工业微生物医学宣教专家讲座

第四章

病毒工业微生物医学宣教专家讲座第1页本章内容第一节概述第二节病毒形态结构与化学组成第三节噬菌体第四节真核细胞病毒第五节亚病毒第六节病毒与发酵工业工业微生物医学宣教专家讲座第2页第一节概述一、病毒发觉和研究历史二、病毒定义与特点三、病毒分类四、病毒培养与纯化工业微生物医学宣教专家讲座第3页病毒和我们关系

“Virus”，它是由拉丁文中“virus”一词演化而来，即“有毒物质”

工业微生物医学宣教专家讲座第4页第一节概述一、病毒发觉和研究历史1886年，A.Mayer发觉含有传染性烟草花叶病；1892年，D.Ivanovsky烟草花叶病病原体能经过细菌滤器：一个能经过细菌滤器“细菌毒素”或“极小细菌”1898年，MWBeijerinck对烟草花叶病病原体研究结果：

能经过细菌滤器；可被乙醇沉淀而不失去其感染性，能在琼脂凝胶中扩散；用培养细菌方法不能被培养出来，推测只能在植物活细胞中生活比细菌小含有传染性活流质（contagiumvivumfluidum）1884年Chamberland创造细菌滤器

工业微生物医学宣教专家讲座第5页1900年前后，包含口蹄疫（footandmouthdisease）在内各种动植物疾病病原体滤过性特征被证实。FWTwort（1915年）、Fd’Herelle（1917年），分别发觉细菌（Shigelladysenteriae）病毒----噬菌体1935年，WMStanley首次提纯并结晶了烟草花叶病毒；

Bawden等证实烟草花叶病毒本质为核蛋白；1940年，Kausche首先用电镜观察到烟草花叶病毒颗粒.1952年，Hershey和Chase利用同位素证实噬菌体遗传物质是DNA，将人类带入病毒分子生物学阶段。工业微生物医学宣教专家讲座第6页极大地丰富了当代生物学（微生物学、分子生物学、分子遗传学）理论与技术；病毒学（virulogy）：

研究病毒（virus）本质及其与宿主相互作用科学，是微生物学主要分支学科。有效地控制和毁灭人及有益生物病毒病害；利用病毒对有害生物、尤其是害虫进行生物防治；发展以基因工程为中心生物高新技术产业；工业微生物医学宣教专家讲座第7页非细胞生物最少含核酸和蛋白质二种组分亚病毒真病毒类病毒拟病毒朊病毒只含有不具侵染性RNA组分只含蛋白质组分只含具侵染性RNA组分本章主要介绍真病毒二、病毒定义与特点

病毒：是一个结构简单，能够自我复制并含有侵染性独特非细胞生物体。当代病毒学家把病毒这类非细胞生物分成真病毒（Euvirus，简称病毒）和亚病毒（Subvirus）两大类：工业微生物医学宣教专家讲座第8页

病毒是一类既含有化学大分子属性，又含有生物体基本特征；既含有细胞外感染性颗粒形式，又含有细胞内繁殖性基因形式独特生物类群。病毒分两个阶段（以两种形式）存在：胞外阶段：“毒粒”形式存在，可抵抗几乎全部酶侵袭，但不能独立于活细胞增殖；胞内阶段：主要以正在复制核酸形式存在，诱导宿主细胞合成病毒组分；毒粒：完整病毒粒子（virion），由蛋白外壳包裹一个或多个DNA或RNA分子组成工业微生物医学宣教专家讲座第9页特征1）个体微小，在电子显微镜下才能看见；2）不含有细胞结构，其主要成份为核酸和蛋白质，故称为“分子生物”；3）一个病毒只含有DNA或RNA一个类型核酸；4）绝正确细胞内寄生，在细胞外不能增殖：既无产能酶系，也无蛋白质和核酸合成酶系，只能利用宿主活细胞内现成代谢系统合成本身核酸和蛋白质；5）没有个体生长，不能进行细胞分裂，以核酸复制和蛋白质合成、然后装配过程实现其大量繁殖；7）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。6）在离体条件下，以无生命生物大分子状态存在，并保持其侵染性；工业微生物医学宣教专家讲座第10页三、病毒分类病毒几乎能够感染全部细胞生物，并含有宿主特异性。人们习惯依据其宿主种类将病毒分类：噬菌体（phage）真菌病毒（fungiviruses）植物病毒（plantviruses）动物病毒（animalviruses）国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeforTaxonomyofViruses,ICTV）提出了分类依据和建立了分类系统。分类依据核酸特征、壳体对称形式、有没有包膜、宿主种类、引发疾病种类、复制和释放方式等。命名规则1996年国际病毒分类委员会提出38条新病毒命名规则，病毒分类系统依次用目、科、属、种分类等级。工业微生物医学宣教专家讲座第11页1）噬菌体培养1、病毒培养(二元培养物法)四、病毒培养和纯化噬菌斑（plaque）：

将少许噬菌体与大量宿主细胞混合后，在适当条件下培养一定时间后，在平板表面充满宿主细胞菌苔上，出现一个个肉眼可见透明小圆斑。（“负菌落”）

设0.10mL稀释度为10-6病毒悬液可产生75个噬菌斑，则样品噬菌斑形成单位为：PFU/mL=（75PFU/0.10mL）×（106）=7.5×108工业微生物医学宣教专家讲座第12页2）动物病毒培养动物病毒试验动物鸡胚各种细胞培养在尿囊膜上形成一些白色庖痘（感染造成局部组织病损）感染工业微生物医学宣教专家讲座第13页若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养细胞单层上形成肉眼可见局部病损区域，即蚀斑（plaque）或称空斑。工业微生物医学宣教专家讲座第14页包涵体（inclusionbody）：

在一些感染病毒宿主细胞质或细胞核内，出现光学显微镜下可见大小、形状和数量不等小体。多数位于细胞质内，如：痘病毒、狂犬病毒少数位于细胞核内，如：疱疹病毒和腮腺炎病毒有既可在细胞质内，又可在细胞核内，如：麻疹病毒

包含体能够是病毒粒子聚集体，如昆虫核型多角体病毒和质型多角体病毒包含体；也能够是病毒结构蛋白与感染相关蛋白质等病毒组分聚集体多角体：

核型多角体病毒（NPV）：是我国自主研究并应用于农业实践第一个病毒杀虫剂。昆虫细胞内形成多角形包涵体，可作为病毒杀虫剂。工业微生物医学宣教专家讲座第15页植物病毒敏感植物叶片被感染部位细胞快速死亡而形成局部坏死斑，或称枯斑即便没出现坏死斑，被感染植物仍会表现一定病症，如色素形成和叶子形状改变等。3）植物病毒培养工业微生物医学宣教专家讲座第16页（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）2、病毒纯化标准：纯化病毒制备物应保持其感染性，纯化病毒制备物理化性质应含有均一性方法：主要化学组成为蛋白质，采取蛋白质提纯方法

含有一定大小、形状和密度，采取离心差速离心、梯度离心（超速离心）工业微生物医学宣教专家讲座第17页一、病毒形态结构1、病毒形状和大小

个体小（测量单位nm），必需在电镜下观察；不一样病毒毒粒大小差异很大（10~400nm）（1）大小痘病毒：300~450nm×170~260nm（最大）双粒病毒：直径18~20nm（最小）第二节病毒形态结构与化学组成工业微生物医学宣教专家讲座第18页（2）病毒形态弹状（狂犬病毒）、砖块状（痘病毒）、丝状（大肠杆菌f1、fd、M13噬菌体）等多形性（流感病毒，新分离毒株呈丝状，在细胞内稳定传代后转变为拟球状）。基本形态：球形或拟球形（大多数动物病毒）；杆状（植物病毒和昆虫病毒）；蝌蚪状（大肠杆菌T偶数噬菌体）其它形态：工业微生物医学宣教专家讲座第19页各种毒粒大小、形态差异很大蝌蚪状（大肠杆菌T偶数噬菌体）砖块状（痘病毒）丝状（大肠杆菌M13）球状(脊髓灰质炎病毒)衣原体大肠杆菌红细胞杆状(TMV)工业微生物医学宣教专家讲座第20页基本结构：核衣壳(nucleocapsid)

非基本结构2.病毒基本结构关键（core）：DNA或RNA衣壳（capsid）：蛋白质包膜(envelope)：脂蛋白或类脂、糖蛋白刺突(spike)：糖蛋白关键衣壳包膜刺突衣壳粒（capsomere或capsomer）：是组成衣壳蛋白质亚单位工业微生物医学宣教专家讲座第21页3.几个经典病毒衣壳结构螺旋对称衣壳病毒：烟草花叶病毒病毒能够依据衣壳中衣壳粒排列方式将其分为3种：二十面体对称衣壳病毒：腺病毒

复合对称衣壳病毒：T4噬菌体工业微生物医学宣教专家讲座第22页

壳体外形如中空蛋白质圆管，呈坚硬或柔韧状。由2130个相同蛋白质亚基（158个氨基酸）以逆时针方向螺旋状排列，形成一个长300nm，内径4nm，外径15nm刚直中空柱。ssRNA盘绕在壳体内面由亚基形成沟内，与蛋白质亚基经过弱键结合。螺旋对称壳体病毒代表：TMV工业微生物医学宣教专家讲座第23页

并非全部螺旋对称衣壳都像TMV衣壳一样是刚直，流感病毒RNA就包围在薄、柔软易弯曲螺旋壳体内，其衣壳折叠在一起，外有包膜。流感病毒工业微生物医学宣教专家讲座第24页二十面体对称壳体病毒衣壳有20个等边三角形面，12个顶角。包含12个五邻体（分布在12个顶角上衣壳粒）和240个六邻体（分布在棱上和面上非顶角衣壳粒）。关键为线状双链DNA(dsDNA)，核酸分子以高度卷曲状态存在于衣壳内。代表：腺病毒五邻体六邻体二十面体衣壳在形成时通常是由五边形衣壳粒（五邻体）和六边形衣壳粒（六邻体）组成

工业微生物医学宣教专家讲座第25页（参见P74）

其壳体由头部和尾部组成。通常头部呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。线状dsDNA折叠盘绕于头部关键。复合对称衣壳病毒代表：大肠杆菌T偶数噬菌体头尾髓颈环尾鞘尾丝刺突基板工业微生物医学宣教专家讲座第26页1、病毒核酸病毒基因组大小差异很大最小基因组（MS2病毒，QB病毒）只有1×106Da，仅够编码3~4种蛋白质，这些病毒利用重合基因来节约空间。最大基因组（T偶数噬菌体，疱疹病毒，痘病毒）达1.6×108Da，可编码100各种蛋白质。二、病毒化学组成单链DNA（ssDNA）；双链DNA（dsDNA）；单链RNA（ssRNA）；双链RNA（dsRNA）4种类型动物病毒这4种类型都有；植物病毒通常含有ssRNA；噬菌体通常为dsDNA，但也有一些噬菌体为ssDNA或ssRNA。工业微生物医学宣教专家讲座第27页(1)DNA病毒dsDNA：大多数DNA病毒以dsDNA作为遗传物质。许多病毒dsDNA经过修饰,呈线性，少数为环状dsDNA。特殊碱基：除常见核苷酸外，许多病毒含有特殊碱基，如，大肠杆菌T偶数噬菌体以5-羟甲基胞嘧啶代替胞嘧啶。λ噬菌体线性dsDNA:有由12个氨基酸组成粘性末端，粘性末端配对可使DNA环化。ssDNA:少数，如ΦX174、M13噬菌体等，有线性和单链闭合环状DNA两种。工业微生物医学宣教专家讲座第28页(2)RNA病毒

多数RNA病毒以ssRNA作为它们遗传物质。正链或阳性链：RNA碱基序列与病毒mRNA相同，指导蛋白质合成。如：脊髓灰质炎病毒，等负链或阴性链：病毒RNA基因组与病毒mRNA互补。如：狂犬病毒，等。

片段基因组：许多RNA病毒基因组被分为独立片断，每个片段编码一个蛋白。有病毒基因组能够分为10到12个片段（如呼肠病毒），通常全部片段都包含在同一个衣壳中。不过，也有些病毒将片段基因分布在不一样病毒粒子中（如：雀麦花叶病毒），但它们能够成功地侵染同一宿主。

许多植物及动物病毒正链RNA基因组5’端含有7-甲基鸟嘌呤核苷帽子结构，3’末端含有poly-A尾巴。

一少部分病毒含有dsRNA基因组，都是片段式。工业微生物医学宣教专家讲座第29页2、病毒蛋白质衣壳蛋白：占病毒蛋白质成份绝大部分。保护核酸；当病毒无包膜结构时，衣壳参加病毒对宿主吸附、侵染；决定病毒对宿主专一性和病毒抗原性。包膜蛋白：包膜脂质和碳水化合物是正常宿主组成成份，但蛋白是由病毒基因编码形成，可伸出包膜形成刺突。存在于病毒中酶类：病毒酶位于衣壳内，其中许多酶参加核酸复制，比如，逆转录酶。也有些病毒酶位于包膜或衣壳上（比如，流感唾液酸苷酶），帮助病毒侵染。工业微生物医学宣教专家讲座第30页3、病毒其它化学成份

包膜中含有丰富磷脂和胆固醇、糖类，起源于宿主细胞；

少数无包膜病毒也存在脂类；

一些病毒粒子中存在有机阳离子（如丁二胺、精胺）和无机阳离子。工业微生物医学宣教专家讲座第31页第三节噬菌体一、噬菌体分类多数噬菌体能够按照其形态分为以下四类：无尾二十面体型收缩尾型（结构最复杂，比如E.coliT偶数噬菌体）非收缩尾型丝状噬菌体噬菌体分类依据：宿主种类、免疫学关系等。但当前最主要分类依据还是噬菌体形态和核酸特征。

噬菌体遗传物质能够是DNA，也能够是RNA，已知大部分噬菌体遗传物质是dsDNA。核酸形态工业微生物医学宣教专家讲座第32页二、噬菌体复制周期裂解性生活周期：DNA噬菌体在宿主细胞内复制后，宿主细胞裂解并释放新噬菌体。（E.coliT偶数噬菌体）（一）双链DNA噬菌体复制

1.一步生长试验

1）将适量噬菌体接种于培养好高浓度敏感细胞中，使每个敏感细胞至多只能吸附到一个噬菌体。2）使已吸附噬菌体建立同时感染（稀释或抗体沉淀）3）继续培养，定时取样，测定样品中病毒滴度。

病毒滴度（titer），又称效价，是指每毫升样品中含有侵染性病毒粒子数量。(双层平板法测)

工业微生物医学宣教专家讲座第33页

以感染时间为横坐标，病毒滴度为纵坐标，绘制订量描述烈性噬菌体生长规律试验曲线，称为一步生长曲线。潜伏期：是从噬菌体吸附于宿主细胞表面到子代噬菌体释放所需最短时间。包含：隐蔽（晦）期和胞内积累期。裂解量：是每个受侵染细胞所产生子代噬菌体数目。两个主要参数工业微生物医学宣教专家讲座第34页2.噬菌体复制过程（烈性噬菌体裂解周期）（1）吸附和侵入受体（吸附）位点：细胞壁上脂多糖、蛋白质、磷壁酸，以及鞭毛和菌毛

附着固着尾部收缩刺入细胞DNA注入T4噬菌体吸附和侵入宿主细胞过程：假如大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多小孔，也可引发细胞马上裂解，但并未进行噬菌体增殖，这种现象称为自外裂解（lysisfromwithout）。工业微生物医学宣教专家讲座第35页（2）噬菌体大分子合成早期mRNA

：宿主RNA聚合酶开始合成病毒mRNA，即噬菌体DNA复制前转录mRNA。早期蛋白：早期mRNA翻译成蛋白，这些蛋白将接管宿主细胞并合成病毒核酸。其中一些酶将宿主DNA降解成核苷酸，为病毒DNA合成提供原料；一些蛋白对宿主细胞RNA聚合酶进行修饰，使其识别病毒DNA开启子，开始转录合成中期mRNA。中期mRNA：即病毒DNA复制所需酶mRNA。

噬菌体DNA注入宿主细胞后，宿主细胞本身DNA、RNA和蛋白质合成便会中止，转而合成病毒复制所需成份。工业微生物医学宣教专家讲座第36页中期蛋白：中期mRNA翻译成蛋白(DNA复制所需酶、羟甲基胞嘧啶合成酶以及晚期mRNA聚合酶等)，病毒DNA开始复制(一些碱基修饰是抵制宿主限制)。多联体----合成T4噬菌体DNA含有末端冗余(重复一段碱基序列)，大约6-10个克隆经过末端冗余序列连接在一起，这种由若干单元同向相连形成超长链DNA称为多联体，多联体在装配过程中被切割。晚期mRNA：DNA复制完成后合成mRNA(指导结构蛋白、装配蛋白、溶菌酶等)。晚期蛋白：噬菌体结构蛋白、装配蛋白、溶菌酶等这些细胞裂解期间合成蛋白质。工业微生物医学宣教专家讲座第37页（3）噬菌体装配

T4噬菌体装配是一个极为复杂自我装配过程。大致分为4个独立路径：1）头部壳体装入DNA形成成熟头部2）由基板、尾管、尾鞘组装成无尾丝尾部；3）头部与尾部自发结合；4）装上尾丝头部衣壳粒DNA衣壳尾部尾鞘噬菌体尾丝工业微生物医学宣教专家讲座第38页（4）噬菌体释放37℃培养时，侵染约22分钟后，E.coli发生裂解并释放约300个T4噬菌体。这一过程需要一些T4基因支持：一个基因指导溶菌酶合成，溶菌酶能够攻击细胞壁肽聚糖；另一个噬菌体蛋白称为holin，它可破坏细胞膜，使溶菌酶抵达并破坏细胞壁，同时阻止细