遗传学第五章细菌和噬菌体的重组和连锁

第五章细菌和噬菌体的重组和连锁细菌和病毒在遗传学研究中的优越性*结构简单*世代周期短*容易检出突变1第一节细菌的遗传分析一、细菌的杂交细菌菌落的表现型：原养型（野生型）

形态性状：菌落形状、颜色、大小突变型生理特性营养缺陷型+/-

抗性-抗药或抗感染r/s2图5－1黎德伯格和塔特姆的杂交试验1946

3可能的原因：*污染*突变*营养互补*遗传重组4图5-2U型管实验证明菌株间直接接触的必要性5二、F因子大肠杆菌遗传物质的传递方式跟具有典型减数分裂过程的生物不同:*两个亲本类型对子裔的遗传贡献不相等*所有在子裔中出现的基因都是连锁的???6Hayes和Cavalli-Sforza（1952)

菌株A菌株Bmet-thr+leu+thi+×met+thr-leu-thi-链霉素处理菌株A或菌株B，阻碍其分裂处理菌株A+未处理菌株B有菌落处理菌株B+未处理菌株A无菌落7菌株A——供体处理后仍能转移基因菌株B——受体未处理，仍能分裂，接受转移过来的基因供体有一个性因子即致育因子(sexorfertilityfactor)--F因子，是能独立增殖的环状DNA分子供体细胞F+

的表面有性伞毛

8图5－3两个E.Coli

细胞杂交的电子显微镜照片(X34,300)

性伞毛/结合管

9F+→F+

F-→F-F+×F-↓F+

但染色体上基因的重组频率很低

吖黄素F+F-

5’10F+хF-11Fig17.9F+xF-conjugation.©2003JohnWileyandSonsPublishers12三、高频重组在菌株A（F+

）中发现一个新菌株，跟菌株B（F-

）杂交时，出现重组子的频率很高，几乎比F+×F-高一千倍，称高频重组（highfrequencyofrecombination,Hfr）菌株但Hfr×F-时，

F-细菌很少有转变成F+的？？13四、用中断杂交技术作连锁图

Jacob和Wollman在五十年代设计了一个著名的中断杂交试验

14

Hfr:thr+leu+azirtonrlac+gal+strsF-:thr-leu-azistonslac-gal-strr

每隔一定时间取样，放在食物搅拌器内搅拌培养在含str不含Thr和Leu的培养基上，Hfr和F-不能生长，只有重组子可以生长用影印培养法测试形成的菌落的基因型，确定每个基因转入F-的顺序（时间）根据基因转入F-的时间，进行细菌染色体作图

15细菌的影印培养法16

中断杂交技术（interruptedmatingtechnique）：根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术

Hfr的未选择标记基因进入F-所需的时间分钟转移的Hfr基因 〈9 09azir 11 azirtonr 18azirtonrlac+

25

azirtonrlac+gal+ 1718Hfr细菌的基因按一定的时间顺序依次出现在F-细菌染色体从一端（原点origin，o）开始，以线性方式进入F-细菌

oazitonlacgalF09111825

根据中断杂交实验作出的大肠杆菌连锁图19Fig17.12TheinterruptedmatingexperimentofWollmanandJacob.©2003JohnWileyandSonsPublishers20高频转导：HfrxF-F因子部分在最后转移21Hfr的类型基因转移顺序HfrH123AB3120thrprolacpurgalhisglythi0thrthiglyhisgalpurlacpro0prothrthiglyhisgalpurlac0purlacprothrthiglyhisgal0thithrprolacpurgalhisgly

表5－1用中断杂交法确定的几个Hfr菌株的基因顺序22用不同的Hfr菌株进行中断杂交实验制作连锁图，发现基因转移的顺序、转移的起点(O)和转移的方向不同？？？假设细菌染色体是环状的任何线性的Hfr染色体的形成都可用F因子插入环状染色体的不同地点来说明CairnsJ.1960电子显微镜观察到大肠杆菌的DNA确实是环状的

23Fig17.10SomeofthesitesofF-factorintegrationintheE.colichromosome.©2003JohnWileyandSonsPublishers24五、F因子整合到细菌染色体环状的F因子，通过一个简单交换，整合到环状的细菌染色体上，形成Hfr染色体F因子的插入决定了Hfr染色体的极性，F因子所在的地方是末端，而跟F因子相对的一点是原点，是染色体转移的起点25环状的F因子包括几个部分：1）原点，是转移的起点2）形成性伞毛的基因群3）DNA复制酶基因4）插入序列26质粒（plasmid）：染色体外遗传物质，可自我复制，并在细胞分裂时分配到子细胞中，如可整合到染色体上，成为染色体的一部分，则称为附加体（episome）F因子在F+细菌中存在于细胞质内，在Hfr细菌中整合到染色体上，是附加体的一种27F因子的结构及其整合到细菌染色体的过程28Hfr×F-↓Hfr

→HfrF-→F-

接合开始，F因子仅有一部分进入F–细胞，剩下部分基因只有等到细菌染色体全部进入到F–细胞之后才能进入，然而转移过程常常中断

5’29E.coliF因子存在状态有三种类型：①没有F因子，即F–②游离状态的F因子，即F+③整合的F因子，即Hfr

30六、细菌的交换过程根据杂交中产生的重组子推论出杂交中遗传信息的转移过程转移过去的基因必须通过一种交换过程整合到细菌的基因组？？？真核类遗传交换在两整套基因组间进行原核类一套完整的基因组（F-内基因子，

endogenote）一不完整的基因组（供体外基因子，

exogenote）31即在部分二倍体（partialdiploid）或部分合子（merozygote）间进行32细菌重组的两个特点：1）只有偶数交换才能产生平衡的重组子2）相反的重组子（reciprocalrecombinant）不出现，所以在选择培养基上只出现一种重组子33七、重组作图如果两个基因间的转移时间小于2分钟，用中断杂交法所得的图距不太可靠，应采用传统的重组作图法。例如根据中断杂交知道lac和ade紧密连锁,而且ade是lac之后进入F-受体,做杂交:Hfrlac+ade+strs×F-lac-ade-strr混合60min后在含有链霉素的基本培养基上培养34Hfr和F-不能生长生长的应为ade+strr因为ade+是在lac+之后进入F-

的lac+自然也已进入影印培养检测能否利用乳糖如为lac+ade+,没有发生交换;如为lac-ade+,发生过交换35lac-ade之间的图距为：lac-ade=

lac-ade+lac-ade++lac+ade+x1001、选择在腺甘酸（ade）缺乏的培养基上生长的类型。它们表明ade基因已转入细胞。2、选出的lac-ade+类型即是重组子，因为ade+已进入，表明lac+也已进入，而lac-ade+表型就是供体受体lac、ade两个基因间发生交换的结果。可用此来计算重组值。36重组作图：Hfrlac+ade+F-lac-ade-

F-lac-ade-Hfrlac+ade+F-lac-ade-

F-lac+ade+Hfrlac+ade+F-lac-ade-

F-lac-ade+没有发生交换两个基因都交换到受体上交换发生在两个基因之间371个时间单位(1分钟)→20%重组值38图5－41963年E.Coli遗传图。图距单位是分钟39八、性导Adelberg1959发现一个新的Hfr菌株:*性因子转移频率似乎与F+一样高*与Hfr一样，以同一方向和顺序转移细菌染色体，但效率要低得多

HfrF’HfrF’（F-prime）40Fig17.11TheformationofanF’factor.©2003JohnWileyandSonsPublishers41F’上的基因与细菌染色体的基因形成了部分二倍体利用F因子形成部分二倍体的过程，称为性导（sexduction或F-duction）F因子整合到宿主细菌染色体的过程是可逆的，当发生环出时偶然不够准确，携带有染色体的一些基因，称这种F因子为F´因子可独立复制，也可重新整合到宿主染色体上形成Hfr

42九、转化转化（transformation）：某些细菌(或其它生物)通过其细胞膜直接从周围介质中吸收DNA片段转化首先是Griffith(1928)在肺炎双球菌中发现的杀死SⅢ片段

RⅡSⅢAvery(1944)等研究证实，转化因子是DNA。这个极其重要的发现，不仅证实遗传物质是DNA，而且表明转化是细菌交换基因的方式之一43Fig17.2TheintegrationofacirculardonorDNAmoleculeintoacircularrecipientchromosomerequiresasinglecrossoverevent.©2003JohnWileyandSonsPublishers44Fig17.1Inorderforsuccessfulrecombinationtooccur,anevennumberofexchanges,twointhiscase,isrequiredbetweenthecircularmainchromosomeandthelinearfragments.©2003JohnWileyandSonsPublishers45Fig17.15AsingleexchangebetweenalineardonorDNAmoleculeandacircularrecipientchromosomedoesnotyieldastructurallyintactrecombinantchromosome.©2003JohnWileyandSonsPublishers46Fig17.6Bacterialtransformation.©2003JohnWileyandSonsPublishers47转化和基因重组作图

当两个基因紧密连锁时，它们就有较多的机会包括在同一个DNA片段中，并同时整合到受体染色体中。因此，紧密连锁的基因可以通过转化进行作图。如：

48表5-2枯草杆菌细胞的转化供体DNA受体细胞转化子类型转化子数

trp+tyr-trp+tyr-190trp-tyr+trp-tyr-trp-tyr+256trp+tyr+2trp+tyr+trp-tyr-trp+tyr-196trp-tyr+328trp+tyr+36749*2个转化DNA分子产生的结果中，双转化类型极少两个分离的转化DNA片段同时与受体重组是困难的*trp+tyr+的转化中，双转化类型明显增加这两个基因是连锁的：相距越远，越容易获得单转化；越近，越容易获得双转化50trp-tyr重组率=（196+328）/（196+328+367）

=58.8%51小结接合：指在原核生物中，遗传物质从供体-“雄性”转移到受体-“雌性”的过程性导：指接合时由F´因子所携带的外源DNA转移到细菌染色体的过程转化：某些细菌(或其它生物)通过其细胞膜直接从周围介质中吸收DNA片段52第二节噬菌体的遗传分析

53一、烈性噬菌体54二、T2噬菌体的基因重组与作图

噬菌斑形态正常r+:小、边缘模糊噬菌体

突变r-:大、边缘清楚性状

宿主范围：感染和裂正常h+:B株解的菌株突变h-:B株不同或B/2株由于h–和h+均能感染B株，用T2的两亲本h–r+和h+r–同时感染B株，称为双重感染

55

h-r+

×h+r-

↓B株

h-r+h+r-h-r-h+r+

↓接种在同时长有B株及B/2株的培养基上

亲型噬菌斑h-r+：透明、小

h+r-：半透明、大重组型噬菌斑h-r-：透明、大

h+r+：半透明、小56

重组型噬菌斑

重组值=×100%

总噬菌斑

h-r-+h+r+=×100%

h-r++h+r-+h-r-+h+r+

ra–h+r+h–

→24%rb–h+r+h–

→

12.3%

rc–h+

r+h–

→

1.6%

57表5－2四种噬菌斑数及重组值杂交组合每种基因型的%重组值r–h+r+h–r+h+r–h–ra–h+r+h–rb–h+r+h–rc–h+×r+h–34.032.039.042.056.059.012.05.90.712.06.40.924%12.3%1.6%58分别作出ra、rb、rc与h的连锁图

ra24

hrb12.3

hrc1.6h×rarbrch√rarbhrc√rarchrb×rahrcrb

59为了确定基因排列顺序，可先只考虑rb、rc及h来确定是rbrch还是rbhrc。为此作：

rb+rc-×rb-rc+↓

重组值约14%

可知h应位于rb及rc之间，又因为T2噬菌体的连锁图是环状的

60三、温和噬菌体（溶源性细菌）噬菌体感染细菌后，除偶尔情况外，不出现溶菌现象，这一类噬菌体被称为温和性噬菌体（temperatephage）以两种形式出现，如P1以游离状态存在λ以整合状态存在6162Fig17.18Theestablishmentoflysogeny.©2003JohnWileyandSonsPublishers63细菌受温和噬菌体感染后进入溶源周期,具有如下两个特征:*具有免疫性*受紫外线诱导进入裂解周期有些细菌带有某种噬菌体，但并不立即导致溶菌，这种现象称为溶源性（lysogeny），而这样的细菌称为溶源性细菌或溶源菌（lysogenicbacteria）64Lederberg等所用的原始大肠杆菌菌株对于λ温和噬菌体来说是溶源菌，发现F+×F-

(λ)可偶尔产生溶源性重组子；而F+

(λ)×F-则几乎不产生溶源性重组子Hfr×F-(λ)很容易得到有Hfr基因的溶源性重组子Hfr(λ)×F-时Hfr菌株的前端基因可在F-受体中出现，但后端基因的重组子得不到？？？65λ原噬菌体进入一个无免疫能力的细胞，原噬菌体随即开始复制，使细胞裂解，释放出游离的噬菌体，这种现象叫做合子诱导（zygoticinduction）λ原噬菌体??时间进入F-

细菌通过中断杂交试验可以证明，λ原噬菌体在一特定时间进入F-

细菌，表明在gal座位的附近66四、转导在大肠杆菌中发现细菌杂交，在鼠伤寒沙门氏菌？？？

phe-try-tyr-×met-his-在基本培养基上分别培养无菌落混合培养有菌落？？67

U型管试验→将上述两种菌株分别放在戴维斯U型管的两臂内中间用玻璃滤板隔开，以防止细胞直接接触，但允许比细菌小的物质通过，获得了野生型重组体

说明不是接合

→这种重组是通过一种过滤性因子(FA)而实现的

FA不受DNA酶的影响说明不是转化

→进一步研究证明，FA是一种噬菌体，称为P22（用抗P22血清处理后失活）

68转导（transduction）：以噬菌体为载体，将供体菌基因转移到受体菌中的过程。

普遍性转导转导特异性转导691、普遍性转导可以转导细菌染色体组的任何不同部分

转导颗粒70P22或P1感染细菌细胞时，细菌染色体断裂成小片段。在形成噬菌体颗粒时，偶尔错误地把细菌染色体的片段组合到头部影响感染细菌的能力？？不影响外壳蛋白吸附到细菌细胞，注入内容物供体菌DNA受体菌DNA71Fig17.17Theformationofgeneralizedtransducingvirusesandthesubsequenttransductionofrecipientbacteria.©2003JohnWileyandSonsPublishers72→两个基因同在一起转导就是共转导

或并发转导（cotransduction）→共转导的频率高，表明两个基因在染色体上的距离愈近，连锁愈紧密→测定两基因的共转导频率就可以确定基因之间的次序和距离73P1基因组91.5kb约相当于大肠杆菌基因组的2.4%两个基因并发转导的概率可用下式计算

X=(1-d/L)3其中d为两标记基因之间的距离

L为转导颗粒能够包裹的DNA的最大长度74例：用P1噬菌体进行转导实验供体thr+leu+azir

受体thr-leu-azis在受体中选择一个或几个供体的标记基因，然后检查非选择性标记基因的有无75

表5-3用P1噬菌体普遍性转导测定大肠杆菌基因间的连锁关系

实验选择标记非选择标记

1

leu+50%azir，2%thr+

2thr+3%leu+，0%azir

3leu+thr+0%azir

76实验1说明leu和azi相近而leu和thr则远

thrazileuthrleuazi

77实验2说明leu比azi更接近thrthrleuazi

实验3说明这个顺序是正确的，因为leu+thr+片段从未携带有azir

这也说明了转导片段的大小。在

thr和leu之间的DNA长度已接近于这个片段大小的极限782、特异性转导Morse和Lederberg1956发现λ噬菌体也可以转移细菌基因，但被转导的只是λ噬菌体在细菌染色体上插入位点两侧的基因，即仅限于gal和bio区以内的基因，称特异性转导(specializedtransduction)，或局限性转导（restrictedtransduction)79图5－4λdgal特异性转导噬菌体的形成模式80*带有gal+的λ噬菌体是有缺陷的，记作λdgal+（λ-defectivegal+）*λdgal+转导粒子（transducingparticles）约丧失25%的噬菌体染色体，但具有完整的λ外壳，仍能感染细菌81Fig17.20Themechanismofspecializedtransductionbyλbacteriophage.©2003JohnWileyandSonsPublishers82图5－5λdgal+转导颗粒转导gal细菌的过程83E.coliphagegaldgal+非正常切离感染gal-E.coligal-

gal+gal-dgal+若dgal+进入的同时