针：指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸序列，这些序列在使用之前需标记。转化：把重组质粒DNA导入受体细胞(大肠杆菌、酵母、动植物细胞等)，使其遗传性状改变的过程。转染:把重组的噬菌体或病毒导入受体细胞的过程。相互关系：转化一词严格地说是指，感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；而转染一词，则是专指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。但从本质上讲，两者并没有什么根本的差别。无论转化还是转染，其关键的因素都是用氯化钙处理大肠杆菌细胞，以提高膜的通透性，从而使外源DNA分子能够容易地进入细胞内部。目的基因：指那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段。瞬时转化：DNA在核中保持外源染色体状态，假定他没有在宿主细胞中发挥功能的复制起始位点，那么它只能保留很短的时间就会稀释或者降解。这称为瞬时转化，其结果是转入的基因改变了细胞的性质，但这只能持续较短时间。融合基因：是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸系列的新型基因。报告基因：是指编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是否成功地导入受体细胞(器官或组织)，是否表达的一类特殊用途的基因。报告基因与选择基因的区别：选择基因往往要与外界存在的筛选压力如抗生素等相互作用，以筛选出被转化的细胞；而报告基因是提供一种快速测定外源基因是否成功导入的检测手段，它的应用不依赖于外界选择压力的存在。转基因动物：指用人工的方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞，使外源基因与动物本身的基因整合，并随细胞的分裂而增殖，从而将外源基因稳定地遗传给下一代的工程化动物。反向PCR：用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA，再将酶切后的DNA片段连接成环状分子，其中至少有一个环状分子含有完整的已知片段。根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的DNA片段扩增出来。RT-PCR:以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应，可用于测定基因表达的强度，还可用于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，克隆mRNA的5'和3'末端序列，从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。松弛型质粒：细菌细胞中质粒的数目有很大差异。多的每个细胞里可以达几十乃至几百份拷贝，少的则只有一到几份拷贝。高拷贝数的质粒称为松弛型质粒，有的质粒拷贝数较多，可随时复制，与染色体的复制不相关，称为松弛型质粒。亚克隆：对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，即将已克隆的DNA片段从一载体向另一载体的转移的过程。目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改照等。RACE技术是指(rapidamplificationofcDNAends)cDNA末端快速扩增SMARTTM3‘-RACE的原理是：1、利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。2、然后用一个基因特异引物GSP1(genespecificprimer,GSP)作为上游引物。3、用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universalprimer,UPM)作为下游引物。4、以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3‘末端的DNA片段扩增出来。5’-Oligo(dT)16~30MN-3‘，M=A/G/C;N=A/G/C/TSMARTTM5‘-RACE的原理是：1、利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。2、利用逆转录酶具有末端转移酶的活性，使末端加上寡聚C。3、人工合成的接头引物的3’末端具有寡聚G，与寡聚C配对合成第二链cDNA。4、利用基因特异的引物作为下游引物和用一个含有部分接头序列的通用引物(universalprimer,UPM)作为上游引物扩增基因的5‘末端。简述基因工程的基本过程和四个基本条件？答：1、目的基因克隆；2、载体的准备；3、目的基因和载体的连接；4、重组DNA转化/转染/转导；5、重组体的筛选与鉴定；6、重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发利用。四个基本条件：1、目的基因；2、载体；3、工具酶；4、受体细胞。按适当的顺序，列出将一种mRNA的cDNA克隆到表达载体所用到的酶有哪些？答：1、反转录酶以mRNA为模板复制出单链cDNA；2、DNA聚合酶以单链cDNA为模板合成双链DNA；3、S1核酸酶切割双链DNA形成平末端；4、用限制性内切酶切割载体；5、用DNA连接酶将cDNA插入载体。如何使用Methylase(甲基化酶)对克隆DNA进行保护？此步骤有什么意义？答：在构建基因文库时，可用与接头中限制性内切核酸酶相应的甲基化酶对克隆DNA先进行甲基化修饰，将插入片段上该酶可能的识别序列先行保护起来。然后再插入片段末端加上接头，并经适量RE切割产生粘端分子，再提纯这些分子与去磷酸化的载体连接。意义：用这种方法，不仅保护了插入片段的大小不会改变，又有利于插入片段的回收，因为插入片段中特定限制性内切核酸酶的识别位点被保护起来，重组后可以用特定的限制性内切核酸酶将插入片段回收。如何利用T4DNA聚合酶进行双链DNA的3’末端标记？答：首先利用T4DNA聚合酶的3’一5’外切核酸酶活性在缺乏dNTP的条件下切割dsDNA(双链DNA)，产生5'突出端，然后加入放射性标记的dNTP，利用T4DNA聚合酶的5’-3’合成酶的活性进行填补合成，得到两端的3’端都是带标记的dsDNA。如果被标记的dsDNA中有限制性内切酶的内切位点，则可以得到两段放射性标记的探针。简述影响II型限制性核酸内切酶活性的因素有哪些？答：①DNA样品的纯度：DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，都有可能抑制酶活性。可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，1〃gDNA用10U酶、加大反应总体积、延长反应时间.②DNA样品的甲基化程度：采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。③酶切反应的温度：多数标准反应温度是37°C，如SmaI为25°C或30C，SfiI为50C。反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。④DNA分子结构：某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性DNA时高出多位，可高达20倍。⑤核酸内切酶的缓冲液：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极^H值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星活性”现象。什么是细菌的限制一修饰系统?有什么意义？答：细菌中有作用于同一DNA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且，这两种酶作用于同一DNA的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的本质是通过甲基化酶将DNA中某些碱基进行甲基化修饰，由于宿主自身DNA上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割。由于外来的DNA在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将人侵的外来^入分子降解掉。所以DNA限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。如何以细菌（或者大肠杆菌E.coli）质粒DNA为载体克隆一个编码大鼠生长激素的基因，并转化到细菌（或者大肠杆菌E.coli）中进行表达。分析一下在实验中可能遇到哪些问题及可能的解决办法？答：（一）要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达，通常遇到的问题有：（1）细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。（解决办法：在cDNA前加上细菌的启动子。）（2）大多数真核基因有内含子，这些内含子在转录后从前体mRNA中被切除而形成成熟mRNA。细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。（以激素基因的mRNA为模板反转录成cDNA。）（3）有些真核生物的蛋白质是通过前体分工加工而来的，例如胰岛素就是通过加工去除前体分子内部的33个氨基酸残基而来，剩下的两段肽链分别形成胰岛素的a、b链。（有时可以在离题的条件下进行蛋白质加工过程。）（4）产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。（选用合适的突变型宿主。）（二）针对上述可能出现的问题，建议在克隆的过程中采取以下措施：应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG的细菌强启动子的附近可以以激素的mRNA为模板用反转录酶合成激素的基因。这种DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外，如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因。合成的基因应含起始密码ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列，以及1—2个终止密码：ATG■——编码序列——TGATAG。现在，这个合成基因可被插入载体中。有时加工过程可以在离体条件下进行。如果加工有困难，可以用合成基因，从而免除加工过程。选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解。如果用酵母作为宿主上述许多问题都可以较容易地解决，尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体。以E.coli为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能原件，各有什么生物学功能？（1）启动子：转录是由RNA聚合酶在启动子部位启动RNA转录的过程。与RNA聚合酶识别、结合、启动转录，启动子的强弱是影响表达量的决定因素之一。（2）转录终止子转录启动以后的转录过程并不是永无止境的，会受到模板DNA序列结构的影响，当遇到经环结构时转录便会终止，或遇到p因子介导的终止信号转录也会终止。转录终止子稳定载体系统，防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性。（3）核糖体结合位点转录出来的mRNA可在宿主细胞的翻译机器作用下翻译出目的蛋白。细胞中的核糖体必须在mRNA上找到有效核糖体结合位点以及其中的SD序列，启动蛋白质翻译。简述利用YAC克隆载体构建基因文库的原理。答：当用BamHI切割成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如ARS、着丝粒和位于两端的端粒。当再用EcoRI或SmaI切割抑制基因sup4内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。装载了外源DNA片段的重组子导致sup4插入失活，从而形成红色菌落；而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源DNA片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了YAC文库。BAC克隆载体有哪些显著的优点答：BAC载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，并且还可以减少外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。BAC载体可以通过a-互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆DNA的NotI酶切位点和用于克隆DNA片段体外转录的SP6启动子和T7启动子。BAC与YAC和PAC相似，没有包装限制，因此可接受基因组DNA大小也没有固定的限制。YAC载体具有什么样的功能ftDNA序列？为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。简述入噬菌体载体的克隆原理及一般步骤？原理：载体和外源DNA经酶切后，外源DNA片段插入到载体的适当位置，或置换载体的填充片段。连接形成重组子在体外噬菌体蛋白作用下，包装形成噬菌体颗粒，通过噬菌体颗粒感染大肠杆菌将重组DNA注射到宿主中，经过裂解生长，可增殖重组DNA。步骤：①通过裂解过程增殖载体②回收、分离纯化载体③载体与外源DNA的酶切④外源DNA与载体的连接⑤重组噬菌体的体外包装⑥包装噬菌体颗粒感染宿主⑦筛选。单核苷酸置换插入或缺失中，引物设计的要求？答：（1）与靶DNA的适当链互补，并注意与模板的其他区域不能错误杂交；（2）足够长度碱基与靶序列特异性结合，1—2个碱基改变的引物要求至少25个碱基长度；（3）错配剪辑位于中央位置，使每侧有10—15个碱基与模板链完全匹配。有效引入3个核苷酸突变时，要求引物在诱变点的每侧有30个核苷酸与模板互补；（4）含有与模板完全杂交的5’端区，这样从上游引物起始的DNA合成不至于取代诱变寡核苷酸引物；（5）诱变寡核苷酸引物的3’区域有10—15个碱基与模板完全匹配；（6）无回文、重复或自身互补序列；（7）必要时可在诱变寡核苷酸上加上新的酶切位点。简述琼脂糖凝胶电泳的基本原理。琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的素？答：（一）原理：①DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，^^DNA分子本身的大小和构型。②在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。质粒DNA样品用单一切点的酶切后与已知相对分子质量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知该样品的相对分子质量大小。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的DNA分子。③另外在制备琼脂糖凝胶时加入漠化乙锭指示剂，漠化乙锭在紫外光照射下能发射荧光。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插ADNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍。荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测，只需要5〜lOngDNA，就可以从照片上比较鉴别。如用肉眼观察，可检测到0.01〜0.川g的DNA。（二）影响因素：DNA构象、分子量大小、碱基组成与温度、琼脂糖浓度、嵌入染料EB存在与浓度、电压、电场方向、电泳缓冲液。CsCl-EB梯度离心法分离质粒和染色体DNA的原理？由于EB与线状、闭环DNA分子的结合量不同而致使两者密度不同，通过CsCl密度梯度离心以后，它们就会因为平衡在不同的位置而得以分离。EB扁平分子通过在碱基对之间的嵌入作用而结合在DNA分子链上，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。线性的或开环的DNA分子因其具有游离的末端而易于解旋，故可结合相当大量的EB分子。而像质粒这样的共价闭合环状的DNA分子，由于没有解离的末端，只能发生有限的解旋反应，结果便限制了EB分子的结合数量，因此染色体DNA片段要比质粒cccDNA结合更多的EB分子。在DNA-EB复合物中，结合的EB分子数量越多，其密度也就越低。因此在EB达到饱和浓度的条件下，质粒cccDNA就要比线形的染色体DNA片段具有更高的密度。什么是扣除杂交？其基本原理是什么？概念：将含目标基因的组织或器官的mRNA群体作为待测样本（Tester），将基因表达谱相似或相近但不含目标基因的组织或器官的mRNA群体作为对照样本（Driver），将Tester和Driver的cDNA进行多次杂交，去掉在二者之间都表达的基因，而保留二者之间差异表达的基因。原理：一种细胞的总mRNA反转录制备的cDNA与另一细胞的总mRNA混合形成cDNA-RNA杂交分子通过羟基磷灰石柱被扣除，未杂交的单链cDNA流出柱子外，其对应的低丰度mRNA得以克隆。在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA？为什么要在cDNA前加上细菌的启动子？答：cDNA是mRNA的反转录产物，与基因组DNA相比，没有了启动子和内含子。因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子，所以要使用cDNA。有因为cDNA上没用启动子，所以要加上细菌的启动子，保证其能正确转录。与基因文库相比，cDNA克隆的主要优点与缺点有哪些？答：主要优点:①cDNA克隆以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。②cDNA基因文库的筛选比较简单易行。③每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。④cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，直接应用于基因工程操作。⑤cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。主要缺点：①cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。②cDNA基因文库不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外大量的调控序列的结构与功能方面的信息。③在cDNA基因文库中，对于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，且分离也就比较困难。PCR引物设计时需要注意哪些基本原则？答：①引物长度以20〜30bp为宜，过长过短都会降低特异性，而且过长会增加成本。②引物碱基要随机分布，避免出现嘌吟或嘧啶堆积现象，G+C含量为45〜55%左右。③引物内部不应含有回文结构，两个引物之间尤其是3'端不应有互补链存在。④引物的碱基顺序不应与非扩增区有同源性。⑤引物3'末端碱基原则上要求与模板DNA配对。⑥引物5'末端允许有几个碱基不与模板DNA匹配而呈游离状态，这不影响扩增的特异性。⑦引物的5'端一般加有适当限制性核酸内将一平末端的DNA片段改为黏性末端的方法有哪些？答：1、同聚物加尾法：利用末端转移酶催化dNTP加到ssDNA或dsDNA3’-OH，在外源DNA和载体3’-末端加上互补的同聚物尾巴；2、衔接物连接法：（同上题1）；3、街头分子连接法：将具有平末端的外源DNA片段与人工接头分子在TDNA连接酶的作用下连接起来，然后与4具有相同黏性末端的载体DNA分子在TDNA连接酶作用下连接成重组体。4在重组DNA操作中为了提高连接效率常常将非互补的黏性末端修饰成平末端之后再进行连接。请问将黏性末端变为平端的方法有哪些？答：（1）5’一突出黏性末端的补平，一般选用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段聚合酶进行填补；（2）3’一突出黏性末端的切平，一般选用T4噬菌体DNA聚合酶或单链DNA的SI核酸切平。真核生物表达载体通常需要哪些构件？各构件的作用是什么？1、原核DNA序列：包括能在大肠杆菌中复制的Ori以及便于筛选的细菌抗生素抗性基因和便于目的基因插入的多克隆位点MCS。2、启动子与增强子：启动子分为组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子。增强子对于异源启动子控制下的外源基因也具有增强转录的作用，因此，启动子和增强子的联合使用可大大提高外源基因的转录水平。大多数增强子具有组织特异性，在构建表达载体时使用宿主细胞相应组织部位的增强子以激活外源基因的表达，提高表达效率；3、终止子：不同来源的终止子对外源基因的表达有很大影响，它不仅决定外源基因转录活性也决定mRNA在细胞中的稳定性，从而影响mRNA的翻译。4、内含子剪接信号：虽然许多基因的的cDNA转入哺乳动物细胞后，其表达不受有无内含子的影响，有些基因的表达需要内含子的存在。一般来说，在哺乳动物细胞的表达载体中最好有一段内含子序列包括剪接信号以提供外源基因cDNA表达的需要。5、polyA加尾信号：polyA可防止核酸酶对mRNA3’末端的降解，增加mRNA在细胞中的稳定性。RNA聚合酶II穿过polyA位点，直到成熟mRNA3’端的下游才终止转录。当表达载体缺少polyA位点的序列时，外源基因的表达下降10倍以上。6、选择标记基因：只有采取有效的筛选方法，才能高效准确地将少量的转化子从大量未转化细胞中分离出来。一般情况下，载体上携带的选择基因可供细胞筛选使用。7、报告基因(报告基因既可用于转基因鉴定的方法也可作为转基因筛选的一种手段)大肠杆菌作为外源基因表达系统有哪些优缺点？优势：①遗传背景清楚：全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架；②繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；③基因克隆表达系统成熟完善；④目标基因表达水平高；⑤代谢途径和基因表达调控机制比较清楚缺点：①缺乏对真核生物蛋白质的复性功能；②缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统；③内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；④细胞周质内含有种类繁多的内毒素。简述胸苷激酶基因选择系统的原理。答：TK一细胞把细胞培养在加有胸苷类似物5-漠尿嘧啶脱氧核苷(BUdR)的培养基中，在胸苷激酶(TK)的催化下，BUdR便掺入到细胞的DNA分子上，致使DNA复制出现错误。具有BUdR-DNA的细胞对UV特别敏感，被迅速地杀死，而少数TK一的细胞便能存活下来。简述二氢叶酸还原酶基因选择系统的原理。该系统具备的一个显著特征是什么？答：DHFR催化二氢叶酸(DHF)还原成四氢叶酸(THF)氨基蝶吟(aminopterin)和氨甲蝶吟(methotrexate)可与DHFR紧密结合使之失去活性，从而阻断核苷酸生物合成，最终导致细胞死亡细胞培养物经氨甲蝶吟处理后，绝大多数细胞死亡，但也可筛选到氨甲蝶吟抗性细胞系由于DHFR基因拷贝数的增加，能超量合成DHFR的细胞系，可以提供足够的酶克服抑制剂带来的影响.细胞内扩增DHFR基因时，与该基因邻近的染色体DNA片段同样被扩增。该现象可用以使转化的基因随Dhfr标记基因一起扩增，从而产生高水平的表达。简述Sanger双脱氧链终止法的基本原理。答：在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链。如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP),由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每^NA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。PCR技术主要应用于哪些领域？①核酸基础研究②序列分析③检测基因表达④从cDNA文库中放大特定序列⑤研究已知片段邻近基因或未知DNA片段⑥进化分析⑦医学应用⑧分析生物学证据⑨性别控制⑩转基因检测。什么叫转基因植物？植物转基因技术的基本路线主要包括哪些？利用DNA重组技术，在离体条件下对不同生物的DNA进行加工，并按照人们的意愿和适当的载体重新组合，再将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞中表达的植物。植物转基因技术的基本路线分离目的基因•目的基因与恰当的载体DNA形成重组DNA•重组DNA的扩增•目的基因导入到受体细胞•筛选转化细胞，诱导产生转基因植株•转基因植株的大规模种植1、Cohen等在1973_年构建了第一个有功，能的重组DNA分子。2、世界上第一例转基因动物是1981美国人将大鼠的生长激素基因成功倒入小鼠后获得超级鼠；1983年，由Ti质粒介导的转基因烟草获得成功则标志着转基因植物的诞生；1986年，首批转基因植物抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验。3、质粒的拷贝方式分为严谨型和松散型。严谨型质粒在细胞中拷贝数较少；松散型质粒在拷贝数较多。4、限制性内切酶、连接酶的发现，载体的应用以及大肠杆菌转化体系的建立是基因工程诞生的三大技术基础。5、为了使YAC载体能满足自主复制、保证染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要，构建YAC时必须含有端粒重复序列、着丝粒和自主复制序列。6、聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用来分析小分子量的单链核酸，如RNA，寡核苷酸，DNA序列分析等。其变形条件可用加热方式或使用尿素等变性剂。7、限制性内切酶Hpall和MspI有共同的靶序列CICGC，所以它们是一对同裂酶；而BamlI,BclI，BglI，XhoI则是一组同尾酶，因为它们切割DNA后都可以形成-GATC四个核苷酸组成的粘性末端。8、两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称为质粒不相溶性。出现这种现象的原因主要是它们常常共用同一复制系统。基因工程的两个基本特点是：（1）分子水平上的操作（2）细胞水平上的表达。基因工程中有3种主要类型的载体：质粒DNA；病毒DNA；质粒和病毒DNA杂合体7.完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：（1）能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对；（2）两条互补链的5’3’的序列组成相同，即将一条链旋转180°，则两条链重叠8.II类限制性内切核酸酶一般识别—4〜6个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶。根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有GC倾向，即它们在识别序列中含量较高。9、限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、第三两个字母取自种名的前两个字母，第四个字母则用表示株名。10、在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2秒钟，其目的是混合均匀和防止部分酶切11、第一个分离的限制性内切核酸酶是EcoK；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是EcoRl。12、限制性内切核酸酶BsuRI和Haem的来源不同，但识别的序列都是GGCC，它们属于异源同工酶。13、限制性内切核酸酶通常保存在浓度为50%的甘油溶液中。14、DNA聚合酶I的Klenow大片段是用切割DNA聚合酶I得到的枯草杆菌蛋白酶，分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：（1）5’-3’合成酶的活性；（2）3’-5’外切核酸酶的活性。10、用TaqDNA聚合酶得到的PCR产物不是平末端，而是有一个突出碱基A末端的双链DNA分子，根据这一现象设计提高克隆PCR产物的T-载体。15、反向转录酶除具有以DNA和RNA为模板合成DNA，除了5’-3’合成酶的活性外，还具有4种酶的活性：（1）5’-3'外切核酸酶活性；（2）3’-5’外切核酸酶活性；（3）DNA内切核酸酶的活性；（4）解旋酶的活性RNA连接酶作用时除了需要-SH和Mg2+外，还需要ATP。反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有核酸水解酶H的作用，可以将DNA/RNA杂种双链中的水解掉RNA。酚是蛋白变性剂，用酚抽提细^NA时，具有两方面的作用：（1）使蛋白质变性；（2）由于它能使蛋白质变性，故也能使核小体和核糖体解聚，释放出DNA和RNA，提高DNA的得率用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加入单价的阳离子，如NaCl和NaAc，其目的是中和DNA分子的负电荷，增加DNA分子间的凝聚力。通常可在三种温度下保存DNA：4~5°C、-20°C、-70°C，其中以-70°C最好。在用SDS分离DNA时，要注意SDS的浓度，0.1%和1%的SDS的作用效果是不同的，前者只将RNA分离出来，后者可将DNA与RNA一起分离出来。在DNA分离过程中造成DNA分子断裂的因素很多，主要有⑴核酸酶降解；（2）化学降解；⑶物理剪切在分离DNA时，要戴手套操作，原因是手上常有核酸酶。乙醇沉淀DNA的原理是乙醇使DNA分子脱水。由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，SCDNA的泳动速度最快，OCDNA泳动速度最慢，LDNA居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。就克隆一个基因（DNA片段）来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：复制区：含有复制起点；选择标记：主要是抗性基因；克隆位点：便于外源DNA的插入。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于pMB1，它的四环素抗性基因来自于pSCl01，它的氨苄青霉素抗性基因来自于pSF2124（R质粒）。CDNA技术是进行真核生物基因克隆的一种通用方法，因为它可以用mRNA为模板，通过反转录合成一个双链的、无内含子的基因，因而有利于在原核细胞中进行功能表达。30、基因芯片由于具有微型化、自动化、网络化三个特点而能同时定量或者定性地检测成千上万的基因的信息。31、标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。其中，选择标记基因用于鉴别目的DNA的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来；而筛选标记基因可用于携带了外源DNA片段的重组子挑选出来。32、影响PCR反应的因素较多，其中引物浓度一般为0.1-0.5|jmol/L，若引物浓度过高的话，一是容易一起错配和产生非特异性扩增；二是容易生成引物二聚体。33、基因克隆（Genecloning）的目的是（获得目的基因片段），常用的方法有（功能克隆）、（表型克隆）和（定位克隆）等。基因克隆的本质是（从文库中筛选目标基因），重点是（筛选）。克隆基因的主要目的有四点（1）扩增DNA；（2）获得基因产物；（3）研究基因表达调控；（4）改良生物的遗传性基因克隆中三个基本要点是：克隆基因的类型；受体的选择；载体的选择科学家通过基因工程培育抗虫棉时，需要从苏云金芽抱杆菌中提取出抗虫基因，“放入”棉的细胞中与棉的DNA结合起来并发挥作用。那么，从苏云金芽抱杆菌中切割抗虫基因所用的工具是限制性内切酶，此工具主要存在于细菌中，其特点是水解“入侵”的外源DNA保护自身DNA。38、构建基因文库（Genelibrary）时，应根据所要分离的外源基因的大小选择合适的载体，这些载体通常包含有入噬菌体、YAC以及BAC、质粒（plasmid）和粘粒（cosmid）等。根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。扣减文库是cDNA文库。10、在构建cDNA克隆之前，可以用差示杂交来富集一特殊的核苷酸序列等。做法是：用来自能够产生目的蛋白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞不产生这种蛋白质但亲缘关系密切的过量mRNA分子杂交。第一个作为重组DNA载体的质粒是（C）A.pBR322B.ColElC.pSCl01D.pU