蛋白质组学专业讲座

蛋白质组学专业讲座蛋白质组学专业讲座第1页背景基因数量有限性和基因结构相对稳定性VS生命现象复杂性和多变性从genomic到proteome蛋白质组学专业讲座第2页对蛋白质数量、结构、性质、相互关系和生物学功效进行全方面深入研究已成为生命科学研究迫切需要和主要任务。蛋白质组学专业讲座第3页Theeraof‘omics’-basedscienceGenomics（基因组学）Post-genomicscience（后基因组时代）Functionalgenomics（功效基因组学）Transcriptomics（转录组学）Proteomics（蛋白质组学）Metabolomics（代谢组学）Structuralgenomics（结构基因组学）Aim-3Dstructuresofallproteinfolds!蛋白质组学专业讲座第4页

第一节蛋白质组学概念及发展进展第二节蛋白质组表示模式研究方法第三节蛋白质组功效模式研究方法

主要内容蛋白质组学专业讲座第5页

第一节蛋白质组学概念及发展进展

蛋白质组学专业讲座第6页蛋白质组（proteome）：PROTEins+genOME，意思是Proteinsexpressedbyagenome（基因组表示全部蛋白质）。1994年由Williams和Wilkins提出，是一个动态概念，指是不一样细胞在不一样时相表示不一样蛋白质。蛋白质组和蛋白质组学概念蛋白质组学专业讲座第7页对应于基因组全部蛋白质组成整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不一样细胞、不一样组织中表示情况各不相同。在空间和时间上动态改变着整体。蛋白质组：蛋白质组学专业讲座第8页蛋白质组学(proteomics)

指应用各种技术伎俩来研究蛋白质组一门新兴科学，其目标是从整体角度分析细胞内动态改变蛋白质组成成份、表示水平与修饰状态，了解蛋白质之间相互作用与联络，揭示蛋白质功效与细胞生命活动规律。

蛋白质组学专业讲座第9页主要研究内容

了解某种特定细胞、组织或器官制造蛋白质种类；

明确各种蛋白质分子是怎样形成类似于电路网络；

描绘蛋白质准确三维结构，揭示其结构上关键部位，如与药品结合而且决定其活性部位。

蛋白质组学专业讲座第10页表示蛋白组学ThestudyofglobalchangesinproteinexpressionProteomics蛋白质组功效模式

Thesystematicstudyofprotein-proteininteractionsthroughtheisolationofproteincomplexes蛋白质组研究包含两个方面：蛋白质组学专业讲座第11页蛋白质组学专业讲座第12页

基因组转录组蛋白组ThestudyofproteinsexpressedbygenomesCompletionofthesequencingofthe1stdraftofhumangenomeindicatesthereareapproximately250,000proteinsinthehumangenomeOnly2-5%ofproteinsinhumangenomehavebeenidentified蛋白质组学专业讲座第13页蛋白质组学专业讲座第14页功效蛋白质组学

(functionalproteomics)提出

功效蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关全部蛋白质。介于对个别蛋白质传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象蛋白质组学之间。

蛋白质组学专业讲座第15页从局部入手研究蛋白质组各个功效亚群体。将多个亚群体组合起来，逐步描绘出靠近于生命细胞“全部蛋白质”蛋白质组图谱。蛋白质组学专业讲座第16页发展进展各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（AustraliaProteomeAnalysisFacility，APAF）

蛋白质组学专业讲座第17页美国国立癌症研究院（NCI）投资1000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤蛋白质组数据库。NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不一样阶段蛋白质组数据库。英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序生物体进行蛋白质组研究。蛋白质组学专业讲座第18页

Celera企业投资上亿美元独自开启了全方面判定和分类汇总人类组织、细胞和体液中蛋白质及其异构体，构建新一代蛋白质表示数据库工作。蛋白质组学专业讲座第19页

1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议

1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议

1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议蛋白质组学专业讲座第20页

我国也于1998年开启了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举行了两次全国性蛋白质组学研讨会

蛋白质组学专业讲座第21页

成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于年9月、年8月以及年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。

蛋白质组学专业讲座第22页

科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大进展。蛋白质组学专业讲座第23页第二节蛋白质组表示模式研究方法蛋白质组学专业讲座第24页研究蛋白质组组成成份、差异和功效主要研究目标蛋白质组学专业讲座第25页（一）蛋白质组研究中样品制备

通常可采取细胞或组织中全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也能够进行样品预分级，即将细胞或组织中全体蛋白质分成不一样个别，分别进行研究。蛋白质组学专业讲座第26页样品预分级主要方法蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等

蛋白质组学专业讲座第27页

样品预分级主要作用在于提升低丰度蛋白质上样量和检测灵敏度。蛋白质组学专业讲座第28页组织水平上蛋白质组样品制备

临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。蛋白质组学专业讲座第29页激光捕捉显微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)

可直接在显微镜下从组织切片中准确分离特定细胞或细胞群。

蛋白质组学专业讲座第30页（二）蛋白质组研究中样品分离双向凝胶电泳two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)：利用蛋白质等电点和分子量，结合凝胶化学特征，分离各种蛋白质方法。蛋白质组学专业讲座第31页蛋白质组学专业讲座第32页蛋白质组学专业讲座第33页特点可分离10～100kD分子量蛋白质高灵敏度和高分辨率便于计算机进行图像分析处理与质谱分析匹配蛋白质组学专业讲座第34页2-DE技术缺点

极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。

胶内酶解过程费时、费劲，难于与质谱联用实现自动化。蛋白质组学专业讲座第35页新型非凝胶技术

液相色谱法liquidchromatography，LC毛细管电泳capillaryelectrophoresis，CE蛋白质组学专业讲座第36页

（三）常见蛋白质显色技术

考马斯亮蓝染色

蛋白质组学专业讲座第37页常见显色方法比较蛋白质组学专业讲座第38页考染和银染比较蛋白质组学专业讲座第39页蛋白质组学专业讲座第40页蛋白质组学专业讲座第41页有机染料和银染考染灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍；银染线性范围是40倍，灵敏度是考染100倍。胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE无背景染色，其极限灵敏度为8~10ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析结果。胺基黑常见于转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纤维素膜上蛋白质染色。银染缺点是：对一些种类蛋白质染色效果差，对其后蛋白质测序和质谱分析造成影响。这两种染色技术都可降低胶内蛋白质产量。蛋白质组学专业讲座第42页负染能专门提升PAGE胶上蛋白质回收率，但不能用于膜上染色。结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。速度快（5~15min），蛋白质生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。它主要适合用于蛋白质显色、完整蛋白质胶上被动提取以及质谱分析。该技术主要包含金属盐染料、锌－咪唑染料等使用。蛋白质组学专业讲座第43页胶体扩散染料主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上蛋白质，不用于胶内染色。最好胶体金染色灵敏度与PAGE胶内银染类似。这种技术主要包含印度墨水染料、胶体金属染料等。蛋白质组学专业讲座第44页有机荧光团染料包含共价结合和非共价结合荧光团染料两类。后者最为常见，其经典代表是已经商品化SYPRORed、Orange、Ruby等荧光染料。这三种染料可对SDS胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成，灵敏度为2~10ng。染色后凝胶用标准试验室300nm紫外透射仪进行照像保留，其线性范围为3个数量级。这三种染料电泳染色结果与在酵母中经过SAGE所取得基因表示水平动态范围相匹配。在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来判定蛋白质。蛋白质组学专业讲座第45页金属螯合染料这是一类与当代蛋白质组学研究相兼容、相对较新蛋白质显色试剂，其设计专门与常见微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很轻易和集成化蛋白质组学平台（包含自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合。其中SYPRORuby也是一个基于钌金属发光染料。蛋白质组学专业讲座第46页（四）凝胶图像处理分析和胶内酶切凝胶图像扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递和解释：2-DE数据库建立：蛋白质组学专业讲座第47页蛋白质组学专业讲座第48页当前有各种图像分析软件可用于胶图像分析:

MelanieII(BioRad),PDQuest(BioRad),Phoretix2DFull,(AmershamPharmaciaBiotech)ImageMaster2dPlatinum这些软件能够完成蛋白质点识别、匹配等，含有很强分析功效，但其缺点是需要很多图像手工校对，蛋白质组学专业讲座第49页蛋白质组学专业讲座第50页蛋白质组学专业讲座第51页正常肝细胞和肝癌细胞蛋白质组双向电泳差异表示谱园点标识点为二者差异蛋白数字号码为蛋白质点在参考胶中索引号蛋白质组学专业讲座第52页蛋白质胶内酶切

包含感兴趣蛋白点挖取、含蛋白质凝胶脱色、胶内蛋白质酶切等过程蛋白质组学专业讲座第53页蛋白质组学专业讲座第54页（五）质谱分析样品分子离子化后，依据不一样离子间质核比（m/z）差异来分离并确定分子量定性定量质谱m/z离子化蛋白质组学专业讲座第55页原理质谱分析是先将物质离子化，按离子质荷比分离，然后测量各种离子谱峰强度而实现分析目标一个分析方法。蛋白质组学专业讲座第56页20世纪初20世纪40年代20世纪60年代20世纪80年代J.J.Thomson制成第一台质谱仪主要是用来进行同位素测定和无机元素分析开始用于有机物分析出现了气相色谱-质谱联用仪成为有机物分析主要仪器质谱新技术：电喷雾电离源，大气压化学电离源液相色谱-质谱联用仪感应耦合等离子体质谱仪质谱技术发展过程蛋白质组学专业讲座第57页SirJosephJohnThomson-1906年诺贝尔物理奖

主要贡献：气态下离子导电理论和试验探索

FrederickSoddy-1921年诺贝尔化学奖

主要贡献：使咱们对放射活性物质认识大大提升，另外他对同位素起源和性质也作了出众工作。

FrancisWilliamAston-1922年诺贝尔化学奖

主要贡献：使用质谱方法大规模研究非放射性元素同位素；提出整数规则。

HansG.DehmeltandWolfgangPaul-1989年同获诺贝尔物理奖

主要贡献：开发了离子阱质谱技术。

RobertF.CurlJr.&SirHaroldW.Kroto&RichardE.Smalley-1996年分享诺贝尔化学奖

主要贡献：使用质谱发觉富洛伦尼斯（C60-C80，足球烯）

JohnFennandKoichiTanakawithKurtWuthrich-年分享诺贝尔化学奖

主要贡献：发展了可用于分析生物大分子软电离方法。质谱相关工作成就蛋白质组学专业讲座第58页离子源（Ionsource）质谱仪离子源种类主要有：化学电离源(ChemicalIonization,CI)快原子轰击源（FastAtomicbombardment,FAB）

电喷雾源(ElectronsprayIonization，ESI)大气压化学电离源(AtmosphericpressurechemicalIonization,APCI)大气压光学电离源（Atmosphericpressurephotoionization,APPI）基质辅助激光解吸电离源（MALDI-TOF）电子电离源(ElectronIonizationEI)

蛋白质组学专业讲座第59页每一个电离方法都有一定分子量检测范围

EI/CIESI/FABAPPIAPCIMW100,00010,000100010010PolarityVeryPolarNonpolar蛋白质组学专业讲座第60页电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于80年代末期两项轨电离技术。这两项技术出现使传统主要用于小分子物质研究质谱技术发生了革命性变革。它们含有高灵敏度和高质量检测范围，使得在pmol水平上准确地分析分子量高达几万到几十万生物大分子成为可能，并得到快速发展。被称做是“软”电离技术，因为：他们在离子化过程中不会破坏分子结构，能实现分子量大于10,000质量单位生物大分子质量分析蛋白质组学专业讲座第61页横坐标为离子质核比，纵坐标为离子相对强度或相对丰度。乙醇以下：质谱图蛋白质组学专业讲座第62页（六）蛋白质序列测定主要有两种方法：数据库搜索(Sequencedatabasesearch):

从头算法(Denovointerpretation)蛋白质组学专业讲座第63页两种方法各自特点数据库搜索算法将试验质谱与由数据库中肽序列得到理论质谱相关联,得到候选肽序列,它对质谱质量要求不高,能够判定复杂蛋白质样品,前提是待判定蛋白质样品序列存在于数据库中.从头算法利用试验质谱中谱峰之间质量差直接计算出肽序列,不需要数据库辅助,能够判定数据库中不存在新序列,不过它需要相对高质量质谱数据蛋白质组学专业讲座第64页瑞士SWISS-PROT数据库拥有当前世界上最大、种类最多蛋白质组数据蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平标志和基础蛋白质组学专业讲座第65页MascotSearchEngine蛋白质组学专业讲座第66页MascotMS/MSIonsSearch蛋白质组学专业讲座第67页蛋白质组学专业讲座第68页蛋白质组学专业讲座第69页蛋白质组学专业讲座第70页蛋白质组学专业讲座第71页蛋白质组学专业讲座第72页蛋白质组学专业讲座第73页蛋白质组学专业讲座第74页蛋白质组学专业讲座第75页蛋白质组学专业讲座第76页第三节蛋白质组功效模式研究方法蛋白质组学专业讲座第77页揭示蛋白质组组员间相互作用、相互协调关系，并深入了解蛋白质结构与功效相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功效关系。

主要研究目标

蛋白质组学专业讲座第78页（一）蛋白质翻译后修饰研究翻译后修饰糖基化乙酰化甲基化羧基化二硫键蛋白质组学专业讲座第79页（二）蛋白质相互作用研究技术生命基础过程是不一样功效蛋白质在时空上有序和协同作用新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现细胞信号转导及病原体感染和免疫反应蛋白质组学专业讲座第80页1989年Field和Song等人在酵母细胞中设计分析蛋白质相互作用方法。以真核细胞转录激活因子结构和活性特点为基础。1．酵母双杂交系统（yeasttwo-hybridsystem）

蛋白质组学专业讲座第81页

转录激活因子GAL4特点N端含NLS和与酵母GAL1基因开启子上游激活序列(UASG)结合结构域C端含GAL1转录激活结构域蛋白质组学专业讲座第82页功效上相互独立又相互依赖，只有经过某种方式结合在一起才含有完整转录因子活性蛋白质组学专业讲座第83页系统构建分别构建含GAL4BD和AD两个酵母融合蛋白表示载体；建立含特殊基因型、适合用于双杂交体分析酵母菌株

蛋白质组学专业讲座第84页蛋白质组学专业讲座第85页酵母双杂交技术基础原理蛋白质组学专业讲座第86页主要特点和优势使蛋白质表现型和基因型相联络筛选cDNA文库真实反应体内蛋白质间相互作用情况不需分离靶蛋白敏感性高蛋白质组学专业讲座第87页缺点1.假阳性结果2.假阳性结果3.限于核内表示蛋白质相互作用

蛋白质组学专业讲座第88页

2．基于质谱蛋白质相互作用研究方法靶蛋白制备

蛋白质复合体纯化

蛋白质复合体质谱判定基础步骤：蛋白质组学专业讲座第89页（1）亲和层析耦联质谱技术

基础原理：将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用蛋白质细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合在柱子上蛋白质，最终用多维液相色谱耦联质谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）判定靶蛋白结合蛋白。

蛋白质组学专业讲座第90页先决条件得到足够多保持生物活性重组靶蛋白作为诱饵（bait）取得足够量、纯度高与诱饵相互作用蛋白质蛋白质组学专业讲座第91页主要优点

灵敏度高：高浓度靶蛋白候选蛋白质与靶蛋白结合机会均等

检测多亚基蛋白质之间相互作用

蛋白质组学专业讲座第92页（2）免疫共沉淀耦联质谱技术

原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱判定靶蛋白结合蛋白。

蛋白质组学专业讲座第93页研究鼻咽癌细胞系中p53

相互作用蛋白抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀SDS分离免疫沉淀复合物切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到对应肽序列标签搜索数据库蛋白质组学专业讲座第9