环境毒理学的基本研究方法专家讲座

第三章

环境毒理学基本研究方法毒理学试验调查研究环境毒理学的基本研究方法专家讲座第1页毒理学

试验基础环境毒理学的基本研究方法专家讲座第2页

研究方法流行病学研究受控临床研究毒理学体内试验毒理学体外试验优点·真实暴露条件·要求限定暴露条·易于控制暴露条件·影响原因少，易于控·在各化学物之间发生相·在人群中测定反应·能测定各种效应

制

互作用·对某组人群(如哮喘)·能评价宿主特征作用·可进行一些深入研·测定在人群作用

研究是有力(如：性别、年纪、遗究(如：机制，代谢)·表示全部人敏感性·能测定效应强度

传特征等和其它调控因·人力物力花费较少

素饮食等)·能评价机制缺点·耗资、耗时多·耗资多·动物暴露与人暴露相关·不能全方面反应毒作用·多为回顾性，无健康·较低浓度和较短时

不确定性

不能作为毒性评价和

保护间暴露·受控喂养条件与人

危险性评价最终依·难以确定暴露，有混杂·限于较少许人群

实际情况不一致

据

暴露问题(普通<50)

·暴露浓度和时间模·难以观察慢性毒作用·可检测危险性增加必·限于暂时、微小、

式显著地不一样于人群

需到达2倍以上

可逆效应暴露·测定指标较粗(发病率，·普通不适于研究最

死亡率)

敏感人群毒理学研究方法优缺点环境毒理学的基本研究方法专家讲座第3页1试验动物和人对外源化学物反应敏感性不一样，有时甚至存在着质差异2高剂量向低剂量外推不确定性3小数量试验动物到大量人群外推不确定性4成年健康动物向年老体弱及患病个体外推不确定性试验动物毒理学试验资料外推到人群接触安全性时不确定性环境毒理学的基本研究方法专家讲座第4页1化学物在试验动物产生作用，能够外推于人。基本假设①人是最敏感动物物种；②人和试验动物生物学过程与体重(或体表面积)相关。2试验动物必须暴露于高剂量，这是发觉对人潜在危害必需和可靠方法。

3成年健康(雄性和雌性未孕)试验动物和人可能暴露路径是基本选择。描述毒理学试验基本标准环境毒理学的基本研究方法专家讲座第5页1受试物毒作用表现和性质

2剂量—反应(效应)研究

3确定毒作用靶器官

4确定损害可逆性

毒理学毒性评价试验基本目标环境毒理学的基本研究方法专家讲座第6页试验动物（laboratoryanimal）指经人工培育，对其携带微生物实施控制，遗传背景明确，起源清楚，可用于科学研究动物。试验动物选择环境毒理学的基本研究方法专家讲座第7页试验动物选择物种选择

选择对外液化学物毒性反应及代谢特点与人类靠近物种；选择自然寿命不太长物种；选择易于喂养和试验操作物种；选择经济并易于取得物种。

环境毒理学的基本研究方法专家讲座第8页近交系动物连续20代以上兄妹交配或亲子交配培育突变系动物突变基因可世代相传并保持遗传基因特征杂交群动物两个不一样近交系之间有目标进行交配，所产生第一代动物，亦称杂交一代动物。封闭群动物5年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系动物在固定场所保留繁殖动物群

试验动物选择品系选择环境毒理学的基本研究方法专家讲座第9页无菌动物体内外均无任何微生物和寄生虫无特定病原体动物（SPF）体内无特定微生物和寄生虫存在动物(无传染病)。喂养于封闭系统。清洁动物与SPF不一样：抗体检验常有脑脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗体滴度，但不应有临床症状、病理改变及自然死亡。喂养在半屏蔽系统。微生物控制选择试验动物选择环境毒理学的基本研究方法专家讲座第10页个体选择

1年纪2性别3生理状态4健康情况

试验动物选择环境毒理学的基本研究方法专家讲座第11页

品系周龄 Wistar SD 雌性 雄性 雌性 雄性 3 54 56 50 52 4 91 97 86 101 5 134 134 130 150 6 166 187 172 206 7 209 233 210 262 8 214 297 240 318 9 232 325 258 365 10 246 370 272 399 大鼠体重与周龄关系环境毒理学的基本研究方法专家讲座第12页

小鼠体重与周龄关系

品系周龄 昆明 BALB/c C57BL/6 615 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性

0 1.95 2.10 1.40 1.46 1.40 1.44 1.58 1.58 1 5.54 5.82 3.35 3.50 3.42 3.50 4.64 4.64 2 7.90 8.35 5.50 5.60 5.55 5.60 7.96 7.96 3 13.55 14.80 7.32 7.40 6.40 6.90 9.83 9.83 4 21.35 22.60 11.60 12.45 12.20 12.57 15.75 19.00 5 27.90 33.25 14.75 16.10 16.90 18.10 20.75 22.58 6 32.80 39.25 15.60 17.40 18.40 20.50 21.88 25.96 7 34.70 39.90 16.10 18.65 19.00 21.60 23.12 27.96 8 34.80 40.05 18.16 20.25 20.25 22.40 24.16 28.83 环境毒理学的基本研究方法专家讲座第13页1未处理对照组(空白对照组)：本底值，质量控制2阴性(溶剂／赋形剂)对照：与染毒组比较基础3阳性对照：检测试验体系有效性4历史性对照：检验试验体系稳定性，即进行试验室质量控制和确保

毒理学试验惯用对照环境毒理学的基本研究方法专家讲座第14页

对各个毒理学试验应该用同一个、同一批号受试物

受试物成份和配方必须固定

如是异构体混合物，异构体百分比必须固定

活性成份百分含量和可检测杂质浓度也应固定

受试物在贮存期内稳定性和在饲料中稳定性必须进行研究并汇报

受试物应一次备齐全部试验用量受试样品环境毒理学的基本研究方法专家讲座第15页毒理学试验设计统计学要求

随机、重复、对照标准对常规毒理学试验资料统计学方法计量资料：普通用t检验或ANOVA记数资料：卡方检验毒理学试验统计学环境毒理学的基本研究方法专家讲座第16页1处理组与对照组比较差异有没有显著性2有没有剂量-反应关系3是否伴有其它相关参数改变4是否在“正常”值范围

试验结果判断环境毒理学的基本研究方法专家讲座第17页第一节急性毒性试验一、急性毒性试验目标：1、确定供试化学物急性毒性剂量—反应关系和中毒特征；2、求LD50或LC50,为急性毒性评价提供依据。3、研究毒物毒动学和毒效学过程。表示急性毒性大小：

LD50(对受试物个体感受性影响较小，有更高重现性)环境毒理学的基本研究方法专家讲座第18页二、试验程序与评价

1．动物选择：首选受试物在体内代谢情况与人体内相近或对受试物最敏感品系。普通：以哺乳动物为主，惯用大鼠、小鼠；经皮：兔、豚鼠、猪应对两种性别、成年和幼年动物进行测定。选择两种以上试验动物，最好一为啮齿类，一为非啮齿类。(目标：查对种间差异)环境毒理学的基本研究方法专家讲座第19页2．染毒路径与方式：普通与人接触路径相同。(1)经口染毒：惯用灌胃法，也可将受试物放在饮水中由动物自由摄取。(2)经呼吸道染毒：将试验动物放在有毒气或粉尘染毒柜内进行染毒。急性吸入染毒采取静式染毒瓶(柜)，染毒2—4h。(3)经皮肤染毒：主要用于化学物经皮(或粘膜)吸收所引发急性毒性。正式给药前24h，背部脱毛，勿伤皮肤。将受试物均匀涂布于皮肤表面，用纱布覆盖，共敷24h。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第20页3．试验程序：（1）剂量与分组①预试验：找出受试物大致致死量范围(死亡率为10%~90%)；例：欲做化合物A经口预试验。化合物B化学结构与A相同，已知B=LD50=40(预期毒性中值)。则预试验取2.5、10、40、160、640(上下各推1~2组，组距应较大，初始4倍差)

环境毒理学的基本研究方法专家讲座第21页③求LD50正式试验：在LD100与LD0之间设5—7个剂量组。

组距(对数)

或

式中：n------设计剂量组数（2）症状观察

时间：24h或两周内反应环境毒理学的基本研究方法专家讲座第22页环境毒理学的基本研究方法专家讲座第23页三、LD50计算与结果评价

计算方法：概率单位法和寇氏法。LD50值愈小，毒性愈大。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第24页环境毒理学的基本研究方法专家讲座第25页环境毒理学的基本研究方法专家讲座第26页概率单位法环境毒理学的基本研究方法专家讲座第27页环境毒理学的基本研究方法专家讲座第28页存在正态曲线关系。标准正态差d=(x-μ)/δ式中：x——剂量对数；μ——剂量对数均数δ——标准差环境毒理学的基本研究方法专家讲座第29页d=0，左边面积(死亡率)为50％，右边面积(存活率)50％d=1，死亡率为84.13％，d=2，死亡率为97.73％,d＞2，死亡率靠近100％。d=一1，死亡率为15.87％。d=一2，死亡率为2.27％。d＜一3，死亡率靠近0。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第30页环境毒理学的基本研究方法专家讲座第31页从上表，能够任一死亡率换算为对应概率单位。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第32页A：剂量对数~死亡百分率B：剂量对数~概率单位环境毒理学的基本研究方法专家讲座第33页环境毒理学的基本研究方法专家讲座第34页LC50计算步骤以下：a.依据死亡率查概率单位(死亡率为100％或0％不计)b.绘图求回归方程。c.求y=5浓度对数（m），其反对数即为LC50y=2.78x-2.76同理可得LC5、LC10、……环境毒理学的基本研究方法专家讲座第35页d.求LC50可信限先求LC50标准误差(Sm)：S(校准差)=1/k本例中：S=1/2.78

环境毒理学的基本研究方法专家讲座第36页环境毒理学的基本研究方法专家讲座第37页平均致死量法（又名寇氏法）

试验要求：①每个试验组动物数相同；②各组剂量按等比级数分组；③最大剂量死亡率最好为100％或与之靠近，最小剂量死亡率最好为0％或与之靠近。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第38页式中：Xm——最大剂量对数值；i—相邻剂量比值对数；——各组死亡率总和（以小数表示）。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第39页例小鼠腹腔注射致百虫急性毒性试验结果以下表所表示，求LD50环境毒理学的基本研究方法专家讲座第40页式中：p——一个组死亡率；q——一个组存活率；i——相邻剂量比值对数；h——各组动物数。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第41页环境毒理学的基本研究方法专家讲座第42页第二节亚慢性和慢性毒性试验一、蓄积试验及其方法：（一）蓄积作用：一些物质以较小剂量重复作用于机体，可使机体对该物质反应性增强，即一次染毒不引发显著中毒反应或死亡剂量，经分次重复染毒后，可引发显著中毒或死亡，此种现象称为蓄积作用(accumulation)。可分两种：

物质蓄积：毒物在体内排出量小于进入量，以致毒物在体内贮留量增多为物质蓄积；

功效蓄积：毒物进入机体后，并未发觉在体内显著贮留，但可引发机体功效改变逐步累积，造成对该毒物反应性增强。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第43页耐受性(tolerance)：机体屡次接触化学物质后．对该物质产生反应性减弱现象，显示不易发生慢性中毒。

（二）蓄积作用测定方法有各种，惯用蓄积系数法。蓄积系数(accumulationcoefficient)K：

ED50(n)——屡次染毒使半数动物出现某种效应总剂量;ED50(1)——一次染毒引发同一效应半数效量。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第44页若以死亡为毒效应指标，上式为K越小，受试化合物蓄积毒性越大。K蓄积作用强度＜1高度蓄积1~3显著蓄积3~5中度蓄积＞5轻度蓄积环境毒理学的基本研究方法专家讲座第45页1．固定剂量法：固定天天染毒剂量为1/20—1/5LD50，连续染毒，直至试验动物半数死亡。假如染毒剂量累计已达5个LD50动物死亡仍末达半数，试验均可告结束，计算蓄积系数，作出评价。

2．递增剂量法：先测定LD50（1），然后对另一组动物天天染毒，以4天为一期，开始给予0.1LD50。以后每期按1.5倍递增剂量，直至动物半数死亡，或试验已达28天，可结束试验，计算系数。3.二十天试验法：选取大鼠或小鼠每个剂量组雌雄各10只，以1/2、l/5、1/10、1/20LD50分别对每组进行染毒，每日1次，共20天。如l/20LD50组动物有死亡，且有剂量—反应关系，则有较强蓄积作用；如1/20LD50组无死亡，则为弱蓄积。蓄积系数测定环境毒理学的基本研究方法专家讲座第46页二、亚慢性毒性作用及其试验方法：1、目标：确定化学物亚慢性毒性阈剂量和NOEL。2、试验期限：3-6月；呼吸道吸收：30-90天；皮肤毒性：30天。3、试验动物选择、喂养环境及染毒路径：

试验动物选择：对受试化学物敏感物种或品系；

环境：营养合理，饮水清洁、充分、温、光、湿适宜；

染毒路径：尽可能模拟人类在环境中接触受试化学物路径，与急性毒性试验相同。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第47页4、剂量选择与分组

剂量：1／80—I／50LD50，对于在体内不产生蓄积作用而排泄又快物质可适当加大剂量，反之则可降低剂量。

设3—4个试验组和1个对照组。

试验组要求：在试验结束时

最低剂量组不产生可观察到毒性反应；

最高剂量组能引发显著毒性反应，但不引发死亡；

中间剂量组产生轻微毒性反应。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第48页5、症状观察普通性指标(非特异)①普通综合性指标：动物体重增加率、食物消耗率、活动能力等。②普通化验性指标：主要指血和肝、肾功效检测。(2)特异指标：测定特异性反应。更确切说明该物质阈剂量(浓度)及无作用剂量(浓度)。(3)病理组织学检验：试验中死亡动物病理检验及试验结束时尸检。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第49页三、慢性毒性作用及其试验方法1、目标：评价化学物在长久小剂量作用条件下对机体产生损害及其特点．确定阈剂量和最大无作用剂量。2、试验方法：（1）动物选择、染毒方法、观察指标等与亚慢性毒性试验相同；（2）染毒期限：1-2年或终生染毒，也有些人提出6月。（3）剂量分组：3个染毒组和一个对照组。高剂量组：1/5—1/2亚慢性试验阈值；中间剂量：1/50—1/10；低剂量组：1/100。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第50页第四节致突变试验一、目标确定外源化学物对生物体是否含有致突变作用。基因点突变试验、染色体畸变试验、DNA损伤试验。二、供试生物：微生物、动物细胞、昆虫、动物或植物三、试验方法体外基因突变试验、细胞遗传学试验、体内基因突变试验、DNA损伤试验环境毒理学的基本研究方法专家讲座第51页（一）体外基因突变试验1、Ames试验（鼠伤寒沙门氏菌/动物肝细胞微粒体试验）

（1）原理：利用一个突变微生物菌株与被检测化学物接触，使突变型微生物回复突变，重新成为野生型微生物。突变型微生物不具备合成组氨酸能力，不能在不含（或低浓度）组氨酸培养基上生长。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第52页（2）方法：将突变型沙氏菌在不含（或低浓度）组氨酸培养基上培养,以其生长情况作为指标。在培养基中加入哺乳动物肝细胞微粒体：提升灵敏度。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第53页（3）特点：优点：简便、灵敏、快速（48h）、费用低；检测结果与对动物致癌性相符率达约90%。

缺点：利用微生物作为供试物，不能全方面反应哺乳动物遗传信息，仅1/6；微生物DNA修复系统与动物有差异；微生物无免疫功效。

环境毒理学的基本研究方法专家讲座第54页2、哺乳动物体细胞突变试验（1）方法原理与微生物突变类似。

惯用细胞株：中国地鼠肺细胞V79中国地鼠肺卵巢细胞(CHO）小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第55页V79、CHO细胞株正常细胞：缺乏利用嘌呤碱酶HGPRT，不能在加入类嘌呤碱类物质培养基上生长；突变细胞：可在加入类嘌呤碱类物质培养基上生长。L5178Y突变细胞株正常细胞：缺乏胸苷激酶（TK），不可在含有细胞毒物5-溴脱氧尿苷培养基上生长。突变细胞：可在此种培养基上生长。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第56页（二）细胞遗传学试验染色体畸变试验：直接在显微镜下观察染色体结构和数目标改变情况。生殖细胞或体细胞、体外或体内试验。体外：CHO细胞:分裂快、数目适中、形态清楚；人类外周血淋巴细胞体内：受试动物骨髓细胞或其它（胸腺、脾、精原细胞）染色体畸变率改变。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第57页（1）试验方法：a.体外培养：CHO细胞或人类外周血淋巴细胞与化学物，在细胞培养液（DMEM,RPM,1640或1999）中，370C下培养24h(CHO)或72h(人类细胞）。观察前2h加入秋水仙碱（中期分裂阻断剂），制片，镜检观察。b.体内染色体畸变分析：大鼠、小鼠，染毒喂养，观察骨髓细胞染色体畸变情况。环境毒理学的基本研究方法专家讲座第58页第四节环境流行病学方法一、概念和特点：流行病学：研究特定人群中相关健康状态和事件分布以及影响这些分布决定原因；环境流行病学：应用流行病学原理和方法，重点研究人们在生活和工作环境中各种原因与人群健康关系。普通流行病学研究内容是疾病在人群中分布，它要回答三个问题：(1)疾病在时间、地点、不一样人群中是怎样分布?(2)什么原因是该病主要决定原因?(3)怎样控制该病流行?环境毒理学的基本研究方法专家讲座第59页环境流行病学除了上述普通内容，还有它本身特点。(1)它不但研究疾病分布规律，而且更经常地研究疾病前状态