单核苷酸多态性及其应用

单核苷酸多态性及其应用第1页，共43页，2023年，2月20日，星期一SNP的概念

单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)

是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。

同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性。第2页，共43页，2023年，2月20日，星期一Singlenucleotidepolymorphism第3页，共43页，2023年，2月20日，星期一SNP的特征

SNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种，占所有已知多态性的90%以上，在人类基因组中广泛存在，人类DNA中每300-1000bp就有一个SNP.

因此，一个人类个体大约携带300万-1000万个SNPs。第4页，共43页，2023年，2月20日，星期一SNP的特征

一个SNP表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变化，作为一种碱基的替换，大多数为转换（C—T，G—A），也可能是颠换。具有转换型变异的SNP约占SNP总量的2／3左右。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，而且在CG序列上出现最为频繁，多是发生C—T的转换，原因是CG中的C是甲基化的，它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧啶。第5页，共43页，2023年，2月20日，星期一SNP大都表现为二等位基因（bialletic)多态性,即在该位置只存在两种不同的碱基。位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍型(haplotype)，相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代.第6页，共43页，2023年，2月20日，星期一第7页，共43页，2023年，2月20日，星期一根据SNP在基因组中的分布位置可分为:

基因编码区SNP(cSNP)

基因调控区SNP(pSNP)

基因间随机编码区SNP(rSNP)

等三类。

因为编码区内的变异率占周围序列的1/5，cRNP的总量显著少于其他两类SNPs。第8页，共43页，2023年，2月20日，星期一

cSNP又可分为2种：同义cSNP(synonymouscSNP)：非同义cSNP(non-synonymouscSNP)第9页，共43页，2023年，2月20日，星期一同义cSNP：

SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；非同义cSNP：指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。这种改变常常是导致生物性状改变的直接原因。位于基因调控区的SNP则会影响基因表达量的多少，因此，这两类SNP在功能和疾病发生发展方面具有更重要的意义。第10页，共43页，2023年，2月20日，星期一SNP的检测方法

单链构象多态性(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)

原理：单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列决定的，当某一个碱基发生突变时，便会直接影响该链的构象，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移率会发生改变。第11页，共43页，2023年，2月20日，星期一SNP的检测方法变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)

原理:

当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。第12页，共43页，2023年，2月20日，星期一SNP的检测方法

Taqman法

以荧光共振能量传递(fluorescentresonanceenergytransfer,FRET)为基础的检测方法。在PCR反应中，将供者-受者染料对分别结合到Taqman探针的两端，探针未与目标序列结合时，通过FRET作用使供者不发荧光；完全互补配对后，由于TaqDNA聚合酶具有5‘核酸酶的活性，可将供者从探针上切下来从而发出荧光。如果探针与目标序列中存在错配碱基，就会减少探针与目标序列结合的紧密程度及TaqDNA聚合酶切割供者的活性，也就影响了供者的荧光释放量，从而使碱基突变链和正常链得以区分。第13页，共43页，2023年，2月20日，星期一

供者受者5‘

3‘

Taqman探针第14页，共43页，2023年，2月20日，星期一

供者受者5‘

3‘

Taqman探针第15页，共43页，2023年，2月20日，星期一

供者受者5‘

3‘

引物目标序列第16页，共43页，2023年，2月20日，星期一受者5‘

3‘

引物

供者目标序列第17页，共43页，2023年，2月20日，星期一SNP的检测方法

分子信标(molecularbeacon)法

分子信标是一个U型的单链核苷酸探针（探针序列内部可有一定程度的互补配对），在探针两端也加上供者-受者染料对，U型探针使两染料靠近，通过FRET作用使供者不发荧光。当探针与目标序列完全互补配对后，两染料分离，使得供者的荧光亮增加，如果目标序列中存在错配碱基，就会影响探针与其结合，从而影响到供者的荧光亮，使碱基突变链和正常链得以区分。第18页，共43页，2023年，2月20日，星期一供者受者第19页，共43页，2023年，2月20日，星期一

供者受者第20页，共43页，2023年，2月20日，星期一焦磷酸测序法焦磷酸测序法(pyrosequencing)是一种不依赖平板胶或毛细管电泳，不依赖DNA的荧光标记/激发/检测体系的序列分析技术，适用于已知序列的DNA片段进行验证分析，适用于已知SNP的序列验证及基因分型。第21页，共43页，2023年，2月20日，星期一

焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体系中的酶级联反应:

包括DNA聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷酸酶;

反应底物为adenosine5‘phosphosulfate(APS)和萤光素。反应体系还包括待测序的DNA单链和测序引物。第22页，共43页，2023年，2月20日，星期一在每一轮测序反应中，加入一种dNTP。如该dNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中并释放焦磷酸基团(PPi)。掺入的dNTP和释放的焦磷酸的物质的量相等，反应时dATP由deoxyadenosinealfa-thiotriphosphale(dATPaS)替代．因为DNA聚合酶对dATPaS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATP是萤光素酶的底物，dATPctS不是。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，其物质的量和焦磷酸一致。第23页，共43页，2023年，2月20日，星期一

ATP驱动萤光素酶介导的萤光素向氧化萤光素(oxyluclferin)的转化，氧化萤光素发出与ATP含量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并通过相应的软件得到反映。每个峰的高度(光信号）与反应中掺入的核苷酸数成正比，ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，猝灭光信号，并再生反应体系，加入另一种dNTP进行下一轮反应。随着以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列信号峰确定。该技术分析系统自动化程度高，通量大，速度快，易于建立标准化操作，适合大规模SNP研究及基因分型。第24页，共43页，2023年，2月20日，星期一第25页，共43页，2023年，2月20日，星期一SNP的检测方法

动态等位基因特异性杂交法(dynamicallelespecifichybridization,DASH)

用生物素标记一条引物进行目的DNA扩增，PCR产物经生物素结合于链亲和素包裹的微孔板壁，不带生物素标记的链用碱洗掉。加入探针和荧光染料，荧光染料SYBRGreenⅠ可特异性地插入ＤＮＡ双链中，在激发光的作用下发出荧光，而在单链ＤＮＡ中则不能；探针和ＰＣＲ产物单链杂交后，在ＤＡＳＨ仪中微孔板持续缓慢升温，同时连续检测各孔中荧光强度，将温度及各孔中对应的荧光强度输入计算机,ＳＮＰ基因型与探针完全匹配的样品在较高温度才解链,因此在较高温度才得到d(Fluorescence)/dt峰;与探针不完全匹配的样品则在较低温度时就得到d(Fluorescence)/dt峰，杂合子则得到两个峰。第26页，共43页，2023年，2月20日，星期一PCR扩增第27页，共43页，2023年，2月20日，星期一链亲和素包裹的微孔板

+

碱变性第28页，共43页，2023年，2月20日，星期一持续缓慢升温第29页，共43页，2023年，2月20日，星期一

第30页，共43页，2023年，2月20日，星期一SNP的检测方法

变性高效液相色谱(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography,DHPLC)

原理第31页，共43页，2023年，2月20日，星期一第32页，共43页，2023年，2月20日，星期一第33页，共43页，2023年，2月20日，星期一第34页，共43页，2023年，2月20日，星期一第35页，共43页，2023年，2月20日，星期一SNP的检测方法

ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ质谱分析法(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-flightmassspectrometry)

原理：适当大小的有机分子晶体(介质)用接近其吸收光谱的激光瞬时激发，会发生能量转移及解吸附过程。如将低浓度的蛋白质或核酸分子加入介质溶液中并加以干燥，蛋白质或核酸分子将嵌入到介质晶体中。将该晶体放入质谱仪的真空小室，用瞬时(纳秒)强激光激发，晶体中的蛋白质或核酸分子就会解吸附，转变成气相的离子态，此时可通过质谱分析这些离子。第36页，共43页，2023年，2月20日，星期一SNP的检测方法

DNA芯片技术（DNAchip）

将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上，彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA分别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥非常重要的作用。第37页，共43页，2023年，2月20日，星期一SNP的应用

SNP作图

利用SNP图谱搜寻遗传致病基因

SNP在药物设计中的作用

SNP在法医学中的应用

人类起源迁移进化的研究第38页，共43页，2023年，2月20日，星期一

1．人类基因单体型图的绘制

大多数染色体区域具有少数几个常见的单体型，代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。某些染色体区域可以有很多SNP位点，但是只用少数几个标签SNPs，就能够提供该区域内大多数的遗传多态性模式。绘制人类基因单体型图的目的就是描述人类常见的遗传多态性模式和染色体上具有成组紧密关联SNPs的区域。第39页，共43页，2023年，2月20日，星期一2002年10月，国际人类基因组单体型图计划(HapMap计划)正式启动，截至目前已有超过150万SNPs被精确定位于各染色体上，并且已根据这些SNPs对来自4个不同人种的269份DNA样品进行了基因分型。后期目标是要使总密度达到每500bP有一个SNP。通过不同个体基因组DNA的基因分型和频率计算，绘制更加精密的单倍型图谱。人类基因单体型图的绘制完成，将为我们