免疫重组dna技术

免疫重组dna技术免疫重组dna技术第1页Identificationofrecombinantclones免疫重组dna技术第2页相关帮助需要相关抗体试剂能够访问Fantibody全球抗体搜索引擎:fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索抗体数据库，其抗体信息数据起源于全球范围研究机构与商业企业。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两个别组成，以帮助研究者更高效寻找并评定该抗体性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂应用型检索平台需要相关试验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊疗试剂及耗材与技术服务信息，能够访问探生网进行咨询，期待您加入免疫重组dna技术第3页1.ScreeningTheprocessofidentifyingoneparticularclonecontainingthegeneofinterestfromamongtheverylargenumberofothersinthegenelibrary.byinsertioninactivation;byalpha-complementation;bynewcharacteristicsgeneratedbyinsertedgenes;bydifferentkindsofmolecular

hybridization;byimmunochemistrytechnology.免疫重组dna技术第4页1.InsertioninactivationvectorcarryingtwoormoreantibioticresistancegenescloningsiteswithintheoneofantibioticresistancegenedisruptionofgenebyinsertionoftheforeignDNA免疫重组dna技术第5页pBR322免疫重组dna技术第6页（1）Tetracyclin(四环素)：（2）Ampicilin(氨苄青霉素抗性基因)：Example:pBR322

plasmid产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Ampicillin）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长细菌，但不杀死停顿生长细菌。（3）Cycloserine(环丝氨酸)：免疫重组dna技术第7页假如在Tetr上插入外源DNA，造成四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活免疫重组dna技术第8页无环丝氨酸培养基免疫重组dna技术第9页（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程假如Ampr上插入外源DNA，造成氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。免疫重组dna技术第10页2.alpha-complementation/applications/images/gel_cleanup1.jpgvectorcarryinglacZgene–encodesforN-terminusof β-galactosidase(α-fragment)hostchromosomecarryingC-terminalofβ-galactosidase (ω-fragment)IPTG(isopropyl-[beta]-D-thiogalactopyranoside)

–inducerX-Gal–substratefortheenzymecloningsiteswithintheLacZgenedisruptionofgenebyinsertion oftheforeignDNAblue–functionalproteinwhite–non-functionalprotein免疫重组dna技术第11页-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++深蓝色1.原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）片段（氨基端），其上有外源DNA插入位点。受体菌基因组中有突变-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。能够被IPTG诱导表示。载体和受体菌基因组能够互补形成完整有功效-半乳糖苷酶。免疫重组dna技术第12页Procudure:免疫重组dna技术第13页Selectthewhiteclones免疫重组dna技术第14页利用插入外源基因表示产物特征进行直接选择。（只在特定条件下）。转化进来外源基因产物能够填补受体菌株突变型缺点。3.1填补缺点his-his+受体菌：外源基因：在不含组氨酸培养基中生长3.Selectionbynewcharacteristicsgeneratedbyinsertedgenes

免疫重组dna技术第15页小鼠二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。DHFR载体连接转化受体菌三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板含DHFR克隆才能生长例：使被转化受体菌表现出外源基因表型。3.2增加新性状免疫重组dna技术第16页4.HybridizationSouthernhybridization–DetectionofDNAbyDNAprobeNorternhybridization–DetectionofRNAbyDNAprobeWesternhybridization–DetectionofProteinbyantibodyprobe免疫重组dna技术第17页HybridizationtoidentifytheinterestedDNAoritsRNAproductRadiolabeledprobeswhichiscomplementarytoaregionoftheinterestedgeneProbes:AnoligonucleotidederivedfromthesequenceofaproteinproductofthegeneADNAfragment/oligofromarelatedgeneofanotherspeciesBlottingtheDNAorRNAonamembraneHybridizethelabeledprobewithDNAmembrane(Southern)orRNA(Northern)membrane免疫重组dna技术第18页TransfertheDNAintheplaqueorcolonytoaNylonornitrocellulosemembranePhageDNAbindtothemembranedirectlyBacterialcoloniesmustbelysedtoreleaseDNAonthemembranesurface.Hybridization(inasolutionContainingNucleicacidprobe)Washtoremoveunhybri-dizationprobeandvisualize

X-rayfilm(radio-activelylabeled)antibodyorenzyme(modifiednucleotidelabeledLineupthehybridizatedregionorrepeatedhybridization(Alkalitreatment)免疫重组dna技术第19页TransfertonitrocelluloseornylonmembraneDenatureDNA(NaOH)BakeontomembraneProbewith32p-labledDNAcomplementarytogeneofinterestExposetofilmSelectpositivefrommasterplateKeepmasterplate

Screeningbyplaquehybridization免疫重组dna技术第20页UseDNA(orRNA)probetodetectDNAsamples;ProbehybridizeswithitscomplementaryDNA;4.1Southernblot免疫重组dna技术第21页ASouthernblotresult免疫重组dna技术第22页Veryeasytoidentifythepositiveclone4.2insituhybridization免疫重组dna技术第23页免疫重组dna技术第24页4.3NorthernblotUseDNA（orRNA)probletodetectRNAsamples;主要检测插入片断是否被转录。从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。免疫重组dna技术第25页2.ElectrophoresisanalysisenzymaticdigestionPCRreaction免疫重组dna技术第26页Electrophoresisanalysisisbasedontheprincipalthatthemolecularweightofrecombinantvectorislargerthanthewildone.2.1Directanalysis从转化后菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。MWMarkerNoinsertWithinsert免疫重组dna技术第27页2.2Analysisafterdigestion依据已知外源DNA序列限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用适当内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计结果。免疫重组dna技术第28页BeforedigestionInsertedfragementVectorAfterdigestion免疫重组dna技术第29页ABA或B免疫重组dna技术第30页免疫重组dna技术第31页Exampleofanelectrophoresisgelafterdigestion免疫重组dna技术第32页筛选过程免疫重组dna技术第33页2.3PCRanalysis（1）Extracttheplasmidsfromrecombinantclones;（2）AmplifytheinsertedfragmentbyPCR;（3）ElectrophoresisofthePCRproduct;（4）VerifythesizeofPCRproduct.免疫重组dna技术第34页Thepolymerasechainreaction(PCR)istousedtoamplifyasequenceofDNAusingapairofprimerseachcomplementarytooneendofthetheDNAtargetsequence.免疫重组dna技术第35页ThePCRcycleDenaturation:ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing:Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesupdNTPsandrequiredMg++.免疫重组dna技术第36页免疫重组dna技术第37页TemplatePrimersEnzymesFig.StepsofPCRJ2nucleicacidsequencing免疫重组dna技术第38页TemplateAnysourceofDNA

thatprovidesoneormoretargetmoleculescaninprinciplebeusedasatemplateforPCRWhateverthesourceoftemplateDNA,PCRcanonlybeappliedif

somesequenceinformationisknown

sothat

primerscanbedesigned.

免疫重组dna技术第39页PrimersPCRprimersneedtobeabout18to30ntlongandhavesimilarG+Ccontentssothattheyannealtotheircomplementarysequencesatsimilartemperatures.Theyaredesignedtoannealonoppositestrandsofthetargetsequence.Tm=2(a+t)+4(g+c):determineannealingtemperature.Iftheprimeris18-30nt,annealingtemperaturecanbeTm5oC免疫重组dna技术第40页EnzymesandPCROptimizationThemostcommonisTaqpolymerase.Ithasno3’to5’proofreadingexonucleaseactivity.Accuracyislow,notgoodforcloning.WecanchangetheannealingtemperatureandtheMg++concentrationorcarryoutnestedPCRtooptimizePCR.免疫重组dna技术第41页Selectionbyimmunochemistrytechnology免疫重组dna技术第42页利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌而且表示出对应蛋白质外源基因。依据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）性质可分为几个作用方式：一、放射性抗体检测法1.抗体与产物结合方式对表示产物检测。蛋白——蛋白“杂交”免疫重组dna技术第43页待测基因产物蛋白一抗二抗125I标识二抗结合蛋白固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗125I标识二抗固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗固相支持滤膜固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗二抗125I标识二抗结合蛋白125I标识二抗免疫重组dna技术第44页2.放射性抗体检测法过程免疫重组dna技术第45页二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因表示产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。1.原理抗原——抗体凝集反应。检测分泌型产物。2.方法免疫重组dna技术第46页对于不能被分泌到菌体外蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。免疫重组dna技术第47页三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linkedimmunosorbantassay1.原理：一抗（primaryantibody）:

与目标分子特异结合。二抗（secondaryantibody）：与一抗特异性结合。酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一个酶能催化一个反应将无色底物转变为有色物质（或发光），再经过比色测定有色物质含量（或光强度），从而推测目标分子含量。免疫重组dna技术第48页待测基因产物蛋白一抗二抗酶待测基因产物蛋白一抗二抗无色底物有色产物比色观察酶19免疫重组dna技术第49页2.ELISA检测普通步骤（1）固定样品将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）孔中，干燥后就被固定在孔底。孔底免疫重组dna技术第50页加入一抗，反应后冲洗掉未结合抗体。（2）一抗结合一抗免疫重组dna技术第51页加入二抗，与一抗结合后再将未结合二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一个酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。（3）二抗结合二抗免疫重组dna技术第52页加入无色底物，被二抗上所带酶催化反应转变成有色物质（或发光）。（4）显色反应免疫重组dna技术第53页免疫重组dna技术第54页在特殊分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。（5）比色免疫重组dna技术第55页3.ELISA不足有效，但准确性稍差（主要取决于一抗特异性）。必须与其它方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（monoclonalantibody）免疫重组dna技术第56页四、免疫印迹（westernblot）法1.原理：在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫方法检测胶上蛋白质泳带。（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质变性剂，使煮沸变性蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。①SDS:（SDS）：免疫重组dna技术第57页②聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在电场作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动速率主要取决于其分子量大小（链长短），从而把不一样分子量肽链分开。电泳buffer电泳buffer免疫重组dna技术第58页点样电泳方向免疫重组dna技术第59页③蛋白质电泳分子量标准已知分子量蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量预计。商品化供给Da道尔顿(质量单位,等于一氧原子质量十六分之一。一克约为6×1023道尔顿免疫重组dna技术第60页DaltonSDSPAGE免疫重组dna技术第61页④凝胶中蛋白质染色：考马斯亮蓝：灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可褪色回收。硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。2）转到膜上进行染色。1）直接染色免疫重组dna技术第62页直接染色电泳结果免疫重组dna技术第63页（2）Westernblotting电泳胶里蛋白质带能够用电转方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。①Western（转膜）胶里蛋白质带在电场作用下横向转移到正极一侧膜上。膜胶蛋白免疫重组dna技术第64页Western装置免疫重组dna技术第65页②Blot原理与ELISA相同。待测蛋白硝酸纤维素膜一抗二抗辣根过氧化物酶底物产物，并发出光PAGE胶待测蛋白底片曝光辣根过氧化物酶：HRPO免疫重组dna技术第66页免疫重组dna技术第67页1）先用一抗（待测蛋白单克隆抗体）与膜上蛋白结合。2）洗去未结合一抗。3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。4）清洗掉未结合二抗。5）用HRPO底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。③Blotting过程ImmunoBlotting免疫重组dna技术第68页④结果多克隆抗体Blotting结果单抗blotting结果免疫重组dna技术第69页4.DNAsequencing免疫重组dna技术第70页DNAsequencingTwomainmethods:MaxamandGilbertchemicalmethod

theend-labeledDNAissubjectedtobase-specificcleavagereactionspriortogelseparation.Sanger`senzymicmethod()

thelatterusesdideoxynucleotidesaschainterminatorstoproducealadderofmoleculesgeneratedbypolymeraseextensionofprimer.

免疫重组dna技术第71页GATCTCGATCTCGGCH3TCTCGATCTCGADNAlabeledatoneendwith32PBasemodificationReleaseordisplace-mentofreactedbasesStrandscissionMaxamandGilbertchemicalmethod免疫重组dna技术第72页32pGpCpTpGpCpTpApGpGpTpGpCpCpGpApGpC32p32pGpCpTp32pGpCpTpGpCpTpAp32pGpCpTpGpCpTpApGp32pGpCpTpGpCpTpApGpGpTp32pGpCpTpGpCpTpApGpGpTpGpCpCp32pGpCpTpGpCpTpApGpGpTpGpCpCpGpAp32pGpCpTpGpCpTpApGpGpTpGpCpCpGpApGpCChaincleavageatguanines

Max