内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中重组表达载体的构建四川

内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中重组表达载体的构建生物科学2003级廖俊华指导教师陈惠教授摘要：以生物化学与分子生物学实验室克隆并测序的枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因（Genbank登录号：DQ782954）为模板，通过PCR将编码信号肽的序列去除，然后与pMD18-TVector克隆载体连接，构建pMD18-TVector亚克隆载体。对pMD18-TVector质粒先进行BglⅡ单酶切，回收后再进行SphⅠ单酶切，通过两次单酶切胶回收内切葡聚糖酶基因（不含信号肽），并构建巨大芽孢杆菌重组表达载体pHEC-End，将重组表达载体转化到大肠杆菌DH5α中。通过对转化子进行菌落PCR和质粒的酶切检测证明成功构建了内切葡聚糖酶的巨大芽孢杆菌表达载体。关键词：巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，内切葡聚糖酶，重组表达载体ConstructionofeukaryoticExpressionVectorofthegeneofendoglucanaseinBacillusMegateriumLIAOJun-huaBiologicalScience,Grade2003DirectedbyChenHui(Prof)Abstract:BythewayofPCR,thesequencecomingfromendoglucanasegene(GenbankNo.DQ782954)inB.subtilisC-36strainandcodingforthesignalpeptideofendoglucanasewasremoved.TheendoglucanasegenewasclonedandsequencedintheLaboratoryofBiochemistryandMolecularBiology.ThenthegenewithoutthesignalpeptidesequencewasligatedwiththecloneplasmidpMD18-T.ThepMD18-TVectorwasconstructed.First,thepasmidwascutedbyBglⅡ.Then,thepasmidwascutedbySphⅠ.Bydoubleenzyme-cut,thegeneofendoglucanaseinB.subtilisC-36strainwithoutsignalpeptidewasrecived.TheeukaryoticexpressionvectorpHEC-Endwasconstructed.Eventually,theeukaryoticexpressionvectorwastransformedintocompetentE.coliDH5α.BythewayofcolonyPCRandrestrictionenzymedigestinganalysis,theeukaryoticexpressionvectorofthegeneofendoglucanaseinBacillusMegateriumwasconstructedsuccesfully.Keywords:BacillusMegaterium，Bacillussubtilis，endoglucanase，eukaryoticexpressionvector纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖、葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三大类[1]。纤维素被它降解后可转化为人类急需的能源、食物、化工原料，对于人类社会解决食物短缺和能源危机具有重大的现实意义[2]。随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值[3]。纤维素酶成本高以及酶活力低已成为制约纤维素酶广泛应用的两大瓶颈，因此，构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。几乎所有已克隆到的纤维素酶基因都在大肠杆菌中得到了表达，但是都几乎存在着表达量低、分离提纯困难的缺陷。而芽孢杆菌因具有独特的蛋白分泌系统，使得在表达外源蛋白的宿主菌中深受青睐。其中枯草芽孢杆菌是应用较广泛的一种外源蛋白表达系统，并且已用于商业化生产酶制剂，例如，Genecor厂家就以该菌作为生产碱性蛋白酶的工程菌[4]。近年来，巨大芽孢杆菌也在这方面显示出了较好的应用前景，与枯草芽孢杆菌相比，巨大芽孢杆菌还具有两大优点：首先是它不具有碱性蛋白酶，从而使外源蛋白能很好的表达而不被降解；再次是重组质粒能够在宿主菌中稳定存在[5]。有很多蛋白已经成功地在巨大芽孢杆菌中得到过量表达，如：Rygus和Hillen[6]（1991）在巨大芽孢杆菌中成功地表达了四种外源蛋白基因，在木糖操作子的调控下，这些基因的表达提高130到350倍不等，且未发现蛋白酶水解情况。目前还未见有关在巨大芽孢杆菌中表达内切葡聚糖酶的报道，四川农业大学生物化学实验室通过自行筛选得到一株产内切葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌并克隆到了编码该酶的基因（GenbankNo.DQ782954），拟在此基础上构建该基因的巨大芽孢杆菌表达载体，实现该基因在巨大芽孢杆菌中的分泌表达。本实验将不含信号肽枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因与巨大芽孢杆菌表达载体pHIS1525进行连接，构建重组表达载体，使之能在表达载体自身信号肽的引导下进行融合表达，为进一步研究枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的高效表达及基因工程菌投入生产奠定基础。1材料与方法1.1菌株及载体：本工作所使用的菌株和质粒见表1。贺表1实验险所用的菌株虑及质粒邻Tab糕垮1解叙Thes扮train仔and叮plasm北idus狂edin组the个exper楼iment插strai寄n/pla灾smid萍Chara鸡cteri环stics俘sourc沫e竟JM109卷recA1熟supE打44en轮dA1h西sdR17包gyrA渗96re座lA1t路hi预△戴(lac-斩proAB扔)F'昆Store逝din创this柱lab厕DH5α纸supE4脱4谣△产lacU1说69(φ8秀0lacZ蝇△避M15)袍recA1班Store浇din捕this乓lab竿pMD1景8-TV帝ector吃Ampr慢lacZ兔TaKaR恢aBio己techn砍ology衬pHIS1演525辫Tetr工Ampr爆xylR叶PxylA良MoBiT腥ec着B3pl眠asmid吗pMD18港-TVe赔ctor蜓inclu稀ding策thee亭ndogl旋ucana软sege橡ne森Const晒ructe洪din夏this拉lab曾1.2握分子生物学改试剂吴：碎引物由上海陆英俊生物技言术蹄合成；束Bgl=2\*ROMAN弟II职、引Sph=1\*ROMAN科I西、重组Ta哲qDNA绑Poly午meras典e、dNT吓P、T4鸭DNAL用igase事、展pMD18侮-TVe荷ctor购紧自TaKa隐RaBi取otech绸nolog葡y；质粒提肿取试剂盒、此凝胶回收试摊剂盒、筹DNAM板arker轰=3\*ROMAN葵III炒、DNA齿Marke确r=7\*ROMAN铺VII闪、λDNA见/Hind曲=3\*ROMAN拖III销购自天为时书代；肃氨苄青霉素无购自上海生同工。辽1.3兰主要药品梅NaCl、映胰蛋白胨、舒酵母浸出粉报、琼脂粉、砍琼脂糖、容0.1mo萍l/L乳CaCl六2朋、件甘油肺（贪终浓度为3阅0%斥）。蹦1部.4级主要仪器巾：虹电热恒温培馅养箱、HZ药Q-F全温方振荡培养箱确、酸碱pH窃计、TGL市-16G台茫式普通离心跑机、板式电狐泳槽、电热约恒温水浴锅援、PCR仪抖、凝胶成像图仪等。锤1.5多戴培养基燕、鞠抗生素走贮存液崖及梯琼脂糖电泳耻缓冲液朋：数LB培养基绍：婆1%胰蛋白毫胨，1%弄NaCl，疲0.5%酵较母浸出粉，勉pH7.0沙（用1mo啄l/L的N样aOH调P镰H值）项；配制固体拐培养基时需愈加入1.5章%歇-家2.0%的丙琼脂粉；配糊制抗生素培恨养基时需加稍入氨苄青霉碎素（终浓度湖为100μ车g/mL）点。循氨苄青霉素寸（Amp）快贮存液核[摩7咏]盗：100μ腰g/mL（分溶于双蒸水命中），过滤井除菌，小份悟分装（1m糟L/份）后社，-20℃蠢保存。敞琼脂糖电泳滤缓冲液屿[8]厘：佩①朱5×TBE锡贮存液：5刊4gTr哑is碱，2烤7.5g硼轻酸，20m嫌L0.5板mol/L径EDTA呢（pH8.挨0），溶于剪1L去离子症水，用时稀歉释10倍。小②跨0.5mo泼l/LE涌DTA（p握H8.0）剑：将186壤.1g二水扣乙二胺四乙候酸（EDT狼A-Na.匙2H艰2裕O）加入8果00mL水填中，用磁力工搅拌器剧烈电搅拌，用N展aOH调节觉pH至8.慕0，定容至织1L。叼③诊0.7%的你琼脂糖凝胶时：称取0.莫7g琼脂糖冒于100教mL0.亩5×TBE翁中，用微波做炉加热置溶私液澄清为止估，然后加入修5μL的G断oldV塘iew核酸最染料，混匀澡即可用。童1.6流肢方法寸.伟千另引物的设计娃：晃根据已经克造隆并测序的轻内切葡聚糖走酶基因柿（退Genba杠nk登录蛮号：DQ7产82954舞）去，结合信号兴肽预测结果含，应用Pr亭imer势premi今er5.0应软件设计一漫对引物，使钞其通过PC创R去掉该基交因自身信号户肽编码序列请，冬同时加入适烫当的酶切位喘点（剖Bgl=2\*ROMAN息II玉、宴Sph=1\*ROMAN滴I烤）块，贤使其能够通适过连接将该兴基因置于表毯达载体信号辛肽编码序列倡之后睡（倘表达载体随pHIS1舰525的多仅克隆位点序候列遵如图1）率，栽且保证正确芦的阅读框棋。佩已经预测的按枯草芽孢杆哀菌C-36健内切葡聚糖售酶蛋白序列瓜信号肽切割跑位点在29冻位和30位便氨基酸残基且之间，成熟肃蛋白为47骗0桃氨基酸多肽链，因此潜设计职引物如下：爬上游引物（亲P1）：5纷’熔AGATC箩T贼C偿A梨GCAGA胖GACAA雷AAACG废CCAGT知3’内下游引物（兄P2）：5器’楼GCATG绿C士CTAAT域TTGGT贫TCTGT挥TCCCC耻AA栽3’筐下划线是引药入的酶切位六点，分别是狼Bgl赵Ⅱ卖、斥Sph备Ⅰ豆；A是为了品不改变阅读亡框而引入的恭碱基。坡图1珠pHIS1参525的多倾克隆位点序裁列淡Fig1匙找Sequ董ence伪ofth椅emul串t秤iple祖cloni误ngsi跟tes(M苗CS)of唇pHIS袋1525竿沉岩目的基因的忘获得般：雷顾.1湿批B3质粒的咬提取及其P极CR律接种一环B谣3菌株于1英0mLL瘦B液体培养其基中，37泥℃200r炮/min培羡养过夜，用努质粒提取试貌剂盒按严操作艳说明提取B貌3质粒铅[瞧9雷]轻。以提取的互B3质粒为伍模板根据设寄计合成的引贪物进行PC虫R帮[帮10吼]塔，通过PC娘R获得目的搭基因，其反召应体系如拌表2微：族表2PC弹R反应体系剂Table必响2促Compo投sitio涌nof川PCR客合试剂名称辟庭用量元铺ddH画2尼O须32.5反µ饮L溉10携×亦PCRb除uffer壮普5.0怠µ女L捷25mmo序l/LM椒gCl赤2莫家2.0轰µ朴L闯P1转1.0击µ周L骂舅拒P2擦1.0御µ柳L翁dNTP挽mixtu斯re研6.0冠µ敌L纯模板DNA眨般2.0困µ高L鸡Taq纹聚合酶篮瓦素0.5习µ辆L绩能T鱼otal声volum催e宝50.0乒µ巷L爹按上述顺序资加入各组分原后混合均匀头，PCR反拢应参数为：毒94佛℃预变性2两min，闷94℃变性马1min，黎65℃退火疲1min，匹72℃延伸谨90s，3罢0个循环后便，72℃再败延伸10m历in，4℃私保存。反应红结束后取3炮µLPCR盯产物晌进行0.7希%琼脂糖凝惹胶电泳检测迷。和邮.2侧帆PCR产物弓的纯化桶由于克隆需刮要的DNA距片段需要较摄高的纯度，滤PCR产物顷需经过琼脂毅糖凝胶电泳群充分分离后左，利用普通寿琼脂糖凝胶三DNA回收速试剂盒从凝悬胶中回收目宾的DNA片茶段手[洪11信]待。靠裙吨目的基因的走克隆好:检环.1即大肠杆菌J汤M109（覆或DH5α版）感受态细头胞覆的制备颤：葵参照《分子键克隆试验指为南》（第三饺版），采用称氯化钙法制靠备大肠杆菌娱感受态细胞弱，具体方法远如下：敬挑取一环阔E.col捎i烫JM109兵（或DH5竹α）菌株在分LB平板上绢划线37℃朝培养后，劲挑斯取单菌落转断到10mL园LB液体列培养基中，泽37℃20购0r/mi引n培养过夜两；蚁将上述培养喷液按2%接昆种量接种到薄50mL扩LB液体培宅养基中37网℃200r罚/min振餐荡培养2淘-瞧3小时；条将培养后的麦菌液置冰浴慨中10mi抢n后转移到参无菌的50济mL离心管喇中，4℃4顾000r/棕min离心久10min庭，去掉上清简液，将管倒郊置1min妄使痕量培养笼液流尽；色向管中加入福20mL无惕菌的预冷的假0.1mo栽l/LCa纺Cl泊2仿溶液重新悬喘浮菌体，4拼℃4000痕r/min割离心10痕min，去纪掉上清液；任向管中加入应2mL无菌党的预冷的0础.1mol社/LCaC撒l躲2血溶液重新悬沟浮菌体；轮刚做的感受倦态细胞可直厌接用于转化昏试验，也可戴将剩余的感嗓受态细胞加况入终浓度为页30%的甘前油分装于盈1.5mL助离心管（互100篮µL/管）鉴置-70男℃保存准。搂险.2桑连接与转化宣佳.2.1胞连接：视（连接体系罩[但12喇]拢如叫表3）骨表3买目的基因与捐p舞MD娱18-T笑Vecto穿r克隆载体角的连接体系索Table仆祸3Th血elig协ation鲁syst逝erm扶倒试剂名称梳梦丧用量偷摄胶回收PC中R产物妈5燃µ时L锋pMD18拍-TVe屑ct潜or冬1秒µ版L冈随Liga业tion驰Mix武粉4砖µ州L票滥T念otal颈volum遮e朴10胡µ庆L别煌将该反应管许置PCR仪支16℃保温眨3h。裙那.2.2猴转化：气（转化方法倘[柴13坐]切如下所述）巴取装有10纤0容µL础E告.已coli睡JM109阁感受态细胞垒的1.5m翼L离心管一繁支，置冰浴割中解冻；系将苦上述铃连接好的连录接液全部加摄入到上述离搂心管中，并匠用加样器轻膜轻混合均匀傅；花将离心管放塌置冰浴中静逼置30mi违n；缓30mi热n后将离心赚管放置能42℃条恒温水浴中述静置2mi牺n；修迅速将离心岭管置冰浴中猎静置5mi馅n；汁向离心管中叮加入890在µLLB番液体培养基鹅置37℃培爆养箱培养9逼0min，率使细菌复苏穷并表达质粒钳编码的抗生返素抗性标记株基因；果取培养后的叫菌液200被µL用玻棒耻涂布在含有清100µg洗/mL氨苄境青霉素的L苹B平板上，列将平板置3妈7℃直至液脏体被吸收后顽将平板倒置楼继续培养1折2借-塔16h后禽可出现菌落厌。宅座.3泰阳性克隆菌叨株的筛选及坡鉴定衔将涂布在抗场性平板上长脉出的菌落悉，晕挑取大小适灵中的单菌落乳进行菌落P医CR鉴定，穴反应体系如把表2。宜按旧表2所述角体系先加入溜各组分液体幅后混匀，衣再饿分装在0.复2mLPC恢R管中，每颤管装25µ铺L，最后用轻牙签挑取适鸽量的单菌落抬作为模板，戒PCR反应壤参数为隐同械竭.1所述，挖有一点不同识就是痒：94仿℃预变性碰需狼5min靠。休反应结束后填取3此µLPCR更产物炸进行0.7令%琼脂糖凝比胶电泳检测赞，能够扩增批出与目的基缸因大小一致夏的DNA片责段初步认为筒是阳性克隆核菌株。顾阳性克隆菌猛株的鉴定乓[邀14均]粉：将初步筛梯选得到的阳活性菌株分别沉接种10m艳LLB液体吼培养基37愁℃这200r/较min培养盈过夜，用质扛粒提取试剂涝盒提取质粒兽进行酶切鉴画定，曾酶切体系如蝇表4和表5树。奋表4单酶渐切晒奥咬享树驳副枣丙规表5双酶叫切感Table覆潜4洒Singl剑eEnz瞎yme-c哨utme编thod撞觉融洒遇绣Table奇排5Do炼uble腹Enzym舌e-cut晚meth丙od联试剂名称勒用量赛试剂名称缠用量击10栏×嫩Hbuf群fer痰1.0丹俗µ凤L慈10瑞×旦Hbuf持fer构1.0樱宝µ热L茫质粒DNA萍4.0材终µ命L开质粒DNA申4.0蒜他µ市L比Bgl世Ⅱ客/饶Sph专Ⅰ安0.5眉µ推L住Bgl萄Ⅱ倚、位Sph权Ⅰ寄各0.5泼µ掠L钟缠ddH塌2何O俊4.5维µ抵L享ddH跑2暂O坝4.0略µ私L麦T知otal窝volu辞me洲10.0畏µ劈L会T乏otal和volum非e沙10.0肿µ欧L要将上述反应悼体系置37喝℃恒温培养处箱酶切过夜棚，反应完后没向各体系中榴加1肢µL映10×lo某ading披buff牲er糟,研将其全部点骡样到0.7惩%的琼脂糖消凝胶中进行击电泳检测。遇将酶切鉴定妇符合要求的句菌株随机取毯一个（命名震为KMQZ闸3）送Ta含KaRa宝饼生物公司测慌序。沟邀项表达载体的勤扩增抽由于购买的残表达载体是露以纯质粒的界形式提供，困需要将其转睬入大肠杆菌逝内进行扩增矩。故先进行简表达载体的论常规转化，杨再从大肠杆思菌中提取质寇粒进行后续胶试验操作。厉将购买的表液达载体pH叶IS152葡5（10担µg没）用适量的封水（约20成µL哨）溶解后，愚取1µL转溉化大肠杆菌圆DH5α感景受态细胞（苍感受态细胞耐的制备与转功化夫方法葬与街E.col绪i否JM10软9相同），买在含有10眠0µg/m爷L氨苄青霉猪素的LB培既养基上筛选鞋阳性转化子贼，并通过提种取质粒和酶田切进行鉴定亦，将阳性转砌化子命名为租DH5α-股pHIS寸1525售。约跑赠重组表达载围体的构建侍1.6腹.5笼.1内切研葡聚糖酶基授因（已经去烂掉信号肽编团码序列）的列准备距挑取一环夜E.col潜i虾JM109笋（含目的基唤因）在含氨凑苄青霉素的怖LB平板上矛划线培养过优夜，然后挑裹取单菌落接也种10mL吨含相应抗生蔽素的LB液使体培养基，势37℃剧烈乌振荡培养1届2马-验14h后，呀按质粒提取爆试剂盒说明柏进行质粒的矛提取，提取组完后进行琼境脂糖凝胶电形泳检测提取妹质量和大致品浓度。先将胳质粒进行必Bgl=2\*ROMAN假II芝单酶切且，后泉进行撒Sph=1\*ROMAN遥I柜单酶窃切端，弊两者筹酶切体系与埋方法一致。王酶切完后向棚两管中加入镰5.5冻µL相10×lo疮ading忽buff沸er，最后佣将两次单酶狮切的质粒D皆NA进行琼腹脂糖凝胶电违泳，然后从事凝胶中回收鹊所需要的目筒的条带，其延方法与PC恢R产物的琼浩脂糖凝胶回译收相同，并基取5衣µL第电泳检测其勺回收的大致阀浓度。葵1.年6确.5或.2表达税载体的准备前挑取一环大流肠杆菌DH横5α（含表嗽达载体质粒灾）在含氨苄网青霉素的L义B平板上划骗线培养过夜授，然后挑取誉单菌落接种纪10mL含沈相应抗生素俘的LB液体疫培养基，3铅7℃剧烈振扒荡培养12瓶-府14h后，裙按质粒提取谷试剂盒操作纤进行质粒的籍提取，提取芦完后进行琼凝脂糖凝胶电吉泳检测提取舒质量和大致炒浓度。将提寻取的质粒进竿行掘Bgl拜Ⅱ搅和举Sph致Ⅰ位双酶切标。锦同样，为了读保证酶切后这回收的DN怖A浓度，需肚做3管该反肝应体系。将杆上述反应体杰系置驼37沟℃恒温培养书箱酶切过夜吸，酶切完后醋向管中加入诉5.5啊µL梢10×lo功ading怨buff聪er混合均暂匀，取5尼µL进行电湖泳检测酶切根情况，将其捐余反应液班进行琼脂糖灶凝胶电泳，寺然后从凝胶暮中回收所需时要的目的条疼带，其方法热与PCR产绞物的琼脂糖调凝胶回收相给同，并取5岭µL听电泳检测其白回收的大致撇浓度。蔑1.6.纪5证.3融虏连接及转化村将已经准备讯好的内切葡胡聚糖酶基因全与表达载体步按淘表6隆加入进行连喝接反应：土表6连接巧体系吧Table乐添6疏The答liga马tion辞syste载m绪表达载体偷/掘µL惩目的基婆因/式µL凡T4伶随DNA季羊ligas邮e维/寨µL降连接buf座fer肚/宿µL旷超纯水蹄/裤µL炭总体系呜/录µL牢3违5照2单3微2锁15茧将上述两个暑连接体系置惕PCR仪中考16℃连接伸过夜，转化握时分别取1缘0µL连接返液分别转化猪大肠杆菌D军H5α感受既态细胞并涂评布在含有1魂00µg/省mL氨苄青损霉素的LB尤平板上，待防菌落长出后炼，进行菌落吩PCR、酶衣切鉴定瓶[下15,16校]栽。夕2结果与棍分析夸2.1滨泡目的基因的框获得丰以提取的B距3质粒为模走板根据设计绳合成的引物染进行PCR孤，获得的P潜CR产物为崭不含目的基竿因信号肽序耻列的片断，乔其大小约为截1.5Kb倡，对获得的悉PCR产物假取3µL进秀行电泳，结棍果见图短2。集结果表明P盐CR产物大腔小与目的基捆因大小（1轿500bp接）接近款。酱然后对产物识进行胶回收动，以去掉P课CR体系中合的引物、模蒙板DNA、孩酶等杂质，雅使其纯度满集足随后连接过要求，回收游后取5µL潮进行电泳，壤结果见垦图忧2萍。诵图2PC库R扩增产物狂结果及产物司胶回收租Fig2笛骆Ther阿esult振sof勒PCRa但ndge拉lrec朱laim详2.2筝筐目的基因的样克隆楚将胶回收后洒的目的基因适与克隆载体镜pMD18泛-TVe黄ctor进斜行连接后转挂化盼E考.异coli页JM109倡感受态细胞轧，长出菌落喜后挑取大小浇均一的菌落剧进行菌落P础CR检测阳痛性转化子，泻菌落PCR评结果呼如阔图嫁3所示。原醋图3忍E.col推i炕JM109穴转化子的菌赖落PCR检宋测蕉Fig3称缸赏Ident骂ifica踏tion带ofre楚combi筝nant相E.col兽i榜JM10糖9by各colon龄yPCR泉从电泳结果贩可以看出，仆在挑取的9渔个转化子中概，有8个转伏化子通过其窃菌落PCR短后得到与目着的基因的大检小相一致的刺产物，只有困9号转化子仇未得到PC爽R产物，说复明它是一个茂假阳性。根歼据以上菌落献PCR结果射，在2–8尸号转化子中爬随机挑取一疗个单菌落（先命为KMQ挣Z3）接种级10mL堡LB液体培把养基（含1繁00µg/忙mL氨苄青得霉素）37扁℃剧烈振荡寸培养12修-诊16h后按学质粒提取试笑剂盒操作提有取质粒，分扬别取3µL禾和5µL进因行单双酶切毕鉴定，结果轿如图图兆4。提够抹税镇指弓图4待E.col注i剧JM109捞转化子的酶香切检测指Fig4爬Iden壁tific缓ation宾of听E.col我i笼JM10寺9rec喘ombin毁antb花yres叛trict扬iona坝nalys叹is纱电泳结果表芽明：通过双鸟酶切后可以蔬得到与目的偿基因大小一泉致的条带，公但转化子质周粒渔Sph皆Ⅰ单酶切后回发现了两条患条带，和该字质粒的双酶惠切结果一致呆，经过分析歼发现其原因蓝是：PCR脊产物与克隆留载体pMD衬18-T烈Vecto消r在连接时堵没有按目的慌基因的正向愧顺序进行连和接，刚好相协反，目的基工因反向连接骆在了克隆载狮体上，但这冠不影响本试剩验的后续试忆验，酶切结辣果表明目的葬基因已经连雁接到了克隆炉载体pMD柿18-T醉Vecto正r上。排2.笨3本表达载体辛的扩增向购买的表达鸭载体是以冻责干的质粒形驻式提供，按不操作手册说棕明需要将其若转入大肠杆兆菌内进行常腔规的扩增后沸再提取质粒愁进行重组操桥作，故先进丝行表达载体连的常规转化货。犁将购买的表另达载体质粒闻pHIS1李525（约暴10µg）自用适量的水扒（约20µ乘L）溶解后贼，取1µL订转化大肠杆悉菌DH5α浑感受态细胞拢（感受态细捷胞的制备与辣转化与非E炕.扔coli丰JM109唤相同），涂学布在含有1灵00µg/拌mL氨苄青灵霉素的LB附培养基上，妈待长出转化耳子后（约2霸4h），挑哈取大小均一题的单菌落接歌种10mL顷LB液体纺培养基，码37℃故剧烈振荡培旋养12傻-浙16h后按胸质粒提取试瞒剂盒操作提危取质粒，再替分别取3µ北L和5µL宽进行未酶切奋和单酶切的渠鉴定，电泳鞭结果见图冠5。咏图5将表达质粒p理HIS15显25瞧的酶切检测栽Fig5到Rest葬ricti茎onan今alysi项sof雄thep衫lasmi后dpHI母S1525前电泳结果表身明，未经酶超切的pHI村S1525币质粒其分子孩量比实际分事子量（约7臣.4Kb）姓大，但单酶株切后分子量连符合实际大联小，其可能术原因是质粒呀在复制过程稼中形成敲了鉴质粒多聚体斩，单酶切后禁未发现非特臭异性切割，斯说明该质粒五是pHIS煮1525质赔粒。同时将恒该转化子命男为DH5α给-pHIS腐1525。阔2.偏4继重组表达册载体的构建嫩2.弃4擦.1霞内切葡聚变糖酶基因（苏已经去掉信保号肽编码序低列）的准备泡通过转化子猜的菌落PC避R和酶切检锈测后，发现派目的基因（霞已经去掉信车号肽编码序煌列）反向连间接在pMD细18-T鸦Vecto凉r克隆载体蝶上，为保证悲随后的酶切央和表达载体摄的正确连接馅，提取转化驻子质粒后先氧进行疫Bgl至Ⅱ单酶切，熊回收后再进绣行保Sph胜Ⅰ单酶切，贝这样通过两妙次单酶切后约保证了目的亿基因两端分套别是由封Bgl弊Ⅱ、设Sph乎Ⅰ酶切后产肝生的粘性末物端，通过两客次单酶切后柄用胶回收试李剂盒回收目呀的条带，取么5µL电泳涂检测其大致尺浓度，结果票见图稿6。念图6胶回病收的目的基队因与卧表达质粒p衰HIS15爱25夸虾闷菌悉蛛Fig准6Re适claim怨edta皮rget丰gene砖andp经lasmi吨dpHI球S1525棒尼2.纱4巾.2荣表达载体眉的准备撞含表达载体廊质粒pHI混S1525呼的大肠杆菌钳DH5α在卵含氨苄青霉其素的LB平文板上划线培舅养过夜，然史后挑取单菌选落接种10疑mL含相指应抗生素的牢LB液体培号养基，37痕℃剧烈振荡非培养12恒-贫14h后，众按质粒提取沸试剂盒操作丈进行质粒p弄HIS15崇25的提取奶，并对质粒际进行皆Bgl斥Ⅱ、侦Sph含Ⅰ双酶切，愁电泳后切取怨目的条带进派行胶回收，聪并取5µL饼电泳检测其盛大致浓度，皇结果见图坦6名。垂2.钻4三.3莲转化子的丙筛选及检测衡用T4D狐NA连接酶燕连接胶回收诵的目的基因字（即去掉信枯号肽编码序型列的内且葡率聚糖酶基因扔）与表达质艳粒pHIS砌1525，扔将连接体系荐置PCR仪鸡中16℃连激接过夜，取鲜10µL连贫接液转化大辱肠杆菌DH枕5α感受态心细胞并涂布盼在含有10颜0µg/m寇L氨苄青霉梅素的LB平访板上，待菌绿落长出后，拍挑取菌落大斧小均一的单喝菌落进行菌王落PCR，唤结果见图盾7。壳菌落PC倚R结果表明越，转化子3潮、5、6、准7均能得到欲与目的基因邪大小相一致致的条带。根甚据电泳结果奇随机挑取其屈中的一个单图菌落培养后糕提质粒进行扭酶切检测，狼结果见图降8。匪鸽台狗图7睡E.col栋i秧DH5弟α车转化子菌落雷PCR宁藏锁图8凝转化子质粒默酶切结果昆Fig7辫呢Recom鸽binan瓶t损E.co酬li骡DH5α书colon醋yPCR升仁Fig8竹会Restr柿ictio瞧nana野lysis卧ofr退ecomb私inant渠结果表明，不质粒经过单熄酶切后没有逆出现非特异载性条带，双增酶切后可得庭到与目的基炉因大小相一佛致的条带，形说明目的基唐因包含的该奸质粒中。通今过对转化子碑进行菌落P造CR及其质樱粒酶切检测亦，表明重组手质粒已经转恶进了大肠杆欢菌DH5α耀中。将该菌扩命为浅pH称EC-En揪d范。3讨论骄3.1念芽孢杆菌启作为表达体连系化的优点你芽孢杆菌为怪革兰氏阳性掉细菌，细胞犹壁不含内毒悬素，能分泌甜大量的蛋白瞧到体外，能非形成芽孢，尖是一些重要聋工业酶制剂倚的生产菌。浩自1958泛年Spiz篇izen暴[1彼7征]绢发现枯草杆助菌168菌绵株能摄取外泪源基因以后览，随着DN踩A重组技术树的发明，特型别是金黄色腐葡萄球菌(袜Staph煌yloco异ccus刺aureu生s献)带抗性标矛志的质粒可核作为其载体秀的发现，芽糠孢杆菌基因真工程的工作旗迅速发展。端作为很有吸贱引力的外源孔基因表达的奖宿主，芽孢背杆菌有以下别一些优点:盈除炭疽杆菌每(吴Bacil识lusa讯nthra籍cis评)和蜡样芽饥孢杆菌(撑Bacil咏lusc都ereus光)等外，多诵数芽孢杆菌掏对人畜无害缎，不像大肠袍杆菌那样具茫有热源性脂帖多糖。里遗传学现在厚相当先进，灵很多噬菌体良和质粒适合中于用作克隆羽载体。驳具有蛋白分反泌能力强的形特性。当分突泌蛋白跨过葬细胞膜后，似就被加工和芬直接释放到飘培养基中，嘉这使得回收粥和纯化目的防蛋白较为简肥单。示良好的发酵潜基础和生产彼技术。芽孢品杆菌在工业笨上长期被用挥于生产蛋白省酶、a-淀黄粉酶以及苏坚云金杆菌的早杀虫晶体蛋炉白等。在相亭对简单的培野养基中能生算长到很高的服密度。细胞稀的生长特性曾和生理学性萍质都被广泛童、深入研究挽。为经过几十年缴的努力，芽脚孢杆菌表达随系统的优越使性得到发挥谨，许多原核壳和真核基因委被克隆和表楼达，其中有驾的己应用于袖工业生产，霞取得了不少未成绩。但是暂，用芽孢杆寇菌作为产品抵生产菌也暴棒露出一些问有题:蛋白酶健对目的蛋白材的降解，质雀粒的不稳定骨，真核蛋白要分泌表达量居低或不能分赢泌表达等。落3.2骂信号肽对外坑源基因表达峰的影响购信号肽对外步源基因分泌迈表达至关重狠要，同一种平蛋白酶在不戒同信号肽的辞作用下，即创使都能分泌斗表达，其分挽泌效率也会喷相差甚远。货Yang株Yang慨[18]毫等人研究表原明：当使用砍巨大芽孢杆秋菌的胞外脂被酶的信号肽减代替自身的吓信号肽时，仰可提高青霉盲素酰胺酶G辽表达量1.舞7倍；Na急garaj碌an访[踩19究]毛选择了枯草们杆菌蛋白酶幅、中性蛋白书酶、芽孢杆会菌RNA酶套和果聚糖蔗项糖酶等四种航酶的信号肽栽，以芽孢杆切菌BE15搅10为宿主腰菌，分别研查究它们对重付组链霉抗生沈素蛋白分泌争效果的影响上。结果表明池，携带四种党融合基因的续菌株都能有预效分泌四聚亭体链霉抗生参素蛋白，但袭以用中性蛋苗白酶信号肽洞时效率最高渣。大肠杆菌莲由于细胞壁夹结构与芽孢旁杆菌不同，盯很少能将外涌源蛋白分泌劝在胞外，大贸多在胞内形扇成包含体的兄形式。在大陡肠杆菌中似翅乎信号肽的支存在对外源苗基因的表达贤存在不利，至如李相前等及[匆20织]胃通过PCR检方法分别克杜隆菌Cel1刊2B乒完整基因和记不带信号肽瑞基因至pE习T一20b铸载体，构建晨重组质粒p色ET-20旺b—Cel酒12B和p访ET一20赚bCel1敞2B-WS塔，转化至大莲肠杆菌JM权109DE巡3诱导表达垂后，分析酶先活，结果表拖明去除信号辩肽重组菌单歼位酶活是未仰去除信号肽诉重组菌的1荐1倍多。塑3.3岔引物的设计毛Rygus蒙T杜[插21遮]魔、Yang灶Yang贩[央22颈]董均报道球表明，幻外源基因在持表达载傅体轻的信号肽引咏导虹比基因自身挽信号肽引导通下迟具有较高的肿表达水平锋。Yang洞发现来自T巴hermo电bifid队afus午ca的水解驰酶只有其密输码子适合巨顺大芽孢杆菌浇时才能成功级的表达，黄滋玉杰等方[悦23印]女人在巨大芽同孢杆菌中克子隆到了编码斤内切酶的基竖因，该基因辈片段同己发午表的枯草芽径孢杆菌gl穷yB—ap叔rE之间的露同源性为3裤5％；同芽裕孢杆菌BP孟23ce婶lB、短小简芽孢杆菌内俱切葡聚糖酶耳和多粘芽孢白杆菌β-疤1，4-内坡切葡聚糖酶确的编码基因目的同源性只弓有27％。拨表明巨大芽湾孢杆菌在密照码偏爱性上喊与其他芽孢伍杆菌存在着薪差别。因此性，在设计引持物时，通过害分析巨大芽纲孢杆菌和编惑码该基因的辰密码子使用研频率，引入评碱基A。使限编码的内切虾葡聚糖酶能择够正确的与蓬表达载体p隙HIS15份25上的信灭号肽融合而购不至改变阅仆读框渔。在本实验补中，我们萌通过PCR冲去除听枯草芽孢杆适菌C-36担内切葡聚糖浅酶基因赔中贪编码信号肽蚁的序列述。4结论窜棕本实验成功族去除密枯草芽孢杆叛菌C-36搅内切葡聚糖称酶基因裤中编码翁信号肽浸的序列，并调且将挎去除信号肽牧的枯草芽孢众杆菌C-3沫6内切葡聚严糖酶基因与隙巨大芽孢杆李菌表达载体含pHIS1慢525进行销连接，准成功娇构建低了尚重组表达载怪体怀。参考文献攻[1]护谢占玲，伶吴润.纤维及素酶的研究转进展.草业撑科学[J]迟,2004没,21（4吗）予:72-寄75.躲[将2弦]飞唤徐昶，龙敏皮南，邬小兵佛等.柔高产纤维素榴酶菌株的筛导选及产酶条理件研究洪[J]疑.厦门大学指学报（自然晴科学报），促2005，凡44（1）尊：107-链111茶[扮3让]伍沈学亮，认夏黎明.产弃纤维素酶细神菌的筛选及撒酶学特性研动究嗓[J]六.林产化学喷与工业，2揭002，2养2（1）：眠47-51讨[4]李巡育阳.基腊因表达技术叶[M].凝北京,科圣学出版社,港2002喊：26-2瑞9射[员5贪]俭陪Vary俱PS.P踪rime冈time内forB萄acill射usme使gater复ium[J蜘].Mi膜crobi救ology各,199辞4,14追0:10滋01-10瓶13侧[疏6耕]墨透Rygus添T,H腾illen撇W.I丙nduci华bleh厅igh-l铁evel咬expre踩ssion持ofh获etero妙logou段sgen歇esin维Baci答llus婶megat较erium廊usin宰gthe有regu肾lator缎yele煮ments束oft依hexy赤lose-岁utili案zatio拔nope联ron[J锐].Ap洋pl.Mi纯crobi汗ol.Bi销otech位nol.,筐1991,画35:毯594-5午99芹[杆7等]纷鲁小城，赵仅宇华，方萍挪.文枯草芽孢杆渔菌F-2抗灭植物病原真侦菌活性物质拜的研究煎[J]染.浙江大学脱学报（农业封与生命科学助版），20粒07，33愁（1）：3使4-39遣[赵8肤]渗J.萨姆布创鲁克,K晨.W.拉塞度尔著.黄培氧堂译.分踪子克隆试验蒙指南[M]伪.第三版,扯北京,字科学出版社宪,200衣2：5.4鸣0-5.4枪6）习[房9樱]杨殷蔚中.食警品微生物学允[M].北誉京：中国财填政经济出版碑社，199岗1：231存-237谊[薪10汽]壶碎孙大庆，闫迎冰，赵宁等尤.费应用于转基卖因食品检测农的PCR技门术及其进展脉[J]

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