化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用

化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第1页第一节化学物质对蛋白质沉淀作用化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第2页一、沉淀作用类型1．可逆沉淀(非变性沉淀

)条件温和结构和性质不改变分离和纯化蛋白质基础方法含有个别纯化、浓缩特点等电点沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第3页一、沉淀作用类型2．不可逆沉淀（变性沉淀

）强烈沉淀条件破坏了蛋白质胶体溶液稳定性破坏了蛋白质结构和性质加热沉淀强酸碱沉淀重金属盐沉淀3．抗体-抗原沉淀化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第4页二、沉淀剂类型1．无机物沉淀（1）盐析盐析方程lgS=lgS0-KsISo代表当离子强度为零时溶解度；S为蛋白质在某一离子强度溶液中溶解度；I为中性盐离子强度；Ks为盐析常数，Ks值越大，该盐盐析效果很好化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第5页阴离子对蛋白质盐析影响较显著，而阳离子影响次之。含高价阴离子盐，效果比1价盐好阴离子盐析效果高价阳离子效果不如低价阳离子对于1价阳离子：

NH4+>K+>Na+最常见盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或磷酸钠枸橡酸盐

>PO43->SO42->CHCOO->Cl->NO3->SCN-化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第6页（2）金属离子沉淀法①Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+

与蛋白质分子表面羧基、氨基、咪唑基、胍基等侧链结合②Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+

与蛋白质分子表面羧基结合，但不与含氮化合物相结合③Ag2+、Hg2+与蛋白质分子表面巯基相结合化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第7页2．等电点沉淀适合用于疏水性较强蛋白质化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第8页优点：（1）很多蛋白质等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常较廉价；（2）一些酸，如磷酸、盐酸和硫酸应用能为蛋白质类食品所允许；（3）常可直接进行其它纯化操作，无需将残余酸除去。缺点：酸化时易使蛋白质失活化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第9页3．有机物沉淀主要效应是水活度降低（1）有机溶剂优点：溶剂易蒸发除去，无残留用途：适合用于制备食品蛋白质缺点：易使蛋白质变性失活，且有机溶剂易燃、易爆，安全要求较高最常见溶剂是乙醇和丙酮化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第10页（2）酚类化合物及有机酸沉淀鞣酸（又称单宁）、苦味酸（即2，4，6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸水解类单宁缩合类单宁化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第11页单宁-蛋白质结合是分子识别经典例子。要考虑作为供体多酚和作为受体蛋白质分子组成、结构和构型，也要考虑它们协同作用。Haslam等认为，可用“手-手套”(Hand-in-Glove)模型说明此反应。蛋白质分子中疏水基团较集中部位组成“疏水袋”，单宁分子进入“疏水袋”中并经过氢键加强结合。所以影响单宁与蛋白质结合原因有：单宁分子尺寸，分子量大于500时产生较牢靠结合；单宁酚羟基和疏水基数量多者结合强；含有柔性分子构型者结合强；水溶性低者结合强。所以水解单宁收敛性与其所含疏水基多少有直接关系，缩合单宁则与其聚合程度相关，往往前者收敛性大于后者。化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第12页4．聚合物沉淀（1）非离子型聚合物沉淀法（2）聚电解质沉淀法羧甲基纤维素、海藻酸盐、果胶酸盐和卡拉胶聚丙烯酸聚乙二醇（PEG）化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第13页第二节化学物质对蛋白质稳定作用化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第14页蛋白质变性：一些物理或化学原因破坏了维持蛋白质结构天然状态，引发蛋白质理化性质改变并造成其生理活性丧失现象蛋白质不可逆失活化学原因强酸和强碱氧化剂：分子氧、H2O2、过氧化物(如过氧甲酸)、氧自由基去污剂和表面活性剂：十二烷基硫酸钠（SDS）变性剂：8~10mol/L脲、6mol/L盐酸胍、有机溶剂、EDTA重金属离子和巯基试剂：Hg2＋、Cd2＋、Pb2＋、巯基乙醇化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第15页使蛋白质稳定化学方法（1）固定化（2）添加剂（3）化学修饰共溶剂抗氧化剂和还原剂底物、辅酶金属离子化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第16页第三节化学物质对蛋白质侧链基团共价修饰作用化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第17页一、生物体内蛋白质加合物形成相互作用方式非共价结合共价结合不可逆化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第18页1．

可与蛋白质发生反应化合物化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第19页2．蛋白质分子中可反应基团氨基酸氨基和羧基丝氨酸和苏氨酸所特有羟基半胱氨酸巯基精氨酸胍基组氨酸咪唑基酪氨酸中酚基色氨酸吲哚基化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第20页3．与白蛋白共价结合4．与血红蛋白共价结合5．与细胞内蛋白共价结合化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第21页二、特定氨基酸残基侧链基团修饰蛋白质侧链基团修饰是经过选择性试剂或亲和标识试剂与蛋白质分子侧链上特定功效基团发生化合反应而实现作用：探测活性部位结构选择好修饰试剂判断必需基团性质和数目化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第22页1．巯基化学修饰烷基化试剂（碘乙酸、碘乙酰胺）多肽链氨基酸次序分析过程中预防半胱氨酸氧化N-乙基马来酰亚胺有较强专一性和光吸收改变，易于确定反应程度5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第23页有机汞试剂（对氯汞苯甲酸）

溶于水中形成羟基衍生物，与巯基相互作用时在255nm处光吸收含有较大增强效应化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第24页2．氨基化学修饰非质子化赖氨酸ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高基团三硝基苯磺酸（TNBS）与赖氨酸残基反应，在420nm和367nm能够产生特定光吸收2,4-二硝基氟苯（DNFD）法、丹磺酰氯（DNS）法和苯异硫氰酸酯（PITC）法都是常见氨基修饰方法。化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第25页3．羧基化学修饰水溶性碳化二亚胺类化合物化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第26页4．咪唑基化学修饰组氨酸残基咪唑基能够经过氮原子烷基化或碳原子亲核取代来进行修饰。焦碳酸二乙酯（DPC）是最常见修饰组氨酸残基试剂。化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第27页5．酚和脂肪族羟基化学修饰四硝基甲烷（TNM）是酪氨酸残基修饰最常见修饰试剂化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第28页6．胍基化学修饰丁二酮或1，2-环乙二酮与胍基反应可逆地生成精氨酸-丁二酮复合物化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第29页苯乙二醛能够与精氨酸残基不可逆结合4-羟基-3-硝基苯乙二醛可使被修饰精氨酸残基在405nm处含有光吸收效应。对硝基苯乙二醛修饰精氨酸残基能够得到含有旋光性惟一产物，在pH9.0情况下能够用340nm处光吸收值来定量。化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第30页三、亲和性标识亲和性标识试剂优点：能够选择性地结合在蛋白质分子表面上特定部位含有饱和性，与底物或天然配体竞争蛋白质分子结合位点。两种类型光亲和标识试剂自杀性抑制剂化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第31页第四节蛋白质光谱探针化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第32页紫外吸收或荧光光谱进行蛋白质定量分析理论基础：蛋白质含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基，在280nm附近有最大光吸收，而且在340~350nm有荧光发射。蛋白质光谱探针：就是能与蛋白质发生相互作用无机离子、有机小分子或络合物，这些物质与蛋白质结合生成超分子复合物之后，体系光谱性质发生改变，从而能够提供蛋白质浓度或结构方面信息。化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第33页一、蛋白质吸光探针1．金属探针（1）双缩脲法双缩脲在碱性溶液中与铜离子（Cu2+）生成紫红色化合物反应，可在540nm测量吸光度紫红色化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第34页（2）Folin-Lowry法产物最大光吸收波长：640nm优点：比双缩脲法灵敏100倍缺点：反应受各种原因干扰，在显色灵敏度方面存在差异。应用范围：本法可测定范围是25~250μg/mL蛋白质化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第35页（3）二喹啉甲酸法（BCA，bicinchoninicacid）原理：碱性条件下，蛋白质分子中肽键与铜离子反应生成Cu＋，Cu＋再与BCA反应形成紫色络合物，在565nm测量吸光度。优点：试剂稳定，干扰少，各种蛋白质之间显色差异小化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第36页2．染料探针原理：利用蛋白质与染料结合成沉淀或改变结合染料光吸收特征，借助染料颜色减退或改变程度来测定蛋白质含量。λ＝600nm化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第37页考马斯亮蓝G-250测蛋白质含量λ＝595nm优点：使用方便，反应时间短，染色稳定，对显色时间不严格要求，抗干扰性强，为常见蛋白浓度测定方法。该法线性范围1~2μg/mL，是灵敏度最高染料探针分析方法。化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第38页二、蛋白质荧光探针作为一个好荧光探针应满足以下条件：①探针分子与蛋白质分子某一微区必须有特异性结合，而且结合比较牢靠。②探针荧光必须对环境条件敏感。③蛋白质分子与探针结合后不影响其原来结构和特征。在满足这些条件基础上可进行蛋白质测定及与金属离子结合计量化学等。化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第39页常见蛋白质荧光探针1-苯氨基-8-萘磺酸（ANS）

与组合蛋白质在酸性条件下结合时能产生很强荧光，激发峰位于375nm，荧光峰位于500nm，可用于组蛋白含量测定化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第40页常见蛋白质荧光探针αβγδ-四（对磺苯基）卟啉（TPPS4）微量蛋白质对TPPS4含有荧光猝灭作用，能够测定纳克级蛋白质。化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第41页常见蛋白质荧光探针2-对甲苯氨基萘-6-磺酸（TNS）1-（N-二甲胺）萘-5-磺酸（DNS）荧光胺αβγδ-四（对羧苯基）卟咻（TCPP）铬天青S吖啶橙化学生物学化学物质和蛋白质的相互作用第42页三、蛋白质光散射探针共振光散射技术研究小分子物质与蛋白质、核