蛋白质高级结构性质及分离纯化

蛋白质高级结构性质及分离纯化第1页/共121页X射线衍射法入射的x射线投射到被检物体上引起光波的散射，散射光含有物体构造的全部信息，用透镜收集和重组散射光波产生物体的放大图像。第2页/共121页第3页/共121页核磁共振（NMR）

核磁共振的方法与技术作为分析物质的手段，由于其可深入物质内部而不破坏样品，并具有迅速、准确、分辨率高等优点而得以迅速发展和广泛应用，已经从物理学渗透到化学、生物、地质、医疗以及材料等学科，在科研和生产中发挥了巨大作用。核磁共振是1946年由美国斯坦福大学布洛赫(F.Block)和哈佛大学珀赛尔(E.M.Purcell)各自独立发现的，两人因此获得1952年诺贝尔物理学奖。50多年来，核磁共振已形成为一门有完整理论的新学科。第4页/共121页核磁共振基本原理核磁共振原理实现核磁共振的两种方法检测共振信号的方法傅里叶(Fourier)变换第5页/共121页核磁共振原理

半数以上的原子核具有自旋，旋转时产生一小磁场。当加一外磁场，这些原子核的能级将分裂，既塞曼效应。

在外磁场B0中塞曼分裂图：第6页/共121页共振条件：

=0=0

实现核磁共振的两种方法a．扫场法:改变0b．扫频法:改变第7页/共121页第8页/共121页核磁共振新技术

核磁双共振二维核磁共振

NMR成像技术魔角旋转技术极化转移技术第9页/共121页NMR成像技术投影重建成像方法Fourier成像方法弛豫时间成像方法逐点扫描方法线扫描方法切片扫描方法高分率成像和快速成像法第10页/共121页蛋白质分子中的非共价键：（1）氢键：羧基上的氧与亚氨基上的氢原子所形成。作用：链内维持二级结构；链间为三、四级结构所需。（2）疏水键：aa非极性侧链形成。作用：维持三级结构。稳定蛋白质三维结构的作用力第11页/共121页（3）盐键：带正负电荷的侧链通过静电引力形成。（4）范德华力：中性分子或原子间的作用力。第12页/共121页次级键的特点与作用键能弱；数量多。所以，在维持蛋白质空间结构中起重要作用。第13页/共121页维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键a盐键（离子键）b氢键c疏水相互作用力

d范德华力e二硫键f酯键第14页/共121页氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力虽然键能小，但数量大疏水相互作用力对维持三级结构特别重要盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定离子键氢键范德华力疏水相互作用力第15页/共121页酰胺平面与二面角第16页/共121页第17页/共121页蛋白质的二级结构指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕形式；蛋白质分子中邻近的氨基酸之间由于氢键的作用盘旋折叠形成的立体空间结构。包括：α-螺旋结构β-折叠结构β-转角结构自由回转维持蛋白质二级结构的主要作用力是氢键第18页/共121页（1）α-螺旋(α-helix)

因肽链中aa残基中的-NH与前三个aa的C=O间可形成氢键，使得肽链呈螺旋状盘曲。氢键取向几乎与中心轴平行。第19页/共121页①多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离0.15nm.第20页/共121页②肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行。第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。第21页/共121页③蛋白质分子大多为右手-螺旋。④亲水基团位于螺旋的外侧，疏水基团位于螺旋的内侧。左手和右手螺旋第22页/共121页影响α-螺旋稳定的因素蛋白质的氨基酸组成是主要的影响因素：

Pro

同种电荷第23页/共121页（2）β-折叠(β-pleatedsheet)

结构特点：肽链伸展，按层排列,

在肽链的不同区段或不同肽链间形成氢键,维持结构的稳定性。第24页/共121页

-折叠-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。①在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm.②-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。③-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。第25页/共121页β-折叠有两种类型平行：所有肽链的N端处于同一端，氢键不与肽链走向垂直。如：β-角蛋白。反平行：肽链的N端不处于同一端，氢键与肽链走向垂直。如：丝心蛋白。第26页/共121页反平行式第27页/共121页平行式第28页/共121页（3）β-转角(β-turn)链内形成氢键，多肽链出现180°的回折。此回折角称β-转角结构。此结构广泛存在球状蛋白中。第29页/共121页β-转角第30页/共121页（4）自由回转(randomcoil)亦称无规则卷曲、自由绕曲指无规律的松散肽链结构。通常酶蛋白的功能部位在此。第31页/共121页超二级结构(supersecondarystructures)指若干相邻二级结构单元组合彼此相互作用，形成有规则的在空间上能辨认的二级结构组合体。此为二级结构与三级结构间的一种过渡构象。如：αα，ββ；βαβ；等。第32页/共121页第33页/共121页结构域(domains)：多肽链在超二级结构基础上进一步绕曲折叠而成的相对独立的三维实体称结构域。具有部分生物学功能。The

subunitsareshowningrayandlightblue;the

subunitsinpinkanddarkblue.Notethatthehemegroups(red)arerelativelyfarapart.第34页/共121页几种常见的结构域蚯蚓血红蛋白的结构域四个α螺旋。免疫球蛋白VL的结构域丙糖异构酶第35页/共121页第36页/共121页蛋白质三级结构概念：

蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上进一步盘旋、折叠，从而生成特定的空间结构。包括主链和侧链的所有原子的空间排布．一般非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核，极性侧链在分子表面．较小蛋白质分子：多为单结构域，即三级结构；较大蛋白质分子：由2或2个以上结构域结合成三级结构。肌红蛋白三级结构第37页/共121页第38页/共121页蛋白质的四级结构亚基：几条肽链以非共价键联结成一稳定的活性单位，这种肽链称该蛋白质的亚基(subunit)。四级结构：亚基间通过非共价键聚合而成的特定构象。亚基单独存在不具活性血红蛋白:2个α亚基和2个β亚基。第39页/共121页蛋白质的四种结构层次第40页/共121页蛋白质的一级结构

蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序。蛋白质的空间结构一级结构卷曲、折叠而成。通常分为二级结构、超二级结构、结构域、三级结构、四级结构。一级结构决定空间结构。第41页/共121页蛋白质分子结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质构象与功能的关系第42页/共121页(一）蛋白质一级结构与生物功能1、一级结构不同,蛋白质功能不同第43页/共121页2、一级结构的关键部分相同，功能相同不同来源的胰岛素都由A、B链，51个aa组成，但一级结构的aa种类并不完全相同。第44页/共121页3、一级结构改变引起的分子病：如：镰刀型贫血病血红蛋白仅一级结构：

β6Glu换成β6Val由此引起三级结构多一疏水键，四级结构发生线性缔合，导致红细胞发生溶血。第45页/共121页蛋白质的空间结构决定于其一级结构和周围环境的影响如：疯牛病第46页/共121页prion的发现，提示人们，一级结构和环境因素影响蛋白质的构象。第47页/共121页（二）蛋白质构象与功

能的关系

蛋白质构象改变，活性丧失。第48页/共121页用化学方法修改Pr或多肽化合物的结构，可提高活性；了解Pr结构中的活性必需片段，可人工合成Pr。第49页/共121页蛋白质的性质

蛋白质的性质与其分子大小、结构及其组成——aa的性质密切相关。(一）分子量Mr：道尔顿

Pr为高分子有机物，分子量几千—几千万。分子量测定方法：渗透压法；超速离心法；凝胶过滤法(分子筛）；

SDS-聚丙烯酰胺电泳法(SDS)等。第50页/共121页渗透压法第51页/共121页分子量测定PAGE

分子筛电荷效应浓缩效应SDS-PAGE

分子筛浓缩效应第52页/共121页SDS-PAGE普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物不同蛋白质分子的均带负电（SDS带负电）；且荷质比相同（蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少）不同蛋白质分子具有相似的构象用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图测出待测样品的迁移率从标准曲线上查出样品的相对分子质量第53页/共121页第54页/共121页第55页/共121页第56页/共121页第57页/共121页第58页/共121页Typicalcalibrationcurvesobtainedwithstandardproteinsseparatedbynongradientdenaturing(SDS)discontinuousgelelectrophoresisbasedonthemethodofLaemmli(1970).(A)Gelwith7%polyacrylamide.(B)Gelwith11%polyacrylamide.(RedrawnwithpermissionfromSigma.)

第59页/共121页Separationofmembraneproteinsby5.1%to20.5%polyacrylamidegradientSDS

第60页/共121页第61页/共121页分子量测定根据化学成分测定最小相对分子质量此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量然后，假定蛋白质分子中该成分只有一个，据其百分含量可计算出最低相对分子质量：最小相对分子质量＝（已知成分的相对分子、原子质量）/已知成分的百分含量如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。第62页/共121页分子量测定——超速离心法在60000～80000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。一个S单位，为1×10-13秒相对分子质量越大，S值越大蛋白质的沉降系数：1～200S

由沉降系数S可根据斯维得贝格〔Svedberg〕方程计算蛋白质分子的相对分子质量：

M=RST/D〔1－iρ〕R：气体常数T：绝对温度

D：扩散系数ρ：溶剂的密度第63页/共121页分子量测定——超速离心法第64页/共121页分子量测定——凝胶过滤法凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量第65页/共121页分子量测定——凝胶过滤法第66页/共121页第67页/共121页分子筛—凝胶过滤法第68页/共121页（二）两性电离与等电点应用电泳法：分离各种蛋白质；鉴定蛋白质的纯度。此多用于科研、生产、临床诊断等。第69页/共121页（三）胶体性质蛋白质水溶液为亲水胶体。不能通过半透膜；分子周围有同种电荷和水化膜，有利于稳定pr胶体系统。水化膜、同种电荷超滤透析第70页/共121页（四）呈色反应

反应试剂颜色反应基团双缩脲反应

NaOH,稀CuSO4

紫或粉

2个以上肽链Millon反应

Millon,硝酸，亚硝酸

红色

酚基黄色反应

HNO3及NH3

黄、橘黄

苯环乙醛酸反应乙醛酸H2SO4

紫红吲哚坂口反应

次氯酸钠,萘酚，NaOH

红色

胍基Folin酚试剂反应

CuSO4磷钨酸-钼酸

兰色

酚基茚三酮反应

茚三酮

紫兰色

游离氨羧基第71页/共121页双缩脲反应

两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应肽键的反应，肽键越多颜色越深受蛋白质特异性影响小蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度第72页/共121页米伦氏反应酪氨酸的显色反应（酚羟基反应）米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热变成红色乙醛酸反应在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成色氨酸的反应（吲哚环的反应）鉴定蛋白质中是否含有色氨酸明胶中不含色氨酸坂口反应精氨酸的反应（胍基的反应）精氨酸与α-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物鉴定蛋白质中是否含有精氨酸定量测定精氨酸第73页/共121页福林试剂反应酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）福林试剂：磷钼酸-磷钨酸与双缩脲法结合Lowry法在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物灵敏度提高100倍黄蛋白反应浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应生成黄色化合物指甲、皮肤、毛发考马斯亮蓝G-250本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色与蛋白的亲和力强，灵敏度高11000微克/毫升第74页/共121页SangerFDNBDNP-aa测定蛋白质N端氨基酸序列EdmanPITCPTH-aa测定蛋白质N端氨基酸序列DNS-ClDNS-aa测定蛋白质N端氨基酸序列黄绿色荧光第75页/共121页（五）沉淀反应机理：

1）利用pr两性电离性质。

2）许多化学试剂可减少pr与水的亲和力方法：盐析、醇、酸、重金属离子、生物碱第76页/共121页盐析（Salting-in)向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4)2SO4，Na2SO4，]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。第77页/共121页盐析（Salting-in)第78页/共121页盐溶（salting-in)

蛋白质溶液中加入低浓度的中性盐使蛋白质的溶解度增大的现象第79页/共121页等电点沉淀蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。第80页/共121页有机溶剂法与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个：降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。第81页/共121页室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。第82页/共121页生物碱法蛋白质溶液中加入苦味酸、三氟醋酸等化合物可使带正电荷的蛋白质发生沉淀第83页/共121页（六）蛋白质的变性

（denaturation)1、概念：许多理化因素能破坏pr分子的高级结构，但一级结构不变，pr活性丧失的现象。1）分子内部结构改变：次级键破坏；2）分子表面结构改变：疏水基团暴露。主要标志：生物功能的丧失。第84页/共121页第85页/共121页2、变性蛋白在性质上的变化1）溶解度降低；2）二、三级结构破坏，但肽键未破坏，故其组成和分子量不变；3）化学反应基团增加；4）失去螺旋结构，对称性下降，结晶能力丧失；5）对蛋白酶水解敏感性增加；6）生物活性降低或全部丧失。第86页/共121页3、使蛋白质变性的理化因素：1）物理因素：加热、激烈振荡、超声波、

χ-射线、紫外线等；2）化学因素：A酸碱破坏盐键；B乙醇、丙酮等有机溶剂进入pr间隙与之形成氢键，破坏pr分子内各弱键；C浓脲溶液、盐酸胍及某些去垢剂(SDS)可破坏氢键，暴露巯基，强化酸碱的破坏作用。第87页/共121页4、可逆变性与不可逆变性可逆变性：复性

凡变性未超过限度，pr活性可恢复;

如：胃酶在80-90℃，失活；温度降至37℃，恢复。不可逆变性：变性不可恢复。

如：煮鸡蛋。第88页/共121页(七）蛋白质的紫外吸收大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。第89页/共121页六蛋白的分类蛋白质可按其分子形状，组成及其溶解度分类。根据分子组成可分为简单蛋白质和结合蛋白质。第90页/共121页简单蛋白又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只由氨基酸组成的肽链，不含其它成分。

清蛋白和球蛋白：albuminandglobulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。

谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70－80％乙醇中。

精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在于细胞核中。

硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。第91页/共121页结合蛋白由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成。色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清-，-脂蛋白等。第92页/共121页结合蛋白核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。黄素蛋白：由简单蛋白与黄素核苷酸结合而成。如琥珀酸脱氢酶、D-氨基酸氧化酶金属蛋白：由简单蛋白与金属结合而成。如铁蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶（硒）、乙醇氧化酶（锌）第93页/共121页蛋白质的外形分类依据蛋白质的外形分类按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。球状蛋白质：globularprotein外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质：fibrousprotein分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。第94页/共121页第95页/共121页七、蛋白质的分离纯化分离pr的各种方法主要根据pr的如下性质:1、分子大小2、溶解度；3、电荷；4、吸附性质；5、对其他分子（配基）的生物学亲和力。第96页/共121页（一）分离纯化的意义①从生物材料中分离制备蛋白质，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。④基因工程的需要第97页/共121页（二）分离纯化的要求1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。第98页/共121页三、分离纯化的一般程序生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段：

①材料的选择和预处理②破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）③分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。第99页/共121页

蛋白质分离纯化的前处理一、材料的选择与预处理选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。实验材料选定后，常常需要进行预处理.如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。第100页/共121页二、细胞的破碎分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。第101页/共121页组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。第102页/共121页细胞器的分离细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。第103页/共121页四、提取组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏，这就是提取。第104页/共121页蛋白质（酶）的提取大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）或0.1mol/LTris-HCl（pH7.5-8.0）缓冲液作提取液。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。第105页/共121页分离纯化从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两步进行。第106页/共121页蛋白质（酶）的分离纯化蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷