蛋白质折叠的学习教案

蛋白质折叠的学习教案第1页/共143页蛋白质折叠前后第2页/共143页蛋白质折叠定义蛋白质折叠:狭义是蛋白质特定三维空间结构形成的规律、稳定性和与其生物活性的关系。蛋白质折叠是物理过程。多肽折叠成特定功能的三维结构，“分子伴侣”的发现和鉴定改变了蛋白质折叠研究的经典概念第3页/共143页1961年Anfinsen表现核糖核酸酶可变性后重折叠，同时保持酶活性，从而表明蛋白折叠所有要求的信息在其一级结构内。在折叠时，在环境条件（温度，溶剂和组成等）一定，天然结构是一个独特的、稳定的和动力学自由能最低的。Anfinsen原理：Anfinsen'sdogma，自组装（self-assembly）学说，“自组装热力学假说”，是分子生物学的一个假设:顺序决定构象。Anfinsen因此而获得1972年诺贝尔化学奖。蛋白质折叠的发现第4页/共143页Anfinsen'sdogma

按照自组装学说,一级结构决定空间结构的密码叫作“第二遗传密码”。按照自组装学说,每个蛋白多肽翻译从基因序列开始生成线性的氨基酸链，这种多肽没有三维结构。然而链中氨基酸具有总的化学特征：疏水的，亲水性，或带电，可被认为蛋白质折叠机制按照自组装学说,每一步折叠都是正确的，充分的，必要的。实际上折叠过程是一个正确和错误途径相互竞争过程。边合成边折叠同时进行的协调的动态过程。第5页/共143页蛋白质折叠的问题蛋白质折叠：热力学和动力学问题在生理条件下多肽链折叠是热力学上有利的过程多肽链折叠是一个动力学的问题一个在热力学上可以成立的反应由于动力学能障在实际上未必可以完成。蛋白质在体外折叠和在细胞内折叠的问题理论研究和实验研究的问题第6页/共143页蛋白质折叠的原理Anfinsen学说：自组装（self-assembly）Ellis1987年提出了蛋白质“辅助性组装学说”。体内蛋白质折叠往往需要其他辅助因子参与，并伴有ATP的水解。因此，蛋白质折叠是一个热力学过程，也受动力学控制。有的学者基于有些相似氨基酸序列的蛋白质具有不同的折叠结构，而一些不同氨基酸序列的蛋白质在结构上却相似的现象，提出了mRNA二级结构可能作为一种遗传密码从而影响蛋白质结构的假说。目前为止，对蛋白质折叠机制的认识仍是不完整的，甚至有些方面还存在着错误的观点。第7页/共143页蛋白质折叠与生物信息流在生物体内，生物信息流动可分为两个部分：第一部分是存储于DNA序列中的遗传信息通过转录和翻译传入蛋白质的一级序列中，这是一维信息之间的传递，三联子密码介导了这一传递过程第二部分是肽链经过疏水塌缩、空间盘曲、侧链聚集等折叠过程形成蛋白质的天然构象，同时获得生物活性，从而将生命信息表达出来蛋白质折叠是一维信息向三维信息的转化过程第8页/共143页细胞内的蛋白质折叠

体内折叠过程往往与翻译共启始，因此，N-末端蛋白开始折叠，而C-末端部分仍在合成。

氨基酸序列与折叠密切相关

化学修饰往往与肽链的折叠密切相关

折叠是有序的、由疏水力推动的协同过程。最近的理论提出了蛋白质折叠氢键的贡献

伴侣分子在折叠中起着辅助性的作用

折叠在越膜转运过程中：解开折叠后才能越膜。第9页/共143页蛋白质折叠的途径第10页/共143页蛋白质折叠的途径

独立折叠热休克蛋白70辅助蛋白质折叠HSP70和伴侣协助配合下折叠第11页/共143页蛋白质折叠的理论模型框架模型（FrameworkModel）疏水塌缩模型（HydrophobicCollapseModel）扩散-碰撞-粘合机制（Diffusion-Collision-AdhesionModel）成核-凝聚-生长模型（Nuclear-Condensation-GrowthModel）拼版模型（Jig-SawPuzzleModel）第12页/共143页框架模型（FrameworkModel）

假设蛋白质局部构象依赖于局部的氨基酸序列

在多折叠的起始阶段,先迅速形成不稳定的二级结构单元，称为“flickeringcluster”

随后二级结构靠近,形成稳定的二级结构框架

最后二级结构框架相互拼接，渐紧缩，形成三级结构。

这个模型认为即使是一个小分子的蛋白也可以一部分一部分的进行折叠,其间形成的亚结构域是折叠中间体的重要结构。第13页/共143页疏水塌缩模型

（HydrophobicCollapseModel）

在疏水塌缩模型中，疏水作用力被认为是在蛋白质折叠过程中起决定性作用的力的因素。在形成任何二级结构和三级结构之前首先发生很快的非特异性的疏水塌缩。第14页/共143页扩散-碰撞-粘合机制

Diffusion-Collision-AdhesionModel）

蛋白质的折叠起始于伸展肽链上的几个位点，在这些位点上生成不稳定的二级结构单元或疏水簇，主要依靠局部序列（3-4个残基）相互作用来维系。疏水簇以非特异性布朗运动方式扩散、碰撞、相互黏附，导致大的结构生成并增加稳定性。进一步碰撞形成具有疏水核心和二级结构的类熔球态中间体。球形中间体调整为致密的、无活性的类似天然结构的高度有序熔球态结构。最后无活性高度有序熔球态转变为完整有活力的天然态。第15页/共143页成核-凝聚-生长模型

（Nuclear-Condensation-GrowthModel）肽链中的某一区域可以形成“折叠晶核”，以它们为核心，整个肽链继续折叠进而获得天然构象。所谓“晶核”实际上是由一些特殊的氨基酸残基形成的类似于天然态相互作用的网络结构，这些残基间不是以非特异的疏水作用维系的，而是由特异的相互作用使这些残基形成了紧密堆积。晶核的形成是折叠起始阶段限速步骤。第16页/共143页拼版模型

（Jig-SawPuzzleModel）中心思想是多肽链可以沿多条不同的途径进行折叠,在沿每条途径折叠的过程中都是天然结构越来越多,最终形成天然构象每条途径的折叠速度都较快,与单一途径折叠方式相比,多肽链速度较快,另一方面,外界生理生化环境的微小变化或突变等因素可能会给单一折叠途径造成较大的影响这些变化可能给某条折叠途径带来影响,但不影响另外的折叠途径,因而不会从总体上干扰多肽链的折叠第17页/共143页

分子伴侣（chaperon）概念：伴随蛋白质构象正确形成的一类蛋白质。类别：分子伴侣蛋白折叠酶DNA分子伴侣功能：①结合疏水基团②校正③指导二硫键正确配对等第18页/共143页分子伴侣提出1987，Lasky首先将细胞核内能与组蛋白结合并能介导核小体有序组装的核质素（nucleoplasmin）称为分子伴侣。1987

Ellis的定义，一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，在细胞内帮助其他多肽完成正确组装，而在组装完后与之分离1987年，Ikemura发现枯草杆菌素的折叠需要前肽（propeptide）的帮助。Shinde和Inouye将这类前肽称为分子内伴侣（intramolecularchaperones）。第19页/共143页分子伴侣的特征分子伴侣对靶蛋白没有高度专一性，同一分子伴侣可以促进多种氨基酸序列完全不同的多肽链折叠成为空间结构。蛋白质性质和功能都不相关。催化效率很低。需要水解ATP，构象改变，释放底物，进行再循环。它是阻止错误折叠，而不是促进正确折叠。多能性（胁迫保护，防止交联聚沉，转运，调节转录和复制，组装细胞骨架）进化保守性

第20页/共143页分子伴侣的作用机制分子伴侣的功能是识别新生肽段折叠过程中暂时暴露的错误结构并与之结合生成复和物，从而防止这些表面间过早的相互作用，阻止不正确的非功能折叠途径，抑制不可逆聚合物产生，促进折叠向正确方向进行。分子伴侣的作用机制实际上就是它如何与靶蛋白识别，结合，又解离的机制。。第21页/共143页分子伴侣的作用过程分子伴侣作用的第一步是识别。一般的分子伴侣识别特异性不高，识别非天然构象，而不是天然的构象。有的分子伴侣-“私有分子伴侣”

具高度专一性。分子伴侣识别所谓熔球体结构（moltenglobule），熔球体可能是有疏水表面。分子伴侣作用的第二步是与靶蛋白形成复合物。分子伴侣常以多聚体形式形成中心空洞的结构，电子显微镜已观察到由二圈圆面包圈形组成的十四体groel分子和一个一层圆面包圈的七体groes分子作用形成中空的非对称笼状结构（cage

model），推测靶蛋白可以在与周围环境隔离的中间空腔内不受干扰的进一步折叠。第22页/共143页DNA

chaperones，DNA分子伴侣，是与DNA结合并帮助DNA折叠的蛋白质。DNA分子伴侣中DNA分子包围在蛋白质分子的表面，既高度有序，又一定程度上的结构改变。这种相互作用对DNA的转录，复制及重组十分重要。如在核小体中NA的包装。DNA分子伴侣的作用就是帮助DNA进行折叠和扭曲，从而把DNA稳定在一个适合于和蛋白结构的特定构型中。这种结合是协同的，可逆的。分子伴侣与最终阐明中心法则--当前主要问题有密切关系。DNA分子伴侣第23页/共143页帮助蛋白质折叠的酶帮助蛋白质折叠的酶目前只有两个：蛋白质二硫键异构酶(protein

disulfide

isomerasePDI);

肽基脯氨酸顺反异构酶(peptidylprolylcis-transisomerase，PPI)。第24页/共143页PDI，内质网管腔内多功能蛋白，除二硫键异构外，还是脯氨酸-4-羟化酶的α亚基，甘油三酯转移蛋白复合物小亚基，糖基化位点结合蛋白等。按分子伴侣的定义，PDI和分子伴侣是两类不同的帮助蛋白，但蛋白质二硫键异构酶是钙结合蛋白，能被磷酸化，具有分子伴侣功能。蛋白质二硫键异构酶催化二硫键的形成是一个快过程。酶可能首先通过它与伸展的或部分折叠的肽段结合，阻止错误的折叠途径，促进正确中间物生成，帮助肽链巯基正确配对，然后催化巯基氧化或二硫键异构而形成天然二硫键。蛋白质二硫键异构酶第25页/共143页热休克蛋白热休克蛋白HeatShockProteins(HSPs),是细胞在应激原特别是高温诱导下生成的一组蛋白质。广泛存在各生物中。许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。按照蛋白的大小共分为五类，分别为HSP100，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子热休克蛋白。HSP分子量都在80～110kD、68～74kD和18～30kD之间。不同分子量的HSP在细胞内的分布也有所不同HSP一个重要特点是进化的高度保守性第26页/共143页蛋白质折叠研究技术研究表明：每种蛋白质都用自身偏好的方式进行折叠。某些蛋白质可在十亿分之几秒内折叠起来，某些则要耗费数毫秒才能卷缩成首选结构。由于蛋白质折叠如此之快，所以对其研究很困难。费城宾夕法尼亚大学FengGai研究组创造出极简单的蛋白质，可折叠成最普通的螺旋。对蛋白质上氨基酸用C13标记，将它们放入水浴并用激光照射整个系统。激光对蛋白质加热十亿分之三秒，使其打开折叠。然后在重新折叠时用红外光谱观察C13和其他原子间化学键的变化情况。记录一段“延长了的”信号，表明蛋白质以不同的速度不同的途径进行折叠。Weizmann研究小组将蛋白“诱骗”到由脂质构成的小泡中，小泡约100纳米宽，蛋白质在小泡中可自由移动，能够被聚焦的激光束完全照射到（激光束约为300纳米宽）。研究证明即使最终形状一样的蛋白质也通过不同路线折叠。第27页/共143页多种技术结合：光谱学，波谱学和x

射线分析。快速核磁共振技术已经能够在秒到皮秒的时间域上观察蛋白质结构的运动过程，其中包括主链和侧链的运动，以及在各种不同的温度和压力下蛋白质的折叠和去折叠过程。快速光谱技术（荧光，远紫外和近紫外圆二色目前唯一解出晶体结构的分子伴侣是E.coli的papd帮助鞭毛蛋白折叠的分子伴侣。还有hsp70的n端结构域，即atp结合域也以有晶体结构。蛋白质折叠研究技术第28页/共143页分子伴侣研究的应用分子伴侣的研究成果必然会大大加深我们对生命现象的认识。由于分子伴侣在生命活动的各个层次都具有重要作用，它的突变和损伤也必定会引起疾病，因此可以期望运用分子伴侣的知识来治疗所谓的”分子伴侣病”。利用对分子伴侣的研究成果从根本上提高基因工程和蛋白工程的成功率。第29页/共143页蛋白质折叠病

两项新的科学研究：美国哈佛医学院塞尔科（Dennis

J.

Selkoe）在《自然》杂志上报告他们提取了百万分之一正常时产生β淀粉样蛋白和低聚体（二聚体、三聚体和四聚体），将之注入到实验室大鼠中，它严重地损害了大鼠产生记忆的能力。提出了阿兹海默病中有淀粉样蛋白形成的假设。英国剑桥大学多森（Christopher

M.

Dobson）研究小组在同一期杂志上报告说他们从细菌和牛体内提取出两种无害的蛋白质，使它们结构发生变化，产生折叠错误。结果变性后的蛋白质团块削弱了实验鼠的细胞功能。第30页/共143页蛋白质折叠病的历史早在三百年前，人类在绵羊和小山羊中首次发现了“羊搔痒症”。该病广泛传播于欧洲和澳洲，潜伏期18到26个月，患病动物兴奋、搔痒、瘫痪直至死亡。后来又相继发现了传染性水貂脑软化病、马鹿和鹿的慢性消瘦病、猫的海绵状脑病等。1996年春天英国蔓延的“疯牛病”，它不仅引起英国一场空前的经济和政治动荡，也波及了整个欧洲，人类朊病毒现已发现以下四种，即库鲁病、克雅氏综合症（法国克罗伊茨菲尔德—雅各布氏症）、格斯特曼综合症和致死性的家族失眠症，第31页/共143页蛋白质折叠病1983年“植物和动物亚病毒病源：类病毒和朊病毒国际会议”正式把朊病毒归入亚病毒领域。人:震颤病（KURU病）、克雅氏病（CJD）、吉斯综合症（GSS）、致死性家族失眠症（FFI）、老年性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固醇症、家族性淀粉样蛋白症、某些肿瘤、白内障等动物;羊瘙痒病（Scrapie）、牛海绵脑病（BSE俗称疯牛病）和鹿、猫、水貂等的海绵脑病致病蛋白质分子与正常蛋白质分子的组成完全相同，只是空间结构不同第32页/共143页朊病毒

prion第33页/共143页朊病毒朊病毒病的病原体究竟是什么？盖杜赛克等曾将库鲁病死者脑组织制成无菌、无原虫的悬浮液，注入黑猩猩的颅腔，20个月时，黑猩猩发病，其症状与人相似，提示病原体不是细菌或原虫。20世纪60年代，英国放射生物学家阿普（T.Alper）将羊搔痒症致病组织用会导致核酸失活的放射线辐射，发现处理过的致病组织仍有传染性，提出羊搔痒症的病因可能是不含核酸的蛋白质，但这样的观点有悖于“核酸为中心”的观念，因而当时未得到人们的重视。第34页/共143页朊病毒定名直至1982年，美国神经学与生物化学家鲁辛纳在致病因子的探寻方面作了8年研究之后，提出该致病因子确实不含核酸，而是蛋白质。为了能把他与细菌、真菌、病毒及其他已知病原体相区别，他将这种蛋白质致病因子定名为朊病毒（Prion），对应的蛋白质单体称为朊病毒蛋白，相应疾病称为朊病毒病。1997年美国生物学家斯垣利·普鲁辛纳（S.B.Prusiner）由于研究朊病毒获诺贝尔医学或生理学奖。第35页/共143页朊病毒与常规病毒朊病毒与常规病毒一样:可滤过性传染性致病性对宿主范围的特异性但它比已知的最小的常规病毒还小得多（约30～50nm）。电镜下观察不到病毒粒子的结构，且不呈现免疫效应，不诱发干扰素产生，也不受干扰作用。第36页/共143页朊病毒是蛋白质，它对蛋白质强变性剂如苯酚、尿素等的处理无耐受性，但却有不同于一般蛋白质的特征，即耐高温性和抗蛋白酶性。朊病毒目前尚未有有效的治疗方法，因此属“不治之症。”人们只能采取相应措施预防，如消灭染病牲畜，对病人进行适当隔离；禁止食用可能传染的食物，禁止使用可能污染的药物；对神经外科的操作器械进行严格处理，对角膜及硬脑膜的移植应排除供者患朊病者的可能；家族性疾病的未患病成员更应注意预防第37页/共143页朊病毒致病朊病毒蛋白既然是动物细胞基因编码的产物，为什么并不引起全部动物致病？这是由于朊病毒蛋白分子本身不能致病，而必须发生空间结构上的变化转化为朊病毒才会损害神经元。这一变化恰恰是朊病毒胁迫所致的。一个致病分子先与一个正常分子结合，在致病分子的作用下，正常分子转变为致病分子，然后这两个致病分子分别与两个正常分子结合，再使后者转变为致病分子。周而复始，通过多米诺效应倍增致病。由此可见，致病的基本条件有二，一是具有朊病毒，二是具有朊病毒蛋白。第38页/共143页朊病毒一般性质朊病毒是一种蛋白感染因子，Prusiner等人证明是细胞正常蛋白的错误折叠成的朊病毒蛋白（PrionProtein,PrP）积累而引起的。朊病毒蛋白(PrP)分子量为27-30KD，是朊病毒的基本单位，PrP本身不具有侵染性，由3个PrP分子构成的“朊病毒单位”具有高度侵染性。PrP还能聚合成杆状颗粒，约由1000个PrP构成,这种杆总是排列成丛。杆和丛都有传染性。PrP包括两种形式：细胞型（thenormalorcellularformofprionprotein,PrPc）和异常型（thepathogenicorscrapieformofprionprotein,PrPSc）。PrPc分子量33-35KD，含一对二硫键和2个N型复合寡糖链，都在PrP的C端。N端含22个氨基酸残基的信号肽，C端含由23个氨基酸组成的糖基磷酸肌醇锚体结合位点（GPI）。PrPc是一种膜蛋白，已证明它是定位于细胞膜的穴样内陷类结构域（CLDS）。第39页/共143页PrPSc与PrPc的不同生化特性PrPSc在非变性去污剂中是不溶的PrPSc相对的抗蛋白酶水解PrPc和PrPSc都依赖GPI附着在细胞膜表面经磷酸肌醇脂酶C酶解后，PrPc从膜上释放出来,而PrPSc不释放TritonX-100进行相分配后，PrPc处于水相,而PrPSc处于TritonX-100相中特异的抗体只与PrPSc有血清反应，而与PrPc

无反应，两者含有不同的构象表位。糖基化比例和部位不同：PrPSc糖基化比例要低于PrPC。朊病毒是蛋白质，它对蛋白质强变性剂如苯酚、尿素等的处理无耐受性，但却有不同于一般蛋白质的特征，即耐高温性和抗蛋白酶性。第40页/共143页蛋白质质量控制系统生命的进化使细胞获得了一种“蛋白质质量控制系统”。"质量控制体系"能够像处理垃圾一样，将错误折叠的蛋白质清除。细胞的“垃圾处理”系统运转失常，可能接触误折叠蛋白聚集成的不溶解颗粒，早老性老年痴呆及多种大脑疾病的通常症状折叠发生错误，这些疏水的残基就会暴露在分子的表面，误折叠的蛋白质就会聚集起来形成不溶物。这些不溶物中最著名的是在Alzheimers

disease症状中出现的淀粉斑－amyloid-β（Aβ）。

第41页/共143页库鲁病库鲁病（Kuru病）是20世纪上半世纪大西洋的巴布亚—新几内亚东部福雷族高地居民中的一种局部流行病，其主要症状为震颤、共济失调、脑退化痴呆，渐至完全丧失运动能力，3～6个月内因衰竭而死亡。“Kuru”在该部落意为“恐惧”或“寒颤”，故称该病为库鲁病，患者总数约为3万，以女性和未成年儿童居多。美国医学家盖杜赛克曾在该地区进行20年研究，探明该病的发生与当地人食用人肉的祭祀方式密切关联，并提出了预防措施。1968年停止该仪式后该病得到控制，从而拯救了一个部落的人群，盖杜赛克为此获得了1976年诺贝尔医学奖。第42页/共143页基因突变人类格斯特曼综合症和致死性的家族性失眠症已被确定是由于编码该蛋白的基因发生了突变，因此具有遗传性，这些突变致使所编码的蛋白质结构不稳定，易于转变为朊病毒。近年来已鉴定到数十个传播的家族。克雅氏综合症中10－15％由基因突变所致，现已鉴定到百来个传播的家族。库鲁病则被确定为传染性的疾病。疯牛病能否传染给人？至今还没有明确的答案。因为已经证明，不同的动物之间，朊病毒病的传染是与朊病毒蛋白氨基酸差别程度有关的。前年疯牛病的高发是与牛饲料添加剂中存在携带朊病毒的绵羊组织密切相关的。牛和羊的朊病毒蛋白有7个氨基酸的差别，而仓鼠与小鼠有16个氨基酸的不同，致使小鼠难于被仓鼠朊病毒感染。牛和人之间有30多个氨基酸的差别，远远大于仓鼠与小鼠之间的差别，似乎疯牛病不可能传染给人。然而，英国已有两位拥有“疯牛病”牛的农场主死于克雅氏综合症。英国4例新发现患者中，其中3位生活在10年前疯牛病频发区。因而不能排除疯牛病传播给人的可能性。第43页/共143页朊病毒传染途径以前认为朊病毒是引发疯牛病的主要蛋白，后来在正常的的神经系统内也发现了它，而近年研究又发现它与神经细胞的生长和凋亡有关，而且发现在低等的生物，如酵母中也有存在类似朊病毒行为的蛋白，这似乎表现朊病毒无处不在，包括极低等的生物中。ackson认为人感染朊病毒病有三种可能途径一是遗传突变，使朊病毒蛋白失去细胞型而易于折叠成致病型；二是医源性感染，如角膜转移手术中的捐献者为朊病毒的感染者三是饮食感染，如食用朊病毒病患者的脑组织。而Alter不认为遗传突变是感染朊病毒的病因，他提出自然得病学说，认为PrPSc可能是PrPC翻译后转变而成的。

第44页/共143页感染朊病毒病有三种途径一是遗传突变，使朊病毒蛋白失去细胞型而易于折叠成致病型；二是医源性感染，如角膜转移手术中的捐献者为朊病毒的感染者三是饮食感染，如食用朊病毒病患者的脑组织。而Alter不认为遗传突变是感染朊病毒的病因，他提出自然得病学说，认为PrPSc可能是PrPC翻译后转变而成的。第45页/共143页朊病毒的机理大多学者认为有一编码朊病毒氨基酸序列的基因组，此DNA不存在于朊病毒中，而是正常哺乳动物基因组的一部分。朊病毒的感染可活化或改变这一基因，使之转译出蛋白质。有人认为朊病毒中存在某种小的核酸片段，可能是基因活化的扳机。此片段插入到寄主细胞染色体的PrP基因前面，可作为基因表达的启动子或强化子。如果朊病毒本身只含有蛋白质，PrP本身可能结合到DNA控制PrP基因转录的区域而起到同样的作用。少数学者认为朊病毒是通过与生物中心法则不同的信息流来增殖的。它可能先由PrP转译成RNA或DNA，然后再合成子代PrP。

第46页/共143页朊病毒蛋白的构象转化朊病毒基因序列分析表明PrPC和PrPSc具有相同的氨基酸序列和共价修饰，利用变换红外光谱和圆二色谱研究证明两者间存在构象差别，牛朊病毒蛋白正常型（bPrPcL）中螺旋约占36.1%,折叠约11.9%，无规则卷曲约33%，转角约占19%，而PrPSc含43%折叠，30%螺旋。有研究者观测到在酸性条件下PrP有两种折叠途径，人PrP的90-231残基片段和鼠PrP的121-231残基片段在pH4.0的研究发现一个折叠平衡反应的中间体，这个中间体构象主为折叠，专家推测它就是PrPC向PrPSc转变反应的中间体。最近对人的PrP91-231的研究表明，在酸性条件下PrP可折叠成几乎全是折叠的可溶单体。现认为溶解性、pH、肽链内疏水基团间的作用和肽链与金属离子结合氧化还原电位共同决定PrP折叠途径。第47页/共143页PrPC是如何转变成PrPSc的呢？研究者提出两种不同的机理：种子模型重叠模式实际上，这两种模式并不是互相排斥的，在朊病毒繁殖过程中可能是这两种模式共同作用。第48页/共143页“种子”模型一种转换模式，即“种子”模型。PrPSc低级聚合物充当“种子”。在没有“种子”时，固有的PrPC和极少量PrPSc单体之间发生快速的可逆性构象变化。当条件适宜时，PrPSc分子之间可互补缔合而变得稳定，从而使平衡式向PrPSc方向反应，直至形成稳定的“种子”。“种子”通过互相粘着而继续生长，最后碎裂成小的感染单位。这种模式表现出聚合反应的一些特征，此模式已有科学实验支持。第49页/共143页重叠模式另一种转化模式是模板介导的转换过程，即重叠模式。这种模式认为PrPSc构象比PrPC稳定.在这种模式中，PrPSc依靠催化PrPC或一个不稳定的中间体的重排来提高转换，以形成更稳定的PrPSc构象。感染性将依赖于PrPSc结合和催化中间分子转换的能力。这种模式能够解释由于点突变而引起的遗传性朊病毒病。点突变的发生增加了不稳定的中间分子的数量，同时加快它转换PrPSc的速率。但此模型还无科学实验支持。

第50页/共143页致病原因经过将近20年的研究，朊病毒本质及引起细胞死亡的原因依然不清楚。现大多学者认为PrPSc是致病物。到目前为止最高浓度的富集制备物中,每105个PrP单体包含一个感染单元。研究表明PrP106-126片段对神经有直接毒害作用。当缺乏PrPC时神经元被氧化的可能性增大，这表明PrPC可能有抗氧化的功能。亦有人提出PrPC具有调整程序细胞死亡的功能，在感染过程中PrPC缺乏而导致细胞死亡。最近有许多报道在朊病毒感染的脑神经组织中发现了大量程序性细胞死亡，还不清楚这些细胞是否是由朊病毒的感染而引起的。但是，亦有系列实验证明PrPSc本身并无毒性。这些学者认为PrPSc的感染引起PrPC的缺乏，而PrPC的缺乏才是朊病毒病的真正病因。

第51页/共143页神经退性变疾病的致病机理神经退性变疾病的典型特点是选择性的神经元丢失、突触改变和神经元炎症，不同的疾病在脑内的受累区域不同，从而导致临床表现不相同。关于神经元丢失被认为是程序性细胞死亡所致，现有三种假说用以解释这一现象。一是被广泛接受的获得性毒性假说，认为蛋白质的错误折叠和聚集使其获得了神经毒性。二是炎症假说，认为异常的蛋白质聚集物作为一种刺激因子，在生物体脑组织中引起慢性炎症反应，从而导致神经元死亡和突触改变。三是功能丧失假说，认为神经元的退行性变化是蛋白质正常功能丧失所导致的。第52页/共143页蛋白质的运动蛋白质分子在执行生物功能时，整体分子是处于主动的不断运动之中的这种运动在10-12s至1s以上的一个很宽的时间范围内都存在结构上的柔性已不能完全说明这种主动的运动性第53页/共143页第54页/共143页

蛋白质分子构象运动的类型

主要包括：

氨基酸残基侧链运动:运动范围较小，利用核磁共振技术观察。蛋白质分子与其他大分子或小分子相互作用时；蛋白质分子大范围的构想运动也往往包含氨基酸残基侧链构象变化。

肽链片段运动:较为普遍，有多种表现形式。

结构域或亚基运动：大范围运动分为两种类型,一是类似免疫球蛋白分子中结构域的运动性式，柔性肽链构象的可变性；另一种结构域之间有广泛的相互作用第55页/共143页变构效应肌红蛋白和血红蛋白的结构Hb和Mb的氧解离曲线T态--R态第56页/共143页肌红蛋白和血红蛋白的结构辅基---血红素（铁卟啉衍生物）血红素侧链铁卟啉卟啉环Fe++

4吡咯环4甲炔基

第57页/共143页血红素第58页/共143页Hb和Mb的氧解离曲线10080604020020P50406080100静脉血动脉血氧分压(mmHg)氧饱和度第59页/共143页T态---紧张态（tensestate）

R态---松弛态（relaxedstate）第60页/共143页盐键第61页/共143页分子马达天然的分子马达，如：驱动蛋白、RNA聚合酶、肌球蛋白等，在生物体内参与了胞质运输、DNA复制、细胞分裂、肌肉收缩等一系列重要生命活动。分子马达包括线性推进和旋转式两大类。其中线性分子马达是将化学能转化为机械能，并沿着一条线性轨道运动的生物分子，主要包括肌球蛋（myosin）、驱动蛋白（kinesin）、DNA解旋酶（DNAhelicase）和RNA聚合酶(RNApolymerase)等。第62页/共143页Kinesin发现于1985年，是由两条轻链和两条重链构成的四聚体（图9-21），外观具有两个球形的头（具有ATP酶活性）、一个螺旋状的杆和两个扇子状的尾。通过结合和水解ATP，导致颈部发生构象改变，使两个头部交替与微管结合，从而沿微管“行走”，将“尾部”结合的“货物”（运输泡或细胞器）转运到其它地方。据估计哺乳动物中类似于kinesin的蛋白超过50余种，大多数KLP能向着微管（+）极运输小泡，也有些如Ncd蛋白（一种着丝点相关的蛋白）趋向微管的（-）极。第63页/共143页Kinesin第64页/共143页肌球蛋白和驱动蛋白的运动周期模型第65页/共143页ATP酶的结构示意图第66页/共143页蛋白质构象运动与功能的关系

蛋白质发挥特定的生物学功能，是由于它具有一个独特的、精巧的空间构象，即保持相对稳定的结构，又随不同程度的环境变化发生构象运动。结构的稳定性和可变性是具有生物活性的蛋白质分子发挥功能必需的两个方面。建立运动与时间、运动与功能的精确关系构象运动的研究有助于全面地认识生命的本质

第67页/共143页蛋白质结构转换（Structural

transformation,Structural

switch）

结构转换与构象变化不同，是指较大程度的结构变化。

1.同源肽段的结构转换

2.二级结构的转换

3.蛋白质淀粉样化

第68页/共143页同源肽段的结构转换

许多实验表明:蛋白质多肽片段在水溶液中具有与原同源肽段不一定相同的二级结构;同一片段在不同的溶剂环境中能进行二级结构的构象转变;甚至同一肽段在不同的蛋白质中的二级结构也不一样.蛋白质中肽链序列虽然有一定的构象形成势,但不是绝对的,有时随着环境因素的变化而进行结构的转换.,很可能这是蛋白质为了适应生物功能调节和进化的要求所必需的生理转化。第69页/共143页二级结构的转换

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)家族是研究蛋白质结构转换的典型范例.体内新合成的或体外再折叠复性的纤溶酶原激活物抑制剂具有蛋白酶抑制剂的活力(A型),A型抑制剂的活性部位是一段Loop区域,此结构可直接插入靶蛋白酶的活性中心形成复合物从而抑制蛋白酶的活性.有意思的是A型抑制剂能够慢慢转化成无活性的潜伏型(L型)抑制剂,其Loop区肽链转换为β折叠链加入抑制剂蛋白的β折叠片层中.因此,抑制剂活性部位有关的残基被包埋导致活力丧失.从上述例子可以看出,这种Loop/β间的二级结构转换构成蛋白质活性调节的开关.第70页/共143页第71页/共143页前体肽辅助蛋白质折叠

一些蛋白酶新合成的蛋白质产物含有一段前体肽.前体蛋白能够自发地折叠成正确的三维空间结构.然后通过蛋白酶的自身酶解切除前体肽,得到有蛋白酶水解活性的成熟蛋白酶.虽然成熟蛋白是相当稳定的,但若通过体外变性,却不能重新折叠成有生物活性的功能蛋白.可是,如果在复性过程中加入前体肽,则又能再折叠成有活性的蛋白酶分子。显然,前体肽对于成熟蛋白的再折叠和复性是至关重要的.生物为什么选择蛋白酶前体,?仅仅是为了保证成熟蛋白的正确折叠?一种解释是生物体存在着自身调节的因素.为了协调蛋白质合成和蛋白质降解的矛盾,选择失去再折叠能力的成熟蛋白酶,以保证生物体对于蛋白酶活力的控制.第72页/共143页独特性：要求序列不具有其他构象，因此，自由能必须最低化。稳定：周围环境小变化不能产生构象变化，的最低配置。这可以想象自由能源表面看起来很像咖啡杯而不是汤盘;为了提供稳定表面的自由能必须是相当陡峭和高。动力学无障碍：是指非折叠状态到折叠状态，表面自由能必须合理地顺利进行，换句话说，折叠链不得涉及非常复杂的形状变化。第73页/共143页在大多数情况下，许分子折叠多是相同的。

在粗糙的水平，看来在过渡到三级结构，氨基酸序列上采取大致相同的路线和收益。

折叠往往涉迅速建立二级与超二级结构，尤其是α-螺旋和β片，然后三级结构。

四级结构形成通常是已经折叠亚基组装或共组装。蛋白质折叠可能涉及共价键，二硫键的形成或金属簇合物。分子可能通过一个中间“熔融球”状态。第74页/共143页熔球

Moltenglobule

熔融球（moltenglobule(MG)）是一个，部分折叠的蛋白稳定状态，在轻度变性的条件，如低pH值（pH=2）轻度变性或高温发现。熔融球是倒塌的，一般二级结构和动态三级结构。熔融球发现在某些蛋白质折叠中，尤其是球状蛋白质进行疏水崩陷。

术语“熔融球”也用来指某些蛋白质折叠中间体，比天蛋白质能量高，但低于变性状态。熔融球歌在蛋白质折叠和

折叠是大致相同。可作为一些蛋白质折叠动力学过程的模型第75页/共143页ForcesDrivingtheFoldingofGlobularProteins

球蛋白的折叠由此产生的形成三级结构的过程中发现的推动力：该肽链都必须（1）满足制约其自身的内在结构和（2）倍，以“埋葬”的疏水侧链，最大限度地接触溶剂。L-氨基酸是一种必然的趋势，以扭转稍微用右手的方向发展。第76页/共143页L-aminoacids,hasatendencytotwistslightlyinaright-handeddirection.

第77页/共143页Globularproteinscanbepicturedasconsistingof“layers”ofbackbone,withhydrophobiccoreregionsbetweenthem.Overhalftheknownglobularproteinstructureshavetwolayersofbackbone(separatedbyonehydrophobiccore).Roughlyone-thirdoftheknownstructuresarecomposedofthreebackbonelayersandtwohydrophobiccores.Therearealsoafewknownfour-layerstructuresandoneknownfive-layerstructure.第78页/共143页Examplesofproteindomainswithdifferentnumbersoflayersofbackbonestructure.(a)Cytochromec.(b)Domain2ofphosphoglyceratekinase,(c)Anunusualfive-layerstructure.(d)Theconcentric“layers”ofb-sheet(inside)anda-helix(outside)intriosephosphateisomerase.第79页/共143页Locationandfunctions

Manychaperonesareheatshockproteins,thatis,proteinsexpressedinresponsetoelevatedtemperaturesorothercellularstresses.Somechaperonesacttorepairthepotentialdamagecausedbymisfolding.Otherchaperonesareinvolvedinfoldingnewlymadeproteinsastheyareextrudedfromtheribosome.Althoughmostnewlysynthesizedproteinscanfoldinabsenceofchaperones,aminoritystrictlyrequiresthem.Macromolecularcrowdingmaybeimportantinchaperonefunction.Sinceacompactfoldedproteinwilloccupylessvolumethananunfoldedproteinchain.However,crowdingcanreducetheyieldofcorrectly-foldedproteinbyincreasingproteinaggregation.Crowdingmayalsoincreasetheeffectivenessofthechaperoneproteins,whichcouldcounteractthisreductioninfoldingefficiency.第80页/共143页Chaperoninsarecharacterizedbyastackeddouble-ringstructureandarefoundinprokaryotes,inthecytosolofeukaryotes,andinmitochondria.Othertypesofchaperonesareinvolvedintransportacrossmembranes,forexampleinthemitochondriaandendoplasmicreticulum(ER)ineukaryotes.Bacterialtranslocation-specificchaperonemaintainsnewlysynthesizedprecursorpolypeptidechainsinatranslocation-competent(generallyunfolded)stateandguidesthemtothetranslocon.Newfunctionsforchaperonescontinuetobediscovered,suchasassistanceinproteindegradationandinrespondingtodiseaseslinkedtoproteinaggregation.第81页/共143页Amodelforthestepsinvolvedinthefoldingofglobularproteins.Chaperoneproteinsmayassistintheinitiationofthefoldingprocess.第82页/共143页人类伴侣蛋白内质网中的（ER）一般伴侣：BiP，GRP94，GRP170。凝集素的伴侣：calnexinandcalreticulin非经典分子伴侣：HSP47和ERp29折叠伴侣：蛋白质二硫键异构酶，肽脯氨酰顺反异构酶，第83页/共143页BiPBindingimmunoglobulinprotein(BiP)(alsocalledglucoseregulatedprotein78,Grp78)isamolecularchaperonethatusesATP/ADPcyclingtoregulateproteinfoldingbytheProteinDisulfideIsomerase(PDI)familyofproteins.Itisa78kDaglucose-regulatedheatshockproteinandisinvolvedinunfoldedproteinresponse.HSPA5isitshumangene.Itbindstoimmunoglobulinheavychain.Heatshockprotein90kDabeta(Grp94),member1isahumanchaperoneprotein.HSP90B1isthehumangeneencodingit.Glucose-regulatedproteinisaproteinintheendoplasmicreticuluminthecell.Glucose-regulatedproteincomesinseveraldifferentmolecularmasses,including:Grp78(78kDa),Grp94(94kDa),Grp170(170kDa),whichisahumanchaperoneprotein.第84页/共143页Calnexin(CNX)Calnexin(CNX)isa90kDaintegralproteinoftheendoplasmicreticulum(ER).Itconsistsofalarge(50kDa)N-terminalcalcium-bindinglumenaldomain,asingletransmembranehelixandashort(90residues),acidiccytoplasmictail.Calnexinisoneofthechaperonemolecules,whicharecharacterizedbytheirmainfunctionofassistingproteinfoldingandqualitycontrol,ensuringthatonlyproperlyfoldedandassembledproteinsproceedfurtheralongthesecretorypathway.ThefunctionofcalnexinistoretainunfoldedorunassembledN-linkedglycoproteinsintheendoplasmicreticulum.Iftheglycoproteinisnotproperlyfolded,anenzymecalledUGGT(forUDP-glucose:glycoproteinglucosyltransferase)willaddtheglucoseresiduebackontotheoligosaccharidethusregeneratingtheglycoprotein'sabilitytobindtocalnexin.ATPandCa++aretwoofthecofactorsinvolvedinsubstratebindingforcalnexin.CalnexinalsofunctionsasachaperoneforthefoldingofMHCclassIalphachaininthemembraneoftheER.AfterfoldingiscompletedCalnexinisreplacedbyCalreticulin,whichassistsinfurtherassemblyofMHCclassI第85页/共143页CalreticulinCalreticulinisamultifunctionalproteinthatbindsCa2+ions,renderingitinactive.TheCa2+isboundwithlowaffinity,buthighcapacity,andcanbereleasedonasignal(seeinositoltriphosphate).Calreticulinislocatedinstoragecompartmentsassociatedwiththeendoplasmicreticulum.Calreticulinisalsoknownascalregulin,CRP55,CaBP3andcalsequestrin-likeprotein.Theterm"Mobilferrin“isconsideredtobethesameascalreticulinbysomesources.第86页/共143页HSP47,ERp29

Heatshockprotein47,alsoknownasSERPINH1isaserpinwhichservesasahumanchaperoneproteinforcollagen.Thisproteinamemberoftheserpinsuperfamilyofserineproteinaseinhibitors.Itsexpressionisinducedbyheatshock.Theproteinlocalizestotheendoplasmicreticulumlumenandbindscollagen;thusitisthoughttobeamolecularchaperoneinvolvedinthematurationofcollagenmolecules.Autoantibodiestothisproteinhavebeenfoundinpatientswithrheumatoidarthritis.Endoplasmicreticulumprotein29(ERp29)isahumanchaperoneprotein.ERP29isthehumangeneencodingit.第87页/共143页Nomenclatureandexamplesofbacterialandarchealchaperones

TherearemanydifferentfamiliesofchaperonesEachfamilyactstoaidproteinfoldinginadifferentway.Manychaperonesareheatshockproteins.Inbacterialikee.Coli,manyoftheseproteinsarehighlyexpressedunderconditionsofhighstress,forexample,whenplacedinhightemperatures.Forthisreason,theterm"heatshockprotein"hashistoricallybeenusedtonamethesechaperones.Theprefix"hsp"designatesthattheproteinisaheatshockprotein.第88页/共143页Chaperoninsarecharacterizedbyastackeddouble-ringstructureandarefoundinprokaryotes,inthecytosolofeukaryotes,andinmitochondria.Otherchaperonesareinvolvedinfoldingnewlymadeproteinsastheyareextrudedfromtheribosome.Althoughmostnewlysynthesizedproteinscanfoldinabsenceofchaperones,aminoritystrictlyrequiresthem.Othertypesofchaperonesareinvolvedintransportacrossmembranes,forexampleinthemitochondriaandendoplasmicreticulum(ER)ineukaryotes.Bacterialtranslocation-specificchaperonemaintainsnewlysynthesizedprecursorpolypeptidechainsinatranslocation-competent(generallyunfolded)stateandguidesthemtothetranslocon.Newfunctionsforchaperonescontinuetobediscovered,suchasassistanceinproteindegradationandinrespondingtodiseaseslinkedtoproteinaggregation.第89页/共143页Heatshockprotein

Heatshockproteins(HSP)areagroupofproteinswhoseexpressionisincreasedwhenthecellsareexposedtoelevatedtemperaturesorotherstress.Thisincreaseinexpressionistranscriptionallyregulated.Thisdramaticupregulationoftheheatshockproteinsinducedmostlybyheatshockfactor(HSF)isakeypartoftheheatshockresponse.TheHSPsarenamedaccordingtotheirmolecularweights.Forexample,Hsp60,Hsp70andHsp90(themostwidely-studiedHSPs)refertofamiliesofheatshockproteinsontheorderof60,70and90kilodaltonsinsize,respectively.Thesmall8

kilodaltonproteinubiquitin,whichmarksproteinsfordegradation,alsohasfeaturesofaheatshockprotein.第90页/共143页Historyof

HSPIn1962,RitossareportedthatheatandthemetabolicinhibitordinitrophenolinducedacharacteristicpatternofpuffinginthechromosomesofDrosophila.Thisdiscoveryeventuallyledtotheidentificationoftheheat-shockproteins(HSP)orstressproteinswhoseexpressionthesepuffsrepresented.IncreasedsynthesisofselectedproteinsinDrosophilacellsfollowingstressessuchasheatshockwasfirstreportedin1974.Beginninginthemid-1980's,investigatorsrecognizedthatmanyHSPsfunctionasmolecularchaperonesandthusplayacriticalroleinproteinfolding,intracellulartraffickingofproteins,andcopingwithproteinsdenaturedbyheatandotherstresses.Accordingly,thestudyofstressproteinshasundergoneexplosivegrowth.第91页/共143页UpregulationthroughstressProductionofhighlevelsofheatshockproteinscanalsobetriggeredbyexposuretodifferentkindsofenvironmentalstressconditions,suchasinfection,inflammation,exercise,exposureofthecelltotoxins(ethanol,arsenic,tracemetalsandultravioletlight,amongmanyothers),starvation,hypoxia(oxygendeprivation),nitrogendeficiency(inplants),orwaterdeprivation.Consequently,theheatshockproteinsarealsoreferredtoasstressproteinsandtheirupregulationissometimesdescribedmoregenerallyaspartofthestressresponse.Scientistshavenotdiscoveredexactlyhowheat-shock(orotherenvironmentalstressors)activatestheheat-shockfactor.However,somestudiessuggestthatanincreaseindamagedorabnormalproteinsbringsHSPsintoaction.第92页/共143页MonitoringHeat-shockproteinsalsooccurundernon-stressfulconditions,simply"monitoring"thecell'sproteins.Someexamplesoftheirroleas"monitors"arethattheycarryoldproteinstothecell's"recyclingbin"andtheyhelpnewlysynthesisedproteinsfoldproperly.Theseactivitiesarepartofacell'sownrepairsystem,calledthe"cellularstressresponse"orthe"heat-shockresponse".第93页/共143页ChaperonefunctionofHSPHeatshockproteinsaremolecularchaperonesforproteinmolecules.Theyareusuallycytoplasmicproteinsandtheyperformfunctionsinvariousintra-cellularprocesses.Theyplayanimportantroleinprotein-proteininteractionssuchasfoldingandassistingintheestablishmentofproperproteinconformationandpreventionofunwantedproteinaggregation.Byhelpingtostabilizepartiallyunfoldedproteins,HSPsaidintransportingproteinsacrossmembraneswithinthecell.SomemembersoftheHSPfamilyareexpressedatlowtomoderatelevelsinallorganismsbecauseoftheiressentialroleinproteinmaintenance.Cancer第94页/共143页

StructureandfunctionoftheGroEL-GroEScomplex.(a)Space-fillingrepresentationandoveralldimensionsofGroEL-GroES(topview,left;sideview,right).GroESisgold;thetopGroELringisgreenandthebottomGroELringisred.第95页/共143页(c)Successivecyclesofproteinbindingandreleasewiththechaperonincentralcavity,ATP-dependentrelease,andprogressivefoldingendsinreleaseoftheproteinfromthecomplexinitsfullyfoldedform.第96页/共143页Proteindisulfideisomerase

ProteindisulfideisomeraseorPDIisanenzymeintheendoplasmicreticulumineukaryotesorperiplasmicspaceofprokaryotes

PDIcatalyzestheformationandbreakageofdisulfidebondsbetweencysteineresidueswithinproteinsastheyfold.Thisallowsprotein