柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究专家讲座

柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡影响及其机制试验研究辽宁中医药大学从属医院肿瘤科·潘玉真

柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第1页研究背景

临床利用柴胡龙牡汤治疗存在咳嗽、咳痰等肺经症状肺癌患者43例，显效5例（12%），有效31例（72%），无效7例（16%），总有效率（显效＋有效）达84%

[1]

。体内试验研究已证实，该药含有抑制Lewis肺癌细胞生长作用，对荷瘤小鼠抑瘤率可达31.4%

[2]

。[1]调整气机治疗肺癌肺经症状43例临床研究.秦海运，殷东风;实用中医内科杂志,,23(4)80-82.[2]肺积宁方对C57小鼠肺癌VEGF蛋白表示和生存质量影响．当代肿瘤医学，,17（6）：1042-1045.柴胡龙牡汤前期研究柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第2页中药与细胞凋亡研究肿瘤发生不但因细胞过分增殖，还与细胞凋亡机制受到抑制不能正常进行细胞死亡去除相关细胞凋亡过程多原因、多基因联合作用结果。中药复方成份更为复杂，其作用多步骤、影响细胞凋亡方面可能更为有效辽宁中医药大学从属医院中药与细胞凋亡细胞凋亡与肿瘤研究背景柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第3页

实验动物C57BL/6J

近交系小鼠，共

60只，4-6

周龄，清洁级，体重18-20g，雌雄各半。中国医学科学院医学试验动物研究所提供，喂养于辽宁中医药大学试验动物中心。辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院实验材料柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第4页瘤株Lewis肺癌瘤株(LewisLungcarcinomaLLC)，为小鼠起源上皮样肺腺癌细胞。由中国医科大学免疫教研室提供。辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院实验材料柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第5页柴胡龙牡汤药品组成：由柴胡、龙骨、牡蛎、黄芩、半夏、太子参、桔梗、炙甘草等11味中药组成。药品煎煮方法：先后用10倍水煎60min、8倍水煎煮40min

，合并煎煮液，过滤后，浓缩至1.0g生药/ml，置于

4℃冰箱保留备用。辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院实验药品柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第6页顺铂顺铂(DDP)：齐鲁制药有限企业产品,制剂规格为10mg/ml。每次给药前用0.9%

生理盐水，把10mg

顺铂稀释成1mg/ml

顺铂注射液备用。辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院实验药品柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第7页动物造模细胞株复苏及C57BL/6J

小鼠体内传代

注入小鼠腹腔中，每只小鼠注射0.2ml。加入2ml生理盐水吹打混匀离心两次每次5min37℃水浴箱-80℃冰箱辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第8页动物造模模型制备辽宁中医药大学镜下调整细胞浓度为1×107/ml无菌抽取小鼠腹腔积液腹部隆起显著小鼠0.2ml/只，接种于小鼠右侧腋部皮下辽宁中医药大从属医院柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第9页动物分组-模型组中药组化疗组综合组正常组肺癌模型组接种肺癌瘤株，不做治疗处理。中药柴胡龙牡汤组接种肺癌瘤株，并中药治疗。单纯顺铂化疗组接种肺癌瘤株，并化疗。柴胡龙牡汤＋顺铂综合组接种肺癌瘤株，中药联合化疗处理。正常对照组不做造模及治疗处理。共分

5

组辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第10页实验给药

辽宁中医药大学化疗组顺铂注射液0.1ml/只/

d

（DDP0.1mg）

腹腔注射化疗，共3

次，于第1、3、5天给药。同时生理盐水0.4ml/只/d灌胃，共12天中药组柴胡龙牡汤0.4ml/只/

d

（含生药0.4g）

灌胃，共连续12天。第1、3、5天，生理盐水0.1ml/只/

d

，腹腔注射。辽宁中医药大学从属医院柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第11页实验给药

辽宁中医药大学综合组顺铂注射液给药剂量、方法同化疗组，柴胡龙牡汤使用方法同中药组。模型组正常组0.9%生理盐水0.4ml/只/

d

灌胃，共连续12天。并于第1、3、5天，0.9%生理盐水0.1ml/只/

d

，腹腔注射。辽宁中医药大学从属医院柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第12页实验取材

各组小鼠均于末次给药后24小时进行取材完整剥离出瘤体，称重后于冰盒上，将瘤块切开在无坏死区共取材3份，标本块大小约为1mm3

。

辽宁中医药大学Text蛋白测定

电镜检测

免疫组化检测

马上置于-20℃冰箱中冻存备用。

于戊二醛固定液中，4℃冷藏备用。

置于甲醛固定液中备用。

辽宁中医药大学从属医院柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第13页统计分析统计学分析采取SPSS11.0软件包。计量资料

进行单原因方差分析（One-WayANOVA），组间比较采取最小显著差法（LSD）方法。等级资料采取非参数统计方法--秩和检验辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第14页实验指标透射电镜下观察肿瘤组织超微结构改变检测肿瘤组织中TNFα

蛋白表示，采取免疫组织化学法凋亡相关基因Bax、

Bcl-2、Caspase3蛋白表示，用Westernblot方法探讨柴胡龙牡汤诱导Lewis肺癌细胞凋亡分子作用机制

辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第15页肿瘤细胞透射电镜观察展现出恶性肿瘤细胞特征。细胞核显著增大，核浆百分比失调，核膜完整，双层核膜清楚，核异形性显著，细胞膜完整，胞质内线粒体肿胀嵴断裂消失，偶见粗面内质网，散在核糖体颗粒。模型组-Lewis肺癌细胞

辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院结果线粒体粗面内质网柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第16页中药组-凋亡细胞

展现出细胞凋亡早期特点。细胞体积显著缩小，细胞膜结构完整，核膜稍扩张，核形不规整，核内异染色质增多、边集，浓缩成团块状或新月状，分布在核膜内侧。细胞质内细胞器基本正常。H异染色质辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院肿瘤细胞透射电镜观察结果异染色质柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第17页化疗组-坏死细胞

细胞体积异常增大，核大畸变，胞质内线粒体、粗面内质网扩张，核糖体颗粒脱落。说明存在重度炎性反应。

辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院肿瘤细胞透射电镜观察结果柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第18页中药组-凋亡小体

化疗组-凋亡小体

综合组-凋亡小体

凋亡小体：由膜包绕，小体内可见核残片及胞质。

辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院肿瘤细胞透射电镜观察结果凋亡小体凋亡小体凋亡小体柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第19页瘤组织中TNFα免疫组化染色TNFα阴性(400×)TNFα阳性(400×)

细胞浆无棕色与背景着色一致细胞浆内出现均一棕黄色和深棕褐色颗粒状染色

辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院结果柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第20页结果瘤组织中TNFα

免疫组化染色结果结果分为4级:未见阳性细胞为(-)；阳性细胞数＜25%为(+)；阳性细胞数在25%～50%之间为(++)；阳性细胞＞50%为(+++)。

组别

N

TNFα染色结果

模型组10---中药组10++

化疗组8---综合组9++

辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第21页1234模型组中药组化疗组综合组Bcl-2、Bax、Caspase3

蛋白表示电泳图辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院结果柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第22页结果瘤组织中

Bcl-2、Bax

及Caspase3蛋白表示结果(x±S)—

组别

N

Bcl-2BaxBcl-2/BaxCaspase3

模型组10189.62±19.19☆△78.45±9.55★△

2.4131.12±4.60★△

中药组10

178.34±18.28◆△114.40±13.59

▲1.5647.20±5.80

△化疗组8

158.45±16.9

★121.60±13.38

☆1.3060.65±7.35

★综合组9145.22±14.63

★133.6±14.63

★1.0881.03±10.3

★

△△△与模型组比较：

p﹤0.01，◆

p﹤0.05；

与中药组比较：★p﹤0.01，☆

p﹤0.05；与化疗组比较：

△

p﹤0.01，▲p﹤0.05。辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第23页结果瘤组织中

Bcl-2、Bax

及Caspase3蛋白表示结果与中药组比较：

★p﹤0.01；☆p﹤0.05。★★

★★★★★☆☆辽宁中医药大学辽宁中医药大学从属医院柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第24页正气内虚

邪毒血瘀

痰湿

讨论辽宁中医药大学肺宣发肃降功效失司，气机紊乱而发病

肺积病因病机病因柴胡龙牡汤对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响和其机制的实验研究第25页造成五脏六腑、阴阳气血功效活动紊乱、障碍,从而产生对应种种病理改变。升降出入动态失衡柴胡龙牡汤理、法、方、药升降平衡理论

丹溪《局方发挥》“一升一降,无有偏性,是谓平人。”

讨论

调畅气机辽宁中医药大学《,素问·