蛋白质不稳定性专家讲座

第二章蛋白质不稳定性及对策刘耀玺河南科技大学林业职业学院生物技术教研室蛋白质不稳定性专家讲座第1页一、蛋白质失活机制依据蛋白质结构层次不一样，经常将蛋白质结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。蛋白质一级结构就是共价主链氨基酸序列，有时也称化学结构。二、三、四级结构又称空间结构（即三维结构）或高级结构。

蛋白质生物功效决定于它高级结构，高级结构是由一级结构即氨基酸序列决定。而氨基酸序列是由遗传物质DNA核苷酸序列决定。肽键（CO-NH）是连接多肽链主链中氨基酸残基共价键，二硫键（-S-S-）是使多肽链之间交联或使多肽链内成环共价键。

蛋白质不稳定性专家讲座第2页一、蛋白质失活机制蛋白质不稳定（失活）表现分为两种，即化学不稳定和物理不稳定。化学不稳定是指蛋白质分子经过共价键形成和断裂形成新化学实体；物理不稳定指蛋白质分子高级结构物理转变，无共价键改变。物理不稳定包含变性、聚集、沉淀和表面吸附。蛋白质一旦发生了化学不稳定，就会完全丧失其原有生理活性，产生新功效活性或完全丧失生物活性。但物理不稳定现象普通能够经过特定路径恢复其空间结构，而恢复原有活性，我们称这一过程为蛋白质复性。蛋白质不稳定性专家讲座第3页二、蛋白质结构中影响稳定性主要原因蛋白质天然折叠结构决定于3个原因：1、与溶剂分子（普通为水）相互作用；2、溶剂pH和离子组成；3、蛋白质氨基酸序列。前两个原因影响明确、易了解，而氨基酸序列作用则不那么直觉。实际上,一级结构便于序列上相邻部分之间短程相互作用形成，也便于相隔部分之间长程相互作用出现，即使蛋白质分子整个结构出看起来像是无组织随机排列，然而其结构中无例外地有各种力处于精细平衡之中，正是它决定了蛋白质独特构象。蛋白质不稳定性专家讲座第4页二、蛋白质结构中影响稳定性主要原因稳定蛋白质三维结构作用力主要是一些所谓弱相互作用或称非共价键或次级键，包含：氢键、范德华力、疏水作用和盐键（离子键）。另外，共价二硫键在稳定一些蛋白质构象方面也起着主要作用。这几个作用力键能（断裂该键所需能量）都是较低。蛋白质不稳定性专家讲座第5页二、蛋白质结构中影响稳定性主要原因氢键13-30KJ/mol-1范德华力4-8KJ/mol-1

疏水作用12-20KJ/mol-1（注意：疏水作用数值表示在25℃非极性侧链能够从蛋白质内部转移到水介质中所需自由能，它与其它键键能不一样，此数值在一定范围内随温度升高而增加。实际上它并不是键能，此能量大部分并不用于伸展过程中键断裂。）盐键12-30KJ/mol-1二硫键210KJ/mol-1蛋白质不稳定性专家讲座第6页二、蛋白质结构中影响稳定性主要原因（一）氢键：氢键在稳定蛋白质结构中起着极其主要作用，多肽主链上羰基和酰胺基之间形成氢键是稳定蛋白质二级结构主要作用力，另外，氢键还能够在侧链与侧链、侧链与介质水、主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。大多数蛋白质分子所采取折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目标分子内氢键（如α螺旋、β折叠），与此同时保持大多数能成氢键侧链处于蛋白质分子表面将与水结合。蛋白质不稳定性专家讲座第7页二、蛋白质结构中影响稳定性主要原因（二）范德华力（范德华相互作用）：广义范德华力包含3种较弱作用力，即：

定向效应：发生在极性分子或极性基团之间，它是永久偶极间静电相互作用，氢键可被认为属于这种范德华力；

诱导效应：发生在极性物质与非极性物质之间，这是永久性偶极与由它诱导而来诱导偶极之间静电相互作用；

分散效应：是在多数情况下起主要作用范德华力，它是非极性分子或基团间仅有一个范德华力，即狭义范德华力，通常所说范德华力指就是这种作用力。它是瞬时偶极间相互作用，偶极方向是瞬时改变。蛋白质不稳定性专家讲座第8页二、蛋白质结构中影响稳定性主要原因

瞬时偶极是因为所在分子或基团中电子电荷密度波动，即电子运动不对称性造成。瞬时偶极能够诱导周围分子或基团产生诱导偶极，诱导偶极反过来又稳定了原来偶极，所以它们之间产生了相互作用。狭义范德华力是一个很弱作用力，而且随非共价键合原子与分子间距离（R）6次方倒数而改变。即使就个别来说，范德华力是很弱，不过范德华相互作用数量大，而且含有加和效应和位相效应（当分子或集团相同时，其瞬间偶极矩同位相，从而产生最大相互作用），所以，就成为一个不可忽略作用力。蛋白质不稳定性专家讲座第9页二、蛋白质结构中影响稳定性主要原因（三）疏水作用：水介质中球状蛋白质折叠总是趋向于把疏水残基埋藏在分子内部，这一现象称为疏水作用或疏水效应。它在稳定蛋白质三级结构方面占有突出地位。疏水作用其实并不是疏水基团之间有什么吸引力缘故，而是疏水基团或疏水侧链出自避开水需要而被迫靠近。当然，当疏水基团靠近到等于范德华距离时，相互间将有弱范德华引力，但这不是主要。蛋白质溶液中熵增加是疏水作用主要动力。疏水作用在生理温度范围内随温度升高而加强，但超出一定温度后（50-60℃，因侧链而异），又趋减弱，因为超出这个温度，疏水基团周围水分子有序度降低，因而有利于疏水基团进入水中。非极性溶剂、去污剂是破坏疏水作用试剂，所以是变性剂。尿素和盐酸胍既能破坏氢键，又能破坏疏水作用，所以是强变性剂。蛋白质不稳定性专家讲座第10页二、蛋白质结构中影响稳定性主要原因（四）盐键：又称盐桥或离子键。它是正电荷与负电荷之间一个静电相互作用。在生理pH下,蛋白质中酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）侧链可离解成负离子，碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸和组氨酸）侧链可离解成正离子。在多数情况下这些基团都分布在球状蛋白质分子表面，而与介质水分子发生电荷-偶极之间相互作用，形成排列有序水化层，这对稳定蛋白质构象有着一定作用。带电荷侧链也在蛋白质分子内部出现，它们普通与其它基团形成强氢键，不过偶然也有少数带相反电荷侧链在分子疏水作用内部形成盐键。在疏水环境中，介电常数比在水中低，相反电荷间吸引力对应增大。当荷电侧链从水中转移到分子内部时，它周围有序排列水分子被释放到介质水中，所以，盐键形成不不过静电吸引而且也是熵增加过程。升高温度，能够增加盐桥稳定性。另外，盐键因加入非极性溶剂而加强，加入盐类而减弱。蛋白质不稳定性专家讲座第11页二、蛋白质结构中影响稳定性主要原因（五）二硫键：二硫键形成并不要求多肽链折叠。然而一旦蛋白质采取了它三维结构，则二硫键形成将对此构象起稳定作用。同一个蛋白质中，有些二硫键是生物活性所必需，另一些二硫键则不是生物活性所必需，但与维持蛋白质稳定相关，假如蛋白质中全部二硫键相继被还原，将引发蛋白质天然构象改变和生物活性丢失。蛋白质不稳定性专家讲座第12页三、环境原因对蛋白质稳定性影响物理原因：温度、紫外线照射、高压和表面张力等；化学原因：有机溶剂、脲、胍、酸、碱等；如尿素和盐酸胍，首先能与多肽主链竞争氢键，破坏蛋白质二级结构；更主要是它们能够增加非极性侧链在水中溶解度，因而降低了维持蛋白质三级结构疏水相互作用。酶作用：一些蛋白质分解酶类作用。微生物原因：微生物分解利用蛋白质进行生长繁殖蛋白质不稳定性专家讲座第13页三、环境原因对蛋白质稳定性影响值得注意是：蛋白质变性是一个协同过程，它是在所加变性剂很窄浓度范围内或很窄pH或温度间隔内突然发生。蛋白质不稳定性专家讲座第14页四、分离纯化中保持蛋白质稳定方法

1、尽可能在相对密封和无菌环境下快速进行分离纯化操作；2、在生理温度和压力范围内完成份离纯化操作；3、慎用溶剂和酸、碱、盐类，使用前要进行详细试验，确定最正确添加量和条件；4、钝化或抑制蛋白质分解酶类活性；5、选择适当分离方法。如：凝胶过滤、离子交换、吸附层析、亲和层析、电泳、结晶等。

蛋白质不稳定性专家讲座第15页五、包含体形成与性质重组蛋白质过量表示经常造成其在胞内发生错误折叠和聚集，形成被称为包含体集聚体。包含体主要是由蛋白质组成，其中大部分是基因表示产物。这些基因表示产物一级结构是正确，但立体结构是错误，所以没有生理活性。对于以包含体形式表示蛋白质，需要在分离回收包含体后，溶解包含体使其肽链伸展，然后在适当溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和生物活性，这一过程称为蛋白质体外再折叠或复性。蛋白质不稳定性专家讲座第16页五、包含体形成与性质(一)包含体形成当前，关于包含体形成机理尚不完全清楚，普通认为包含体形成是部分折叠中间态之间疏水性相互作用结果。

主要原因是蛋白质本身含有易于聚集沉淀性质，或表示产物周围物理环境（如温度、离子组成）不适或一些折叠辅助因子（分子伴侣）作用。

蛋白质不稳定性专家讲座第17页五、包含体形成与性质当代研究表明：在大多数情况下，包含体形成是蛋白质过量表示结果，而与蛋白质种类和表示系统无关，即包含体形成与其相对分子质量、疏水性以及折叠路径等内在性质没有必定联络。换句话说，对于任何蛋白质和任何表示系统，在过量表示情况下都可能形成包含体。蛋白质折叠复性和包含体形成为动力学竞争结果。蛋白质不稳定性专家讲座第18页五、包含体形成与性质UkiIkrNkaA其中：U为伸展肽链；I为折叠过程中间态；N为天然活性态；A为聚集体（包含体），ki、kr、ka分别为中间体生成速率常数、折叠速率常数和聚集体生成速率常数。

活性产物N形成为分子内折叠反应，折叠速率与浓度成正比；聚集体A形成反应在分子间发生，反应速率与浓度高次方成正比，即反应级数≥2。所以，假如新生肽浓度增加和中间态疏水相互作用就可能造成包含体形成。蛋白质不稳定性专家讲座第19页五、包含体形成与性质上述分析表明，包含体形成是不可预测，取决于系统表示速度和浓度。但当含有二硫键蛋白质在细菌胞液中表示时，因为胞液为还原性，巯基间不能被氧化形成二硫键而造成错误折叠，必定会形成包含体。蛋白质不稳定性专家讲座第20页五、包含体形成与性质（二）包含体形成利与弊胞内重组蛋白质包含体沉积可能是“天堂”，也可能是“地狱”。至于是“天堂”还是“地狱”，主要取决于沉积包含体蛋白质是否轻易复性。1、包含体体内抑制对于那些难于复性蛋白质（如相对分子量较大、结构复杂和含有较多二硫键蛋白质），包含体形成意味着表示系统失败，必须着力于胞内可溶性蛋白质表示研究，防止包含体形成，提升可溶性蛋白质表示量，即包含体体内抑制，主要方法有：蛋白质不稳定性专家讲座第21页五、包含体形成与性质（1）降低细胞培养温度，减缓蛋白质表示速度和降低表示量；（2）将目标蛋白质与分子伴侣蛋白、折叠酶和二硫键异构酶共表示，填补外源蛋白质表示过程中缺乏辅助因子；（3）使用非代谢性碳源，降低代谢速度和蛋白质表示量；(4)将目标蛋白质与亲水性蛋白质融合表示，惯用融合蛋白质有谷胱甘肽转移酶、麦芽糖结合蛋白和硫氧还原蛋白。蛋白质不稳定性专家讲座第22页五、包含体形成与性质

2．以包含体形式表示重组蛋白质优势（1）包含体蛋白质主要在以大肠杆菌为宿主细胞原核细胞表示系统中形成，而大肠杆菌生长速度快，易于高密度培养，有利于大规模生产目标蛋白质；（2）包含体是在过量表示情况下形成，所以普通包含体蛋白质表示量都很高；（3）包含体富含目标基因表示产物，有利于后续分离纯化。在适宜包含体提取和纯化条件下，目标产物纯度可达90%以上；蛋白质不稳定性专家讲座第23页以包含体形式表示重组蛋白质优势

（4）沉积于包含体内目标蛋白质不易被蛋白酶水解；（5）对于那些对宿主细胞有毒害作用或杀伤作用目标基因表示产物，以包含体形式表示是最可取生产路径。蛋白质不稳定性专家讲座第24页五、包含体形成与性质（二）包含体性质1、包含体为高密度蛋白质聚集体，密度约1.3g/ml.颗粒尺寸约0.1-1.0μm,有些达3μm，对表示产物和表示系统而异。2、包含体通常位于细胞质中，而一些分泌性蛋白质可能在外周胞质中形成。3、包含体主要成份为基因表示产物，占包含体50%以上，其它成份因表示系统而异，包含磷脂、微量质粒、rRNA和RNA聚合酶，更多是黏附于包含体颗粒外膜蛋白质。蛋白质不稳定性专家讲座第25页六、包含体分离纯化与溶解1、包含体分离包含体分离最惯用方法就是：机械破碎后进行离心沉降和膜分离（洗滤）。包含体为致密蛋白质聚集体，密度较大，达1.3g/ml，高强度机械破碎后，低速离心便可沉淀，从而使之与细胞碎片和可溶性产物分离。蛋白质不稳定性专家讲座第26页六、包含体分离纯化与溶解2、包含体纯化原因：蛋白质折叠复性和包含体形成为动力学竞争结果。也就是说，蛋白质复性是分子内折叠和分子间聚集反应竞争动力学过程。所以，为了提升蛋白质复性收率，必须抑制聚集体生成，促进复性反应向正确折叠方向进行。研究表明：在质粒DNA、脂多糖和其它蛋白质存在时，蛋白质聚集体生成速率增大，复性收率降低，而纯化变性/还原蛋白质复性收率能够得到大幅度提升。所以，包含体纯度对复性收率影响显著，为了实现较高蛋白质复性收率，必须进行包含体纯化。

蛋白质不稳定性专家讲座第27页六、包含体分离纯化与溶解方法：包含体纯化过程因表示系统和表示产物而异，没有通用最正确方案。所以，对于特定表示系统和表示产物，需要依据详细情况进行过程开发试验，确定适宜纯化方案。经常采取包含体分离纯化过程包含差速离心和重复洗涤步骤，以最大程度地去除难以去除膜蛋白质。可参考普通过程以下：蛋白质不稳定性专家讲座第28页六、包含体分离纯化与溶解路线1：①细胞破碎。为提升下一步离心分离效率，需进行高强度破碎（利用高压匀浆破碎时需重复操作屡次）。②离心沉降回收包含体。在较高离心机转数（离心力）下除去可溶性组分和沉降速度较小细胞碎片，回收沉降粗包含体。③粗包含体洗涤。向粗包含体中加入鳌合剂EDTA(乙二胺四乙酸)和低浓度变性剂（如1-4mol/L尿素，或1一2mol/L盐酸胍）或表面活性剂（如1-20g/LTritonX-100聚氧乙烯烷基酚),溶解吸附在包含体表面磷脂和膜蛋白质。同时加入一定浓度蔗糖，提升包含体悬浮液密度。蛋白质不稳定性专家讲座第29页六、包含体分离纯化与溶解④离心沉降回收包含体。在较低转数下离心分离，回收沉降包含体。⑤依据需要，可重复上述步骤③和④，直至到达满意包含体纯度。蛋白质不稳定性专家讲座第30页六、包含体分离纯化与溶解细胞破碎可采取机械破碎和酶解相结合方法，以提升破碎效率。包含体纯化过程中也可利用核酸水解酶，提升核酸去除率。DeBernardezClark等提出利用酶解辅助细胞破碎和包含体纯化过程以下（路线II)：①离心分离，回收细胞。②向回收细胞中加入含lmmol/LEDTA和1.5mg/mL溶菌酶Tris缓冲溶液（三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液）(0.lmol/L,pH=7.0)，细胞浓度为20g/L（湿重），总体积为V。放置30min。蛋白质不稳定性专家讲座第31页六、包含体分离纯化与溶解③细胞破碎：重复机械破碎，使细胞破碎完全。④核酸水解：向细胞破碎液中加入DNA水解酶(DNase）至10μg/mL和MgCl2至3mmol/L。25℃温浴30min，水解DNA。⑤包含体洗涤：向上述悬浮液中加人TritonX-100至20g/L,NaCl至1.5mo1/L,EDTA至20mmo1/L,悬浮液体积为3V。4℃搅拌30min。⑥离心分离回收包含体。⑦包含体洗涤：向回收包含体中加入Tris至0.lmol/L(pH=7.0),EDTA至20mmol/L,悬浮液体积为8V。

⑧离心分离回收纯化包含体。蛋白质不稳定性专家讲座第32页六、包含体分离纯化与溶解3、包含体溶解

目标：取得适当纯度包含体后，需要对包含体进行溶解，使目标蛋白质肽链伸展，为深入复性创造条件。

方法：包含体溶解方法：1、加入高浓度强变性剂：如6-8mol/L盐酸胍或8mol/L尿素。2、加入硫氰酸盐或表面活性剂。3、对于含有二硫键蛋白质，还需加入还原剂解离错配二硫键。蛋白质不稳定性专家讲座第33页六、包含体分离纯化与溶解惯用还原剂有1-100mmol/L二硫苏糖醇（DTT），1-200mmol/Lβ-巯基乙醇和半胱氨酸等，有时还需要加入螯合剂,以去除重金属离子（如加入2mol/LEDTA等）。注意：溶解后包含体蛋白质中仍会存在一些诸如非目标蛋白质、核酸和细胞膜组分等杂质，为了提升复性收率，在复性前要对变形/还原蛋白质深入纯化。主要方法有凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相色谱和固定化金属离子色谱等。纯化操作中使用流动相需确保蛋白质处于变性/还原状态，如苯酚、正丁醇等。假如要保留变性蛋白质，能够将蛋白质变换到酸性溶液中（10%醋酸或5-10mmol/L盐酸），并冷冻干燥。复性前用变性剂重新溶解干粉，就能够进行蛋白质复性操作。

蛋白质不稳定性专家讲座第34页七、蛋白质复性(一)蛋白质复性方法蛋白质不稳定性专家讲座第35页七、蛋白质复性1、直接稀释复性：即将变性蛋白质溶液直接稀释到适宜复性缓冲液中。变性蛋白质是溶解在高浓度变性剂中，降低变性剂浓度至非变性浓度范围即可引发蛋白质折叠复性。当变性剂浓度降低后，伸展肽链U快速折叠成含有丰富二级结构（α螺旋和β折叠结构）和部分三级结构中间体I，该过程非常快速，通常在几毫秒内完成，所以，I生成能够认为是瞬间完成（即ki→∞）,蛋白质折叠复性和聚集体形成过程能够简化为从中间体I折叠整天然活性态N和生成聚集体A平行反应。AKaIKrN蛋白质不稳定性专家讲座第36页七、蛋白质复性注意：聚集体形成是蛋白质过量表示结果。所以，在这个过程中，蛋白质复性收率普通是随变性蛋白质溶液浓度提升而降低，而聚集体生成速率随浓度提升而增大。即：U↑则I↑,N↓。所以，在稀释复性过程中，若复性系统混合不利，会造成局部蛋白浓度过高，使复性收率下降，在设计复性反应器时，要尽可能考虑混合搅拌均匀。蛋白质不稳定性专家讲座第37页七、蛋白质复性对于含有二硫键蛋白质复性，需要添加氧化剂和还原剂，调整复性液氧化还原环境，促进正确二硫键形成，常见氧化/还原剂有：氧化型谷光甘肽（GSSG）/还原型谷光甘肽（GSH）,胱氨酸/半胱氨酸或在金属离子（如Cu2+）存在下空气中氧化。氧化复性通常在弱碱性（pH=7.5-9.5）缓冲溶液中进行，在此pH值条件下有利于硫醇阴离子形成，促进二硫键形成和交换。同时，氧化还原剂浓度对复性收率影响显著。详细浓度范围要依据试验确定。因为，普通情况下，不一样蛋白质最正确复性条件不一样，而且同一个蛋白质在不一样浓度下最正确条件也不完全相同，这也是蛋白质复性特点和难点之一。蛋白质不稳定性专家讲座第38页七、蛋白质复性2、流加复性

降低蛋白质浓度有利于取得较高复性收率，所以，为了提升复性收率，通常需要在较低浓度下进行蛋白质复性操作，有时蛋白质浓度需低于0.01mg/ml。不过，降低蛋白质浓度势必会增大复性液体积，给后续分离纯化增加困难。为了实现高浓度下高收率复性，产生了将变性蛋白质分批次加入到复性液中或采取连续流加到复性液中流加复性法。因为在流加变性蛋白质同时，复性液中蛋白质发生折叠复性，使变性蛋白质（折叠中间体）浓度一直保持在较低水平，最终可在较高蛋白质浓度下取得较高复性收率。蛋白质不稳定性专家讲座第39页七、蛋白质复性3、透析（或洗滤）复性：即采取高亲水性膜材料进行透析或超滤方法降低变性剂浓度和调整复性液氧化还原环境。4、添加剂辅助复性：因为聚集体形成是造成复性收率降低主要原因，在控制复性液pH值、温度和氧化还原剂浓度等参数同时，研究者努力尝试在稀释复性中添加各种小分子溶质，以抑制聚集体生成。即利用添加一些小分子溶质等辅助因子稀释复性法，又称为稀释添加复性。惯用稀释添加剂见下表。蛋白质不稳定性专家讲座第40页七、蛋白质复性蛋白质不稳定性专家讲座第41页七、蛋白质复性蛋白质不稳定性专家讲座第42页七、蛋白质复性添加剂辅助蛋白质复性机理尚不完全清楚，但普通认为主要有以下两种作用：①稳定天然肽蛋白质结构，降低错误折叠蛋白质稳定性；②提升折叠中间体或伸展肽链溶解度（稳定性）。不一样添加剂作用机理不一样。甘油作用是稳定天然态蛋白质结构，提升其热力学稳定性，促进折叠反应进行；低浓度变性剂、聚乙二醇和表面活性剂等其它大部分添加剂作用是提升折叠中间体或伸展肤链溶解度，抑制聚集体生成。低浓度变性剂（如盐酸胍）可诱导酸变性蛋白质二级结构生成，稳定复性过程中熔球态中间体。蛋白质不稳定性专家讲座第43页七、蛋白质复性蛋白质折叠复性过程复杂多变，利用稀释添加剂需要注意以下问题：①添加剂辅助蛋白质复性作用含有选择性，即一个添加剂可能对某种蛋白质复性含有辅助作用，而对其它蛋白质复性无作用，甚至起反作用。比如，聚乙二醇可辅助碳酸脱水酶(carbonicanhydraseB)复性，但对溶菌酶复性无影响。蛋白质不稳定性专家讲座第44页七、蛋白质复性②对于那些稳定折叠中间体或伸展肤链添加剂，添加剂辅助作用在一定浓度范围内有效，即存在最正确浓度或浓度范围。在较低浓度下添加剂辅助作用不显著，而在较高浓度下复性收率亦降低。这是因为这类添加剂在抑制聚集体生成同时，也会抑制蛋白质折叠复性，造成折叠速率和聚集体生成速率均随浓度提升而下降。③添加剂最正确浓度或浓度范围与蛋白质种类和浓度相关。即不一样蛋白质复性所需添加剂浓度不一样，而且随蛋白质浓度提升，所需添加剂浓度也会提升。所以，普通添加剂辅助作用在较低蛋白质浓度下（＜0.1-lmg/mL）有效，在较高蛋白质浓度下因为分子间聚集趋势强烈，添加剂作用不显著。蛋白质不稳定性专家讲座第45页七、蛋白质复性④在生理环境下，低浓度蛋白质折叠可在数分钟内完成，普通不超出60min。不过，大部分添加剂在抑制聚集体生成同时，也会抑制蛋白质折叠复性，造成折叠速率降低。所以，在这类添加剂存在下，因为复性速率较低，需要较长复性时间（(5-40h)才能取得较高复性收率。所以，利用添加剂提升复性收率常需以延长复性操作时间为代价。蛋白质不稳定性专家讲座第46页七、蛋白质复性⑤在包含体蛋白质复性中，若利用盐酸肌或尿素溶解包含体，应首先考虑经过调整盐酸胍或尿素浓度来取得满意复性效果。只有在复性效果不佳情况下才考