污染控制微生物学

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第七章微生物生长繁殖

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生长和繁殖统称为发育，发育是一个复杂生命活动。当微生物吸收营养物质后，经过合成代谢作用，合成新细胞成份，使菌体重量增加(主要是原生质和其它组成成份有规律地增加)，菌体体积长大，这种现象称为生长。细胞生长是有程度，当细胞增加到一定程度时就开始分裂，这种菌体数量增多现象称为繁殖。生长是繁殖基础，繁殖是生长结果。生长和繁殖虽有区分，但关系十分亲密。微生物群体在生长过程中，个体细胞体积和重量改变不易被觉察，所以，常以细胞数量增加或以细胞群体重量增加作为生长繁殖指标。污染控制微生物学第3页微生物纯培养生长

微生物学中将在试验室条件下，从一个细胞或一个细胞群繁殖得到后代称为纯培养。相对应称为不纯培养物。纯培养分离方法稀释倒平皿法将待分离材料作一系列稀释(如1:10、1:100、1:1000、1:10000…)，取不一样稀释液各少许与已熔化并冷却至45℃琼脂培养基相混合，倾入灭过菌培养皿中，待琼脂培养基凝固后，保温培养一定污染控制微生物学第4页微生物纯培养生长

时间，即有菌落出现。假如稀释得当，平皿中出现分散单个菌落便可能是由一个细菌繁殖所形成。挑取此单个菌落或再重复以上操作数次，可得到纯培养。污染控制微生物学第5页微生物纯培养生长划线法将熔化琼脂培养基倾入无菌培养皿中，冷凝后，用接种环NFDCB取少许待分离材料，在培养基表面连续划线，如，可作平行划线、扇形划线或其它形式连续划线，伴随接种环在培养基上移动，细菌得以分散，经保温培养即形成菌落。在划线开始个别，细菌分散度小，形成菌落往往连在一起。但因为连续划线，细菌逐步降低，划到最终常可形成单独孤立菌落。污染控制微生物学第6页微生物纯培养生长

这种单独菌落可能是由单个细胞形成，因而取得纯培养。用其它工具如形玻棒代替接种环在琼脂培养基表面涂布，亦可得到一样结果。污染控制微生物学第7页微生物纯培养生长单细胞挑取法单细胞挑取法是从待分离材料中只挑取一个细胞来培养。可用一台显微挑取器，装置于显微镜上，把一滴细菌悬浮液置于载玻片上，用装于显微挑取器上极细毛细吸管，在显微镜下对准一个单独细菌细胞挑取，再接种于培养基上培养而得纯培养。污染控制微生物学第8页微生物纯培养生长利用选择培养基分离法不一样细菌需要不一样营养物。所以，能够把培养基配制成适合于某种细菌生长而限制其它细菌生长环境。这么选择培养基可用来分离培养纯种。也能够将待分离样品先进行适当处理，以排除不需要微生物。比如，想分离得到芽孢细菌，可在倒平皿前将样品在高温处理一段时间，以破坏全部或大个别非芽孢细菌，这么分离得到菌落将是芽孢形成菌。污染控制微生物学第9页微生物纯培养分离方法比较方法应用范围稀释倒平皿法即可定性，又可定量，用途广泛划线法方法简便，多用于分离细菌单细胞挑取法局限于高度专业化研究利用选择培养基分离法适适用于分离一些生理类型较特殊微生物污染控制微生物学第10页微生物纯培养生长微生物生长量测定主要有测定微生物数量、重量和细胞物质成份等方法。测定微生物数量

1.全数测定(直接计数法)(1)计数器直接计数法

(2)涂片染色计数

(3)比浊法污染控制微生物学第11页微生物纯培养生长污染控制微生物学第12页微生物纯培养生长2.活菌计数(间接计数法)(1)平板计数法

(2)薄膜过滤计数法污染控制微生物学第13页微生物纯培养生长测定细胞物质重量

采取干重法，用离心或过滤方法将菌体从菌悬液中分离出来，洗净，烘干，称重，求得单位容积菌悬液中细胞干重。这是测定细胞重量较为直接而可靠方法，但只适合用于菌体浓度较高样品，而且要求样品中不含菌体以外其它干物质。在活性污泥法中常采取干重法来测定活性污泥重量，以近似代表活性污泥中微生物量，这一指标称为活性污泥浓度(符号为MLSS)，它表示每升活性污泥混合液中活性污泥毫克数。这种测定结果既包含活菌和死菌量，又包含有机颗粒和无机盐类重量，因而，这一指标随非生物物质含量增加，可靠性降低。污染控制微生物学第14页微生物纯培养生长DNA含量测定法因为DNA在细胞生长中起主要作用，所以，测定DNA含量也是研究微生物生长一个主要化学测定方法。DNA测定不但能够反应细胞物质重量，而且因为每个细菌细胞中DNA含量对于某类群微生物来说较恒定(平均为8.4×10-5ｍｇ)，所以，经过测定细菌DNA还可推算出细菌细胞数量。另外，还可采取测定ATP方法，但因为细胞内ATP含量随发育阶段不一样而改变较大，因而，用于反应微生物量不如DNA佳。污染控制微生物学第15页微生物生长曲线细菌纯培养生长曲线研究细菌纯培养生长曲线是采取分批培养，或称为间歇培养(batchculture)。分批培养就是在一定体积液体培养基中接种少许细菌并保持一定条件(如温度、pH、溶解氧等)进行培养，结果出现了细菌数量由少到多，并到达高峰，又由多变少改变规律。测定生长曲线时，将少许经纯培养细菌接种到经灭菌液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样测定细菌数量。以细菌数对数为纵坐标，生长时间为横坐标，可得图所表示曲线。污染控制微生物学第16页污染控制微生物学第17页微生物生长曲线迟缓期(lagphase)

迟缓期又称滞留适应期。当菌种接种到新鲜培养基后，细菌并不马上生长繁殖，而要经过一段时间调整和适应，以合成各种酶，并完善体内酶系统和细胞其它成份。在这个时期，细胞代谢活力很强，蛋白质和RNA含量增加，菌体体积显著增大。在迟缓期末，细菌长度可达接种时6倍。迟缓期末期和对数期前期细胞，对热、化学物质等不良条件抵抗力减弱。细菌生长曲线能够分为四个时期污染控制微生物学第18页微生物生长曲线

迟缓期连续时间长短随菌种特征、接种量、菌龄与移种至新鲜培养基前后所处环境条件是否相同等原因相关，短只几分钟，长可达几小时。假如用对数期细菌接种到相同培养基上，并在同一温度下培养，细菌则仍以原来生长速度继续对数生长，而不会出现迟缓期，因而能够缩短培养时间。污染控制微生物学第19页微生物生长曲线对数期(logphase)

迟缓期末，细胞开始出现分裂，培养液中菌数增加，进入对数期。在此时期，以细菌数对数与培养时间做图则成一直线。对数期细菌按几何级数增加，1→2→4→8→…，即20→21→22→23→…2n。每分裂一次为一个世代，每经过一个世代，群体数目增加一倍。可见，细菌群体生长是按指数速率进行，因而亦称做指数增加。细菌群体这种指数增加可用以下方程式表示污染控制微生物学第20页微生物生长曲线

细菌群体这种指数增加可用以下方程式表示：Ｘ2=Ｘ1·2ｎ式中：Ｘ1、Ｘ2——分别为时间ｔ1和ｔ2时刻细胞数；ｎ——世代数。世代时间是由遗传性决定，不一样菌种对数期世代时间不一样，同一菌种世代时间受培养基组成及物理环境影响也不一样。对数期细菌生长速度到达高潮，世代时间最短，细胞代谢活性比较稳定，酶活力也高。这个时期细胞是作为研究工作理想材料。污染控制微生物学第21页微生物生长曲线稳定时(stationaryphase)

因为在生长过程中，营养物质不停被消耗，同时，一些有毒性代谢产物不停积累，致使细菌分裂速率降低，世代时间延长，细菌细胞活力减退。这时，群体中细菌繁殖速度与死亡速度近乎相等，活菌数目保持稳定。处于稳定时细胞开始积累体内贮藏物质，如肝糖粒、淀粉粒、异染颗粒等，研究认为，此时菌胶团细菌大量分泌体外贮藏物质荚膜，所以，更易形成菌胶团。大多数产芽孢细菌在此时期开始产生芽孢。污染控制微生物学第22页微生物生长曲线衰亡期(deathphase)

此期环境变得更不适于微生物生长，细胞活力继续衰退，死亡率大于繁殖率，活菌数快速降低。在衰亡期中细胞形状和大小很不一致，有些产生畸形细胞，细菌生命活动主要依赖于内源呼吸，并展现大量死亡。微生物生长曲线反应一个微生物在一定生活环境中生长繁殖和死亡规律。它既可作为营养和环境影响理论研究指标，亦可作为调控微生物生长发育依据，指导微生物生产实践。污染控制微生物学第23页微生物生长曲线污染控制微生物学第24页微生物生长曲线连续培养研究细菌纯培养生长曲线是采取分批培养，或称为间歇培养(batchculture)。分批培养就是在一定体积液体培养基中接种少许细菌并保持一定条件(如温度、pH、溶解氧等)进行培养，结果出现了细菌数量由少到多，并到达高峰，又由多变少改变规律。测定生长曲线时，将少许经纯培养细菌接种到经灭菌液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样测定细菌数量。以细菌数对数为纵坐标，生长时间为横坐标，可得图所表示曲线。污染控制微生物学第25页

连续培养：是一个让新鲜培养基不停流入，失效培养基不停流出，以维持培养基组成对应稳定、防止代谢产物积累，从而使对数生长久能较长时间维持下去一个培养方法。装置：培养基贮存系统、新鲜培养基流入系统、培养物流出系统和控制系统。

目标：培养物密度或培养基化学组成维持在一定水平上微生物生长曲线污染控制微生物学第26页连续培养装置类型

连续培养装置有两种类型：恒化器连续培养装置

恒浊器连续培养装置常见一个连续培养方法为恒化连续培养。

微生物生长曲线污染控制微生物学第27页微生物生长曲线污染控制微生物学第28页恒化器连续培养装置

经过控制培养基中某种限制性营养物质浓度在一定范围内改变，以控制机体生长速率改变，从而控制新鲜培养基流入速率。当某种营养物质浓度低于或高于原定范围时，就会经过控制系统，调整培养基流入速率，以提升或降低这种物质浓度，从而使微生物生长速率维持一定，确保连续培养正常进行。

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在这种装置中，微生物生长速度能够经过调整限制性底物浓度或培养基流速加以控制。通常只需要限制某一个底物(如氮源或能源)浓度，就能够调整生长速度。污染控制微生物学第30页活性污泥增加曲线在废水生物处理中，为了描述活性污泥中微生物生长，常采取间歇培养法取得图所表示曲线。活性污泥中微生物种类繁多，不但包含细菌，而且还含有原生动物和后生动物等微生物，所以，不是纯培养生长曲线，但曲线形式与纯培养类似。活性污泥增加曲线能够分为三个时期：对数生长久、减速生长久和内源呼吸期。微生物生长曲线污染控制微生物学第31页对数生长久

此期，微生物处于营养物质过剩环境中，微生物以最大速率氧化分解废水中有机物，并合成新细胞物质，所以，微生物快速增加。这一时期相当于纯培养生长曲线中对数期。在此期间，活性污泥微生物含有很高能量水平，因而不能形成良好活性污泥絮凝体。

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在对数生长久，活性污泥微生物增加速率普通可用下式表示：式中：X——ｔ时刻挥发性活性污泥浓度(MLVSS)，

(也可由活性污泥浓度MLVSS代替)；

K1——挥发性活性污泥增加速度常数。微生物生长曲线污染控制微生物学第33页减速生长久此期营养物质不再过剩，而且成为微生物深入生长限制原因。科学试验表明，此时有机底物去除率与存在有机底物浓度成正比。式中：S——某一时间ｔ时有机底物浓度；

K2——有机底物降解常数。微生物生长曲线污染控制微生物学第34页内源呼吸期此时营养物质近乎耗尽，所以活性污泥微生物靠内源呼吸维持生命活动，并使活性污泥量降低。因为能量水平低，絮凝体形成速率增加，吸附有机