蛋白质多肽课件

蛋白质多肽课件第1页/共151页本章内容蛋白质基础知识多肽的化学生物学蛋白质化学合成蛋白质修饰和蛋白质药物第2页/共150页第2页/共151页一、什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的高分子含氮化合物。第3页/共150页第3页/共151页二、蛋白质的生物学重要性1.蛋白质是生物体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。第4页/共150页第4页/共151页1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用3）免疫保护作用4）物质的转运和存储5）运动与支持作用6）参与细胞间信息传递2.蛋白质具有重要的生物学功能第5页/共150页第5页/共151页多肽和蛋白质基础知识

第一节第6页/共150页第6页/共151页组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘

。蛋白质的分子组成第7页/共150页第7页/共151页1氨基酸

——组成蛋白质的基本单位存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸（甘氨酸除外）。第8页/共150页第8页/共151页L-氨基酸的通式R第9页/共150页第9页/共151页非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸（一）氨基酸的分类*20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:第10页/共150页第10页/共151页甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00缬氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucineLeuL

5.98异亮氨酸

isoleucineIleI

6.02苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48脯氨酸

prolineProP

6.30非极性疏水性氨基酸第11页/共150页第11页/共151页色氨酸

tryptophanTryW

5.89丝氨酸

serineSerS

5.68酪氨酸

tyrosineTryY

5.66

半胱氨酸

cysteineCysC

5.07

蛋氨酸

methionine

MetM

5.74天冬酰胺

asparagineAsnN

5.41

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

5.65

苏氨酸

threonineThrT5.602.极性中性氨基酸第12页/共150页第12页/共151页天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22赖氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginineArgR

10.76组氨酸

histidineHisH

7.593.酸性氨基酸4.碱性氨基酸第13页/共150页第13页/共151页几种特殊氨基酸脯氨酸（亚氨基酸）第14页/共150页第14页/共151页

半胱氨酸+胱氨酸二硫键-HH第15页/共150页第15页/共151页二硫键与蛋白质折叠第16页/共150页第16页/共151页（二）氨基酸的理化性质1.两性解离及等电点等电点(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。第17页/共150页第17页/共151页pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性离子阳离子阴离子第18页/共150页第18页/共151页2.紫外吸收色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm

附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。1mg/ml芳香族氨基酸的紫外吸收第19页/共150页第19页/共151页

肽键(peptide

bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。2肽(peptide)第20页/共150页第20页/共151页+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键第21页/共150页第21页/共151页*肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽……*肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。*由15个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。第22页/共150页第22页/共151页N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端多肽链有两端*多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。第23页/共150页第23页/共151页N末端C末端牛核糖核酸酶第24页/共150页第24页/共151页豌豆

defensin1

三维结构NC第25页/共150页第25页/共151页常用的蛋白质信息网站ExpertProteinAnalysisSystemhttp://www.expasy.ch/ProteinDataBank/第26页/共150页第26页/共151页第27页/共150页第27页/共151页

体内许多激素属寡肽或多肽神经肽(neuropeptide)（二）几种生物活性肽第28页/共150页第28页/共151页3蛋白质和多肽的分类

*根据蛋白质组成成分单纯蛋白质结合蛋白质=蛋白质部分+非蛋白质部分*根据蛋白质形状纤维状蛋白质球状蛋白质第29页/共150页第29页/共151页肽的分类按来源分：核糖体多肽：由mRNA翻译合成，包括激素和信号分子。非核糖体多肽：非核糖体多肽酶催化合成，如谷胱甘肽。合成多肽第30页/共150页第30页/共151页按肽链骨架来源分线性肽环形肽第31页/共150页第31页/共151页蛋白质的分子结构包括

一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)高级结构4蛋白质的分子结构第32页/共150页第32页/共151页定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。3.1蛋白质的一级结构主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。

第33页/共150页第33页/共151页一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。第34页/共150页第34页/共151页3.2蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象

。定义

主要的化学键：

氢键

第35页/共150页第35页/共151页蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋(-helix)

-折叠(-pleatedsheet)

-转角(-turn)无规卷曲(randomcoil)

第36页/共150页第36页/共151页（二）-螺旋目录第37页/共150页第37页/共151页（三）-折叠第38页/共150页第38页/共151页模体(motif)在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象。第39页/共150页第39页/共151页钙结合蛋白中结合钙离子的模体

第40页/共150页第40页/共151页--

第41页/共150页第41页/共151页BetaHelices

第42页/共150页第42页/共151页无规卷曲第43页/共150页第43页/共151页3.3蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键和VanderWaals力等。主要的化学键整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置,即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。（一）定义第44页/共150页第44页/共151页第45页/共150页第45页/共151页肌红蛋白(Mb)N端

C端第46页/共150页第46页/共151页第47页/共150页第47页/共151页纤连蛋白分子的结构域

（二）结构域大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain)。第48页/共150页第48页/共151页亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。3.4蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(subunit)。第49页/共150页第49页/共151页一级二级三级四级第50页/共150页第50页/共151页卷曲螺旋(coiledcoil)

第51页/共150页第51页/共151页（一）一级结构是空间构象的基础3.5

蛋白质一级结构与功能的关系牛核糖核酸酶的一级结构二硫键第52页/共150页第52页/共151页

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性第53页/共150页第53页/共151页（二）一级结构与功能的关系例：镰刀形红细胞贫血

毛细血管堵塞第54页/共150页第54页/共151页N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。第55页/共150页第55页/共151页（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构3.6蛋白质空间结构与功能的关系第56页/共150页第56页/共151页Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。（二）血红蛋白的构象变化与结合氧第57页/共150页第57页/共151页（三）蛋白质构象改变与疾病

蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。第58页/共150页第58页/共151页有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：老年痴呆症、疯牛病等。蛋白质构象改变导致疾病的机理：第59页/共150页第59页/共151页疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病第60页/共150页第60页/共151页4蛋白质的分离和纯化（一）透析及超滤法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。*超滤法

应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。第61页/共150页第61页/共151页（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀*使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。第62页/共150页第62页/共151页*免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。第63页/共150页第63页/共151页（三）电泳蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)

。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。

第64页/共150页第64页/共151页几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。

第65页/共150页第65页/共151页双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术pI第66页/共150页第66页/共151页（四）层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。第67页/共150页第67页/共151页蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。*凝胶过滤(gelfiltration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。第68页/共150页第68页/共151页第69页/共150页第69页/共151页第70页/共150页第70页/共151页（五）超速离心*超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。第71页/共150页第71页/共151页5

多肽链中氨基酸序列分析分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。第72页/共150页第72页/共151页Edman降解异硫氰酸苯酯

第73页/共150页第73页/共151页6

蛋白质空间结构测定二级结构测定通常采用圆二色光谱(circulardichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。第74页/共150页第74页/共151页三级结构测定X射线衍射法(X-raydiffraction)核磁共振技术(NMR)

第75页/共150页第75页/共151页多肽的化学生物学

第二节第76页/共150页第76页/共151页研究集中领域多肽的化学生物学蛋白质化学合成蛋白质修饰和蛋白质药物第77页/共150页第77页/共151页2.1多肽的化学合成1.

肽键形成原理和保护基

原理：多肽的合成就是形成肽键的过程，即一个氨基酸（AA）氨基亲核进攻另一个氨基酸被活化的羧基部分，形成肽键。

氨基酸的活性基团必须进行保护。第78页/共150页第78页/共151页肽键形成步骤制备部分保护的氨基酸，形成只有单一活性位点的氨基酸衍生物；将氨基保护的氨基酸羧基部分活化，形成活性中间体，再与自由氨基反应形成酰胺键；脱除氨基酸的保护基。第79页/共150页第79页/共151页R1PGOHOH2N选择性保护R1OHONH活化PGR1NHOXR2OHOH2NPGNHR1OHNR2OHO选择性脱除PG第80页/共150页第80页/共151页保护基（ProtectionGroups）临时性保护基：在下一个肽键形成前脱除，一般用于氨基或羧基的暂时性的保护，脱除不影响半永久性保护基。半永久性保护基：一般用于侧链的保护，在目标序列合成后去除。种类：叔丁氧羰基Boc

9-芴甲氧羰基Fmoc

第81页/共150页第81页/共151页2.化学合成多肽的发展历程早期：液相合成1901，德国化学家Fischer合成了Gly-Gly20世纪中期，合成活性肽，如催产素、胰岛素。

1963年，Merrifield提出了固相合成（SPPS），1984年诺贝尔奖。在1966年发明了第一台自动的固相肽合成仪。第82页/共150页第82页/共151页

3.

液相多肽合成优点：成本低，目前一些的商业肽制备中有应用。

缺点：肽片段在有机溶剂中溶解度小；为提高产率，每步缩合过程中氨基酸片段过量，分离纯化困难。合成周期长；只适用小短肽合成。第83页/共150页第83页/共151页步骤：多肽的C端氨基酸通过linker键连到树脂上；脱除氨基上的临时保护基；与下一个氨基酸缩合；反复进行脱保护和缩合两个步骤；脱除半永久性保护基；

4.

固相多肽合成第84页/共150页第84页/共151页NHOROHYNHOROY去保护H2NORONHOR2OHYR2ONH树脂HNYORO去保护反复进行固相多肽合成过程第85页/共150页第85页/共151页根据保护策略不同分为Boc和Fmoc方法Boc叔丁氧羰基30%-50%三氟乙酸强酸很少应用

Fmoc9-芴甲氧羰基20%哌啶弱酸方便

类型脱除保护基条件裂解条件自动化合成第86页/共150页第86页/共151页环合方式：主链头-尾环合，侧链-侧链环合侧链-头环合，尾-侧链环合

固相液相方法均可，但反应较慢。

5.

环肽合成第87页/共150页第87页/共151页多肽很少可被作为药物利用易水解，稳定性低，亲水性强难以跨越细胞膜2.2肽模拟物肽模拟物：根据与结合受体的多肽而设计，将多

肽分子的结构信息转化成非肽结构。第88页/共150页第88页/共151页分类以酰胺类似物或二级结构类似物代替多肽的模拟物。e.g.–NH–用氧原子（–

O–），硫原子（–S

–），取代或是对其进行烷基化修饰。2.功能模拟物：作用于多肽受体的非肽类小分子，是天然多肽的结构类似物。3.非肽类化合物：有新型的肽母核，但包含多肽发挥作用所必须的关键功能基团。第89页/共150页第89页/共151页

类肽定义：以N-取代甘氨酸为构建的单元化合物。

优点：比肽的构象柔性高，不会被蛋白酶水解，具有更高的代谢稳定性，提高生物利用度及生物活性。R3OHNOR2R1HNO肽类肽NHONR1NR2ONR3第90页/共150页第90页/共151页（1）靶蛋白的功能位点（3-10个氨基酸）结合小分子或蛋白质后发挥调节活性作用的区域。2.4多肽的应用和肽类药物多肽疾病诊断和治疗生命调节过程用途：多肽可代替靶蛋白结合配体，研究功能位点的性质，发现新配体，用于结构研究和药物筛选。第91页/共150页第91页/共151页（2）确认靶标,寻找药理学作用的最佳位点

+多肽靶蛋白特异结合优点：比药物更容易在细胞内表达，可用于预测药物作用位点，确认靶标。第92页/共150页第92页/共151页（3）高通量筛选的替代配基

合成可与靶蛋白特定功能位点序列相同的多肽，作为检测平台，然后测定小分子置换多肽配体或阻止配体结合能力。药物：生物利用率低，无特异性，造成周身的毒副作用。VS肽类药物：特异性。第93页/共150页第93页/共151页2.2蛋白质化学合成生物表达方法的局限：只含20中天然氨基酸，非天然氨基酸难以引入；翻译后修饰困难，不易精确控制；大于30kDa的蛋白质表达不容易；细胞中表达有毒蛋白或膜蛋白困难。第94页/共150页第94页/共151页2.2.1蛋白质的化学全合成1.发展历程固相多肽合成实践中指能合成50-60个氨基酸的肽链。连接反应TargetProtein第95页/共150页第95页/共151页多肽的侧链官能团需要保护。

局限C端氨基酸在活化的过程中容易消旋，最后脱保护步骤可能严重影响产率。第96页/共150页第96页/共151页2.自然化学连接

(Nativechemicalligation,NCL)化学选择性反应---酯交换自发重排：S→N酰基转移pH6.5-8.0温度25-40℃第97页/共150页第97页/共151页反应机理外加硫醇与多肽硫酯发生酯交换；新形成的硫酯与N端Cys侧链上的巯基发生酯交换，形成硫酯中间体；S-N的酰基转移，生成以Cys为连接点的多肽。第98页/共150页第98页/共151页N、C端有特定的化学结构，需要一个C端为硫酯的多肽片段和一个N端为Cys的多肽片段。不需保护基；水溶液中进行；高效，生成天然的酰胺键。特点第99页/共150页第99页/共151页多肽硫酯是制备的关键，限制是Cys第100页/共150页第100页/共151页Boc法制备硫酯目前最有效方法；但产率低，反应条件剧烈，危险。第101页/共150页第101页/共151页3.NCL的应用和实例HIV1蛋白酶的合成抗HIV疗法的一个靶向目标，由2条含99的氨基酸的多肽组成的聚体。

HIV1蛋白酶发生变构或失活

无活性的病毒颗粒

HIV1蛋白酶是病毒复制必需酶第102页/共150页第102页/共151页

HIV1蛋白酶的合成过程A1----A40B42----B99A42----A99B1----b40A1----A40A42----A99B1----b40B42----B99A1----A40A42----A99B1----b40B42----B99GlnA41Gln-(Gly)4GlnB41CysA41CysB41GlnA41arylSarylSarylSarylSGlnB41++Cys-(Gly)4Cys-(Gly)4第103页/共150页第103页/共151页生物学的方法内含肽表达蛋白连接（expressproteinligation,EPL）优点：一、可在蛋白质中引入数量不限的非天然氨基酸；二、能实现大范围的蛋白修饰。2.2.2蛋白质的化学半合成第104页/共150页第104页/共151页

1.发展历程1）蛋白质半合成的提出天然蛋白

水解切断片段合成蛋白质2）化学性连接方法：Kent，解决了保护的问题，需要引入N端Cys或C端硫酯，重组蛋白制备问题。3）蛋白质剪接技术的发明和应用第105页/共150页第105页/共151页内含肽（Intein）是一段随功能蛋白一起表达，并在表达后可进行自剪接的多肽。它兼有蛋白酶和蛋白连接酶的特性，与内含子（RNA水平自剪切）的作用方式类似。

什么是内含肽？

1994年perler报道了第一个存在于啤酒酵母VAM1基因的内含肽后，已鉴定出400多种

第106页/共150页第106页/共151页蛋白质剪接过程

第1步：剪接是由N末端的半胱氨酸的NS或是N-O的酰基迁移，将N端外显肽1连接到内含肽N端Cys的巯基上形成硫酯；第2步：发生转酯化反应：外显肽2的N端半胱氨酸残基巯基攻击硫酯，形成一个分支状的酯或硫酯中间物；第3步：是肽键的断裂伴随着内含肽C末端琥珀酰胺的形成，使内含肽释放出来。接着放生SN或S-O酰基转移，形成一个稳定的酰胺键，从而形成一个成熟的外显肽。

第107页/共150页第107页/共151页蛋白质剪接机理1:酰基转移2:转酯化反应3:

琥珀酰胺中间体4:

酰基转移Chongetal.(1996)J.BiolChem.271:22159内含肽外显肽2外显肽1亚酰胺第108页/共150页第108页/共151页内含肽的应用生产环肽和蛋白蛋白质纯化位点特异性蛋白修饰分子间蛋白质互作蛋白连接（IPL）第109页/共150页第109页/共151页2.表达蛋白连接（EPL)始于1998年，利用蛋白质剪接技术。硫酯是NCL和EPL的活性关键基团,蛋白硫酯通过重组表达获得。利用蛋白剪接制备硫酯。第110页/共150页第110页/共151页HSHN蛋白剪接制备硫酯NHO多肽内含肽CBDOSO多肽H2N内含肽HNCBDORSHSRO多肽硫酯HSH2N内含肽HNCBDO第111页/共150页第111页/共151页HNHSHN表达蛋白连接示意图NHO多肽1内含肽CBDOSO多肽1H2N内含肽HNCBDORSHO多肽1SRO多肽1HS多肽2HSNH2多肽2NCL第112页/共150页第112页/共151页3.EPL的应用实例蛋白质翻译后修饰引入非天然氨基酸第113页/共150页第113页/共151页

EPL结合化学和生物技术方法（1）蛋白质翻译后修饰

糖基化、磷酸化、酯化生物学方法：不受基因调控，修饰困难。化学方法：可用于位点修饰，但化学全合成困难。第114页/共150页第114页/共151页例子：Muir利用EPL用于泛素化组蛋白H2B的合成H2B(118-125)泛素(1-75)OSRH2B(118-125)泛素(1-75)H2B(1-116)H2B(1-116)H2B(118-125)泛素(1-75)脱硫第115页/共150页第115页/共151页(2)引入非天然氨基酸

蛋白质上嵌入非天然氨基酸蛋白质结构功能

利用EPL可以在蛋白质中引入荧光探针分子、同位素分子等基团。第116页/共150页第116页/共151页(3)研究蛋白质相互作用

第117页/共150页第117页/共151页绿色荧光蛋白GFP第118页/共150页第118页/共151页（4）蛋白质固定化用于生物芯片研究

第119页/共150页第119页/共151页蛋白连接第120页/共150页第120页/共151页几种蛋白纯化方法InteinSystem常规层析

亲和层析

内含肽系统第121页/共150页第121页/共151页（5）内含肽介导的蛋白质纯化

C端融合

N端融合第122页/共150页第122页/共151页

优点使用亲和层析的方法得到无亲和标签的蛋白，避免使用昂贵的蛋白酶切除亲和标签；可得到无甲硫氨酸和载体氨基酸残基的蛋白质。第123页/共150页第123页/共151页（6）

蛋白质环化TRENDSinBiochemicalSciencesVol.27No.32002

70年代Gran首先在一种非洲植物发现一种由29个氨基酸的环肽KalataB1后，人们相继从微生物、动植物中发现了环形的肽和蛋白。

第124页/共150页第124页/共151页环化的生物学意义增强抵抗氨肽酶、羧肽酶的作用;增加蛋白的稳定性，也可能提高蛋白的生物效价;提高蛋白的折叠率;第125页/共150页第125页/共151页环化肽和蛋白的方法化学方法：通过化学交联等方法在N端和C端形成二硫键，把肽头尾连接起来。缺点是只能环化小肽。生物合成：利用自剪接内含肽来环化肽和蛋白。第126页/共150页第126页/共151页内含肽介导的蛋白环化和聚合的原理

转剪接

转剪接

环化

聚合

目的蛋白N-内含肽C-内含肽线性聚合体第127页/共150页第127页/共151页2.3

蛋白质修饰和蛋白质药物第128页/共150页第128页/共151页2.3.1蛋白质修饰定义：通过化学手段改变蛋白质分子的化学结构，从而在目标蛋白上引入特定的化学基团，改变其化学功能和生物性质，以便研究蛋白质的结构和功能关系，并定向的改造蛋白质的性质和功能。

类型：基于天然氨基酸侧链官能团的修饰基于非天然活性基团的修饰第129页/共150页第129页/共151页（1）基于天然氨基酸侧链官能团的修饰

酪氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸、组氨酸N端位点的选择性修饰C端位点的选择性修饰特殊序列的蛋白质修饰第130页/共150页第130页/共151页特殊序列的蛋白质修饰CysCysCysCysProGlySHSHSHSHCO2HOHOOAsAsSSSSCO2HOHOOAsAsSSSSCCPGCC序列双砷荧光染料第131页/共150页第131页/共151页（2）基于非天然活性基团的正交方法酮基官能化修饰：酮基+烷氧基腙或胯Staudinger连接修饰：叠氮化合物和三苯基磷化合物作用生成酰胺键，反应中脱去一份子氮气形成磷的亚氨基化合物。Click反应修饰：叠氮和炔发生环加成反应。腙蛋白质N3NH染料OCu离子+蛋白质染料第132页/共150页第132页/共151页两种特异性的化学反应可以在细胞裂解物、活细胞的表面甚至生物体上反应，为细胞或生物体的活体检测提供前提。蛋白修饰上生物素后再与标记了叠氮化物的糖复合物反应，就可以用生物素抗体亲和富集出目标的糖复合物。

蛋白质N3生物素+糖复合物蛋白质生物素糖复合物第133页/共150页第133页/共151页2.3.2蛋白质药物

疾病蛋白质

目前应用心脏病、糖尿病、自身免疫病等很多方面。第134页/共150页第134页/共151页蛋白质药物可分为多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、重组疫