含生物碱类成分中药制剂的分析

含生物碱类成分中药制剂的分析第1页，共39页，2023年，2月20日，星期一

第一节生物碱alkaloid类成分分析

了解生物碱的理化性质熟悉中药制剂内Alk定性鉴别的原理方法掌握Alk的供试液的提取纯化制备方法、定量测定的原理和方法

第2页，共39页，2023年，2月20日，星期一一、概述（了解）生物碱是中药中重要的有效成分之一。多具复杂的环状结构，有显著的生理作用。至少有豆科、防已科、毛茛科、夹竹桃科、茄科、石蒜科50多科，120属以上植物中有生物碱存在。以双子叶植物最多，其次单子叶植物，裸子植物。以罂粟科等的植物分布较多。生物碱的种类很多(见表1)，但具生理活性大多集中在异喹啉、吲哚、茛菪烷类等衍生物。多以盐的形式存在于植物体内。第3页，共39页，2023年，2月20日，星期一序号类型基本结构植物药举例1、吡咯类a古豆、狗舌草2、吡啶类b毒芹、一叶秋、烟草3、喹啉类c

多鸡纳4、异喹啉类d黄连、罂粟、吐根、石蒜5、吲哚类e

番木鳖、毒扁豆、萝芙木6、咪唑类f毛果芸香生物碱类型及其基本结构

第4页，共39页，2023年，2月20日，星期一生物碱类型及其基本结构6咪唑类f毛果芸香7喹唑酮类g

常山8嘌啉类h茶叶9甾体类j

澳洲茄10莨菪烷类k颠茄、洋金花、古柯11无环类

麻黄12其他

乌头、秋水仙第5页，共39页，2023年，2月20日，星期一生物碱类型及其基本结构abcdefgIjK第6页，共39页，2023年，2月20日，星期一与中药化学差别(1)用量不同：分析一般样品量小。

(2)提取的原则不同：分析是保证待测组分的最大回收。

(3)分离目的不同：分析是尽量排除干扰，净化待测组分。

(4)定性目的不同第7页，共39页，2023年，2月20日，星期一二、理化性质与提取分离1、物理性质一般无色结晶固体，少数为非结晶形粉未，少数有色。2、旋光性多具手性碳原子，所以多具有旋光性，且多为左旋。第8页，共39页，2023年，2月20日，星期一二、理化性质与提取分离3、酸碱性：分子中含N原子，多具有碱性。

碱性：胍＞季铵碱＞烷胺类(脂叔胺碱)＞吡啶(芳叔胺碱)＞酰胺类。

Sp3＞Sp2＞Sp1

第9页，共39页，2023年，2月20日，星期一4、溶解性游离生物碱：极性较小，不溶或难溶于水能溶于乙醇、氯仿、丙酮、乙醚等有机溶媒中分析中常用氯仿、乙醚作为提取溶剂生物碱的盐类：大多易溶于水及醇不溶于或难溶于苯、氯仿、乙醇等该性质是相反的，可用来提取、分离、精制生物碱但需注意：季胺碱、酰胺碱、和一些含极性基团较多的Alk则能溶于水含酚羟基、和羧基的生物碱呈酸碱两性反应

二、理化性质与提取分离第10页，共39页，2023年，2月20日，星期一二、理化性质与提取分离5、沉淀反应Alk在H＋水液或H＋稀醇(＜50％）中，与Alk↓试剂生成难溶性↓精制协助鉴定但蛋白质、肽类、鞣质、嘌呤类，有的黄酮、香豆素及查耳酮也可与某些Alk↓试剂反应，实验中需排除这些干扰。含Alk样品液纯化精制后，再进行实验。

第11页，共39页，2023年，2月20日，星期一二、理化性质与提取分离OH－

水洗

H＋酸性水液

Alk沉淀试剂(3种)第12页，共39页，2023年，2月20日，星期一生物碱沉淀沉淀试剂大体可分为三类

(1)与Alk生成不溶性盐类如：磷钼酸、硅钨酸(Alkertrand)、磷钨酸；

(2)与Alk形成疏松的络盐如：碘－碘化钾试剂(Wagner)；

(3)与Alk的氮原子反应，生成不溶性加成物如：碘化铋钾(Dragendorff)、碘化汞钾试剂(Mayer)。

二、理化性质与提取分离第13页，共39页，2023年，2月20日，星期一6、显色反应有些Alk与某些试剂呈颜色反应，可借以识别Alk，但易杂质干扰，需净化后进行。

7、生物碱供试液的提取主根据Alk的溶解度而定。

(1)有机溶剂提取氨水湿润Alk游离，后用CHCl3、(CH3CH2)2O提取较稳定的生物碱盐类，可用碱性较强的NaCO3、Ca(OH)２、NaOH碱化本法缺点是不能提出水溶性生物碱

二、理化性质与提取分离第14页，共39页，2023年，2月20日，星期一(2)醇水溶媒提取

用中性甲醇、乙醇、酸性甲醇、乙醇、酸水(如：0.1～1%)盐酸、硫酸、酒石酸等提取。

此法较简便，但提取出的杂质较多，需进一步纯化处理。

(3)混合溶媒提取用不同极性的溶剂按不同比列混合，该法可以较好地提取出待测组分。如：百部、粉防已用乙醚:氯仿:乙醇:10%NH3OH(25：8：25：1)。

二、理化性质与提取分离第15页，共39页，2023年，2月20日，星期一二、理化性质与提取分离(4)水溶性Alk：可用Alk沉淀试剂如雷氏盐(硫氰化铬铵)、磷钨酸等生成不溶性的复盐而从水中析出,沉淀溶于丙酮，通过阳离子交换树脂，氢氧化铵洗脱，可得游离生物碱(5)生物碱样品的提取方法常用的有：冷浸法、渗漉法、超声提取法、索氏提取法、热回流提取法等冷浸法与冷浸超声提取法操作简便、快捷，常用必要时，要对上述方法作比较，以优选出最佳提取方法。

第16页，共39页，2023年，2月20日，星期一8、生物碱样品预处理——精制

(1)萃取法酸碱萃取法——经典法

Alk离子对萃取法，依据离子对萃取原理

生物碱在弱酸性介质→阳离子+大分子(离子对试剂)→复盐（水溶性小，溶于有机溶剂）

与水溶性杂质分离若离子对试剂为有机染料，则该法还可用于生物碱的定量分析，如：小蘖碱可加入pH8.5的四溴酚酞乙酯缓冲液，CH2Cl2萃取，取CH2Cl2液比色测定。

(2)色谱法——柱色谱、色谱小柱二、理化性质与提取分离第17页，共39页，2023年，2月20日，星期一三、定性鉴别（一）一般理化鉴别常用鉴别有：Alk的沉淀反应、特殊显色反应、色谱鉴别等l、Alk的沉淀反应三种以上试剂呈阳性反应。注意干扰2、特殊显色反应(1)对二甲氨基苯甲醛试剂――吲哚类显蓝(2)小蘖碱――盐酸过氧化氢试剂，呈红紫(3)Vitali――醇制KOH试剂，莨菪烷类呈紫(4)Labat反应――次亚甲二氧基反应(5)双缩脲反应――麻黄碱呈紫色第18页，共39页，2023年，2月20日，星期一（二）色谱鉴别方法：TLC、PC、HPLC、GC等。多用TLC法。

中药名吸附剂展开剂显色方法黄连、黄柏(小蘖碱)硅胶G

正丁醇:醋酸:水(7:2:1)氯仿:甲醇(4:1)改良碘化铋钾试剂或紫外灯365nm麻黄(麻黄碱)硅胶G氯仿：甲醇：浓氨水(20：5：0.5)正丁醇：醋酸：水(4：1：1滴)0.5%茚三酮试剂元胡(延胡索乙素)硅胶G或乙醚：环已烷：甲醇(5：3：0.5)硅胶H:已烷:氯仿:甲醇:二已烷(5:3:0.5:l)改良碘化铋钾试剂乌头(乌头碱)碱性氧化铝乙醚：石油醚(10:1碘蒸气第19页，共39页，2023年，2月20日，星期一早期常用的有：酸碱滴定法、沉淀法、酸性染料比色法、雷氏盐比色法等

现用：分光光度法、TLC、HPLC、GC等（一）总生物碱含量测定1、经典化学法(重量法、容量法)(1)重量法原理：Alk可与生物碱沉淀试剂定量反应生成沉淀，根据沉淀量可间接求出生物碱含量。此法操作较繁，费时、且准确度较差四、含量测定方法第20页，共39页，2023年，2月20日，星期一四、含量测定方法适用范围：凡碱性很弱多不宜用容量法或其他方法测定者挥发性生物碱不宜用此法例苦参总碱测定：硅钨酸沉淀法苦参片→20%NaOH碱化→氯仿回流提取→稀盐酸溶解→定容→10%硅钨酸沉淀→过滤沉淀→沉淀干燥称重，计算含量第21页，共39页，2023年，2月20日，星期一(2)容量法分类：酸碱滴定、两相滴定、络合滴定、沉淀容量法等

I、酸碱滴定原理生物碱呈碱性，可用酸滴定；pH指示剂指示终点。生物碱盐，一般呈酸性(强酸弱碱盐)，可用强碱滴定。因其终点在70-90%乙醇中比在水中明显，故可用标准碱的醇溶液滴定，以酚酞为指示剂指示终点四、含量测定方法第22页，共39页，2023年，2月20日，星期一四、含量测定方法II、两相滴定原理离子离子分子在水相与水不相溶的有机溶剂(氯仿应用最多)两相中进行滴定注意选择：合适的PH，合适的酸性染料，合适的有机溶剂，以PH最为重要。第23页，共39页，2023年，2月20日，星期一四、含量测定方法a、两相酸碱滴定法：生物碱盐溶于水，加适量氯仿等有机溶剂，NaOH滴定，酚酞指示剂指示终点。滴定产生游离生物碱转溶有机溶剂，所以灵敏度比一般酸碱滴定好，又称为两相置换滴定b、两相酸性染料滴定法：

用酸性染料为滴定剂，在水与氯仿两相中滴定生物碱，Alk阳离子与酸性染料阴离子缔合进入氯仿（等有机溶剂），终点时，稍过量酸性染料使水层产生颜色指示终点。利用氯仿层可比色定量。

第24页，共39页，2023年，2月20日，星期一四、含量测定方法III、络合滴定原理用过量的重金属生物碱沉淀试剂，使生物碱沉淀，将沉淀溶解，然后用络合剂滴定沉淀中重金属先用过量重金属生物碱沉淀试剂，使生物碱沉淀，后用络合剂滴定溶液中剩余的过量重金属生物碱沉淀试剂，而间接定量。繁琐少用Ⅳ、沉淀容量法利用生物碱与生物碱沉淀试剂的反应，直接或间接定量第25页，共39页，2023年，2月20日，星期一2、光谱法定量（1）直接测定（2）比色法（可见分光光度法）酸性染料比色法、雷氏盐比色法、苦味酸比色法

第26页，共39页，2023年，2月20日，星期一I

、酸性染料比色法

原理：与酸性染料滴定法相同本法关键：pH值、酸性染料种类、有机溶剂常用染料：甲基橙、溴麝香草酚蓝BTB、溴甲酚绿、溴酚蓝、溴甲酚紫等有机溶剂选择：依据离子对与有机相能否形成氢键以及形成氢键能力的强弱常用有机溶剂：氯仿、二氯甲烷注意：微量水份可使有机相混浊，影响比色，应先脱水后测定（2）比色法（可见分光光度法）第27页，共39页，2023年，2月20日，星期一II

、雷氏盐比色法

原理：Alk与雷氏盐生成红色沉淀，此沉淀溶于丙酮，于520-526nm波长处，选择最大吸收波长，测定吸收度。根据雷氏盐丙酮液的ε为106.5(单盐)或203.0(双盐)。按下式计算样品生成雷氏盐重量（W，g）。（2）比色法（可见分光光度法）第28页，共39页，2023年，2月20日，星期一IV、其它比色法苦味酸比色法方法：沉淀加碱解离，以有机溶剂提出生物碱，将苦味酸的碱性水溶液进行比色氯仿提取苦味酸生物碱盐，碱性缓冲液使盐解离，并将苦味酸提取而进行比色氯仿提取苦味酸盐而直接进行比色。（2）比色法（可见分光光度法）Ⅲ、异羟肟酸铁比色法酯键结构→碱性加热水解→羧基+羟胺→异羟肟酸+Fe3+→异羟肟酸铁（紫红色化合物）如：乌头总生物碱的测定第29页，共39页，2023年，2月20日，星期一主要有HPLC、GC、TLC等

1、TLC法对样品纯化程度要求不高。但一般点样误差大，定量时，首先作一标准曲线，考察线性范围，确定定量方法(内标/外标、一点法/二点法)，均需同板标准品随行对照。同时要考察方法的稳定性、同板与异板的精密度

（二）单体生物碱的含量测定第30页，共39页，2023年，2月20日，星期一2、HPLC法生物碱盐为离子型化合物.∴有离子交换、离子对、正相HPLC法。生物碱为分子型化合物，∴可用反相、分配HPLC法，应用较多。注意：在Alk分析中，反相柱硅胶表面仍残留有游离的硅醇羟基，呈弱酸性，会吸附碱性的生物碱使色谱峰拖尾克服措施：

I、固定相

通常硅醇羟基被覆盖率越高，分离效果越好。如用C8比C18好。

第31页，共39页，2023年，2月20日，星期一2、HPLC法II、流动相

为减小ALK在反相柱上的拖尾，可采取如下措施：

a、加入有机胺类：

常加入三乙胺或季胺碱盐。

使流动相呈碱性，抑制或掩蔽游离硅醇羟基影响。

b、在流动相中加入离子对试剂：

与ALK类成分生成离子对掩蔽其碱性基使之不能与固定相表面的硅醇基作用，使ALK类成分易于出峰，且峰形好。第32页，共39页，2023年，2月20日，星期一c、增加流动相的脂溶性

d、调整流动相的pH值III、柱温

升高柱温Ⅳ、样品液的制备是定量分析工作是否成功的关键两大类：溶剂萃取法、色谱分离法2、HPLC法第33页，共39页，2023年，2月20日，星期一3、

GC法：适于有挥发性，遇热不分解的生物碱类如麻黄碱、苦参碱和颠茄类生物碱例：洁尔阴洗剂中苦参碱的测定4、其他测定方法（二）单体生物碱的含量测定第34页，共39页，2023年，2月20日，星期一五、应用实例1、含小檗碱的中药制剂分析

(1)万氏牛黄清心丸

TLC法鉴别盐酸小檗碱UV法/一阶导数光谱法测定盐酸小檗碱

(2)安宫牛黄丸

HPLC法测定盐酸小檗碱

(3)香连丸

HPLC法

第35页，共39页，2023年，2月20日，星期一五、应用实例2、含麻黄碱的中药制剂分析

麻黄碱性质：挥发