免疫组织化学与杂交组化原理和实验

第一章理论基础theoreticbasis

免疫组织化学和杂交组织化学是一门原位示踪染色技术。学科交叉产物。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第1页理论基础是基于利用放射性核素和其它标识物（荧光素，酶，重金属离子等）作为示踪剂，经过免疫亲和（抗原-抗体特异性结合）和核酸杂交（碱基配对特异性连接）路径，在组织切片或细胞涂片上，原位显示生物大分子动态改变而建立一门染色技术。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第2页

基本特点是“特异,灵敏，准确，形态、机能、代谢三位一体”，系分子病理学研究惯用伎俩。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第3页学习重点有四：

1.名词概念；

2.技术原理；

3.操作要领；

4.结果判断标准

（尤其是对照染色和假阳性假阴性判别）。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第4页第一节抗原1.抗原概念凡能在机体内引发体液免疫和/或细胞免疫反应物质,称为抗原。

免疫组织化学与杂交组化原理和实验第5页抗原主要含有两方面特征，抗原能引发机体产生抗体和/或致敏淋巴细胞，称之为免疫原性；抗原还与对应抗体及致敏淋巴细胞发生特异性结合或反应，称为免疫反应性。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第6页有免疫原反应性而缺乏免疫原性抗原称为半抗原，半抗原与载体（通常是大分子物质）结合，可变为全抗原，载体不但增加半抗原大小，可在体内激发免疫反应，而且还直接与免疫记忆相关。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第7页2.抗原化学结构

一个天然抗原含有二种结构，一是高分子载体（抗原性）；二是抗原决定簇（特异性）。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第8页

抗原决定簇（antigenicdeterminant）又称抗原表位（epitope.)是指抗原分子上含有决定和控制抗原特异性特殊化学基团,可与对应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合部位。大多数蛋白质抗原可有多个抗原决定簇,但因为空间位阻作用,在同一时间内仅有部分抗原决定簇暴露和对应抗体结合。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第9页3.抗原性质及种类异性`大分子`特异为抗原共同性质，凡种系越远`分子量越大`构型越复杂`抗原决定簇暴露越多，则其抗原性越强，特异性越高。抗原特异性是临床诊疗`预防`治疗基础。

免疫组织化学与杂交组化原理和实验第10页

抗原类型繁多，分类方法也很多，故抗原名称各种各样（表1-1-1）。

抗原有可溶和不溶性两类，后者主要包含一些颗粒性抗原，如细胞`细胞器`一些病原体等。依据性质，抗原又可分为：

免疫组织化学与杂交组化原理和实验第11页①结构抗原，为组成细胞结构成份，如细胞骨架蛋白；②分泌抗原，为细胞所产生和分泌酶`激素`粘液蛋白等；③沉淀抗原，如肾小球肾炎时，沉淀在肾小球基膜免疫球蛋白`补体和免疫复合物等；④入侵抗原，主要指病原微生物。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第12页4.抗原分离纯化普通标准

免疫组化方法检测抗原中，蛋白质占了大多数，故此处叙述普通标准以蛋白抗原为主要对象。

免疫组织化学与杂交组化原理和实验第13页⑴首先选择和建立抗原检测方法目标是跟踪监测一系列提纯过程中抗原是否存在，其含量和活性怎样。方法有特异和非特异之分，前者利用抗原特异反应，后者利用抗原已知理化特征。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第14页⑵选择抗原含量高组织为材料

组织中欲提抗原含量越高，提纯也越轻易，且得率越高。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第15页⑶操作中应保持抗原分子稳定性

如低温、严格pH、预防巯基氧化、在缓冲液中加入浓度1―3×10ˉ4MEDTA（乙二胺四乙酸）以螯合除去重金属离子、预防蛋白酶水解作用，等等。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第16页5.抗原分离纯化普通步骤

⑴增溶溶解

惯用方法有①渗透溶胞;②研磨;③绞切;④超声波;⑤挤压,等。⑵分离纯化

标准是“先粗后细，先简后繁，先盐析后层析”。⑶抗原纯度判定方法有：琼脂双扩散、免疫电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、等电点聚焦电泳等。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第17页6.惯用分离纯化方法计有：⑴差异溶解法其中最惯用是盐析法，又以中性盐硫酸铵最为惯用。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第18页⑵层析法其中有①离子交换层析（DEAE、CM、QAE等）；②选择性吸附层析，如羟基磷灰石可选择性地吸附中性和酸性蛋白而排除硷性蛋白；③分子筛层析（葡聚糖凝胶）；④亲和层析。⑶制备电泳法如PAGE制备电泳分离条带切割等。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第19页第二节抗体1.抗体概念抗体（antibody）是机体经过体液免疫，由B淋巴细胞活化、增殖、分化浆细胞合成并分泌与刺激抗原发生特异性结合反应免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第20页抗体是免疫球蛋白，而免疫球蛋白不都含有抗体活性。二者在概念上并不完全等同，抗体是生物学和功效上命名，而Ig是结构和化学本质上概念。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第21页2.抗体基本结构①因为无抗体话性Ig普通极少见，故抗体与Ig可认作为同义词。人类Ig有五类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，是由其分子结构中对应重链（H链）—α.δ.ξ.γ和μ决定。重链不一样，Ig类型就不一样。轻链（L链）则在同一抗体分子（Ig）中是相同，或为κ，或为λ。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第22页若轻链不一样表明该Ig和抗体是杂系、多克隆；反之，轻链单一、同型则表示该Ig或抗体是单克隆。②Ig单体基本结构是由二条相同轻链和二条相同重链组成，各自链间（轻–重或重–重链）由二硫键（–S–S–）相连接，呈Y字构型（图解）免疫组织化学与杂交组化原理和实验第23页③Ig分子氨基酸构型可分为可变区（N-端）和恒定区（C-端）两部份。⒊抗体特征①Ig都是大分子蛋白质，既含有免疫原性，又含有能与对应抗原结合抗体活性。

免疫组织化学与杂交组化原理和实验第24页②免疫原性类属特异性是由Ig分子重链和轻链恒定区特定氨基酸序列所决定，而免疫原性型属特异性（独特征或遗传性idiotype）则是由重链和轻链可变区特定氨基酸序列所决定。抗体活性位点存在于Ig可变区。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第25页酶切所形成片段――Fab或F（ab’）2只保持抗体活性，而无抗原活性；

Fc段主要由Ig两条不完整重链恒定区序列组成（-S-S-连接），只具抗原或免疫原活性，而无抗体活性。Ig结合补体或巨噬细胞位点也存在于H-链恒定区。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第26页③Ig由B淋巴细胞衍生浆细胞生成，主要以可溶性蛋白形式存在于体液中。④Ig主要生物学功效有：特异性结合抗原；活化补体；结合Fc受体等。⑤一个抗体（Ig）分子含有两个结合位点（两价）。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第27页⒋抗体种类⑴依起源分━①免疫抗体；②天然抗体；③本身抗体。⑵依反应分━①完全抗体；②不完全抗体。⑶依制剂或制备方法分——①多克隆抗体；②单克隆抗体；③基因工程抗体。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第28页⒌抗体制备

⑴抗血清（多克隆抗体——针对同一抗原多个抗原决定簇抗体）制备流程①免疫原（抗原或抗原+佐剂）准备。包含抗原抽提、纯化和剂量核实（1mg/ml）；佐剂乳化；半抗原处理等。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第29页*佐剂是一个非特异免疫增强剂，可增强免疫反应，提升抗体效价，惯用福氏佐剂由85%石蜡油和15%羊毛脂组成（半佐剂），如加卡介苗(100ml佐剂中含卡介苗200mg）则为完全佐剂（FCA）。普通首次注射时用其1/2体积与等量抗原进行乳化。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第30页第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。判断乳化是否充分，可将一滴乳化好液体滴在水面上，如能长时间保持园珠形而不散开，表示乳化到达要求。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第31页*半抗原处理半抗原只有免疫反应性而无免疫原性，半抗原必须与大分子载体结合才能激发机体产生抗体，惯用载体有血兰蛋白、卵白蛋白、牛血清白蛋白等。二者交联方法和原理是：免疫组织化学与杂交组化原理和实验第32页利用-NH2，-COOH等功效基团，用戊二醛或碳化二亚胺（R′-N=C=N=R″）作为交联剂可将半抗原结合到载体上，其结合百分比为5KD结合5—25个分子小肽，交联完成后，还必须纯化与载体结合半抗原。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第33页

②动物选择选择什么动物来免疫取决于所需抗血清量，小白鼠只能提供1.0-1.5ml血液，而山羊却能提供好几升；其次看你有多少抗原用于免疫动物，小白鼠不到50微克就足够，而山羊却要几毫克；免疫组织化学与杂交组化原理和实验第34页另外，还要考虑动物品系，免疫动物与提供抗原动物之间种系差异越大越好，比如哺乳动物比较保守蛋白抗原可选择非哺乳动物（鸡）来制备抗体。惯用动物有兔、羊、马、猪等，以兔（新西兰兔，要求：年青，健壮，体重在2.5千克左右，雄性）为最惯用。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第35页③免疫方法*路径：能够肌肉、静脉、皮内、皮下或腹腔注射，普通以皮内注射效果最好，多部位比单部位好，大动物普通不用腹腔注射，颗粒抗原和使用佐剂时不能I.V.。另外还可用淋巴结内注射来免疫，此法可大大降低抗原用量。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第36页

*次数及间隔时间：次数普通为2-3次，首次注射后，10-15天再加强注射，剂量同首次或为首次二分之一，用不全佐剂或不用佐剂；至于间隔时间，普通而言，动物越大，间隔越长，豚鼠、大鼠为7-8天；兔子为10-15天；羊为14-28天；有时第三次注射间隔时间更长些，效果更加好。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第37页因为各动物之间个体差异颇大，故应多免疫几个动物从中选择效价高。*效价测定：惯用方法有“琼脂免疫双扩散、免疫电泳、ELISA、免疫组化”等方法。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第38页*放血或定时抽血：兔子和羊是从颈动脉插管来放血，豚鼠和大鼠则可从心脏穿刺抽血，小鼠可采取眼球摘除来采血，鸡往往从腋动脉取血。血液凝固后，及时离心搜集血清。加叠氮钠，分装，低温保留，也可加一定保护剂如牛血清白蛋白、甘油等。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第39页

⑵单克隆抗体（针对单一抗原决定簇抗体）制备流程——普通分六个步骤：①免疫动物

绝大多数McAb是用小鼠免疫活性细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而建立杂交瘤细胞所产生。普通用腹腔注射路径来免疫雄性BALB/c小鼠。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第40页可溶性蛋白抗原剂量，最低每次1μg，惯用10-20μg/次，抗原充分时，可用到每次50μg，但不要超出每次200μg，总量不超出500μg；如抗原为细胞，每次用量为106个细胞，普通注射2-3次，取尾静脉血测效价，用效价高小鼠作细胞融合。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第41页②细胞融合惯用聚乙二醇（PEG）作融合剂，PEG分子量为1000-3000，惯用1500，其浓度为50%（W/V），如用离心法融合，则用30%PEG。融合时，骨髓榴细胞与小鼠脾细胞百分比在1：4-1：12之间，免疫后小鼠脾赃约含5×107-2×108个淋巴细胞，每次融合需骨髓瘤细胞2×107，融合前培养细胞密度2×105为宜。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第42页③选择培养惯用HAT（次黄嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶核苷）培养液来进行选择培养，其原理是HAT培养液抑制细胞正常路径DNA合成，因为骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK），不能进行补救路径DNA合成，在HAT培养液中正常路径DNA合成被抑制后就无法生存；免疫组织化学与杂交组化原理和实验第43页脾细胞虽含有这两种酶，在HAT培养液中能够生存，但没有致裂原和其它生长因子，脾细胞也不能分裂；只有脾细胞和骨髓瘤细胞融合后生成杂交瘤细胞，现有这两种酶又能无限制生长，在HAT培养液中可顺利增殖。但经选择后生长杂交榴可能是多克隆，故必须进行克隆化。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第44页④克隆化惯用方法有软琼脂培养、有限稀释法、显微操作法。软琼脂培养就是将高度稀释杂交瘤细胞培养在低浓度琼脂中，单个细胞增生后可形成界限清楚克隆，将单个克隆挑出进行再培养；免疫组织化学与杂交组化原理和实验第45页有限稀释法，即将含一定数量细胞悬液，经屡次倍比稀释，直至于96孔培养板每个孔可能只含一个细胞，再进行培养，但一次操作常不能到达目标，普通要重复三次以上；显微镜法是在显微镜下用微吸管吸出单个细胞进行培养。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第46页

检验克隆化是否成功，判断方法是，当把一个产生所需抗体阳性培养孔中细胞经有限稀释移至于96孔板上生长时，若全部孔都产生一样抗体，说明克隆化已经完成；如部分孔分泌抗体，部分孔不分泌抗体，说明最少有两个不一样克隆同时存在，还需深入克隆化。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第47页⑤抗体检测抗体检测目标是筛选分泌所需抗体单克隆杂交瘤株，检测方法应事先建立。惯用方法有ELASA法、放射免疫法和免疫组织化学法等。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第48页⑥扩大培养有两种路径，一是体外培养，其优点是可大量生产，缺点是培养上清液中单抗含量低，仅5-40μg/ml，而且培养液中常含血清，纯化带来麻烦，而且长久培养污染不易控制；免疫组织化学与杂交组化原理和实验第49页二是体内方法，即在小鼠腹腔接种杂交瘤细胞，方法是先用石蜡油腹腔注射以刺激腹水产生，七天后，在腹腔中接种地107细胞（细胞密度最好在2×107/ml）。体内方法优点是单抗浓度高，可达10mg/ml腹水，还可定时、连续抽取腹水，并不易污染，缺点是一旦小鼠死亡或患病，将一无所得。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第50页

⑶基因工程抗体特点和制备

基因工程抗体又称重组抗体，它是在充分认识Ig基因结构与功效基础上，应用DNA重组技术和蛋白质工程技术，按照客观需求在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成新型抗体分子。特点是既保留了天然免疫抗体特异性和主要生物学活性，并去除或降低了无关结构。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第51页6.抗体纯化抗体所在抗血清、腹水或培养液中，其它成份甚多，如要标识抗体时，必须提纯抗体，以免受杂蛋白干扰。用不一样方法，可得到不一样纯度抗体：中性盐盐析法只能得到粗IgG；离子交换层析法（DEAE-52）可得到较纯IgG组分；免疫组织化学与杂交组化原理和实验第52页普通来说，抗体试剂纯度可按以下制剂次序逐步递增：全血清或腹水-γ球蛋白-IgG（粗提-细提）-特异性抗体（免疫纯IgG）-特异性抗体片段（Fab或F（ab´）2）。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第53页葡萄球菌蛋白A（SPA）亲和层析法可得到更纯IgG组分；而用抗原亲和层析柱进行亲和层析或用免疫沉淀法则可得到只针对该抗原特异性IgG；如再将这特异性IgG用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行酶解，则可得到特异性抗体Fab段，葡萄球菌蛋白A（SPA）亲和层析法可得到更纯IgG组分；而用抗原亲和层析柱进行亲和层析或用免疫沉淀法则可得到只针对该抗原特异性IgG；如再将这特异性IgG用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行酶解，则可得到特异性抗体Fab片段。其中：免疫组织化学与杂交组化原理和实验第54页前者酶解产生二分子Fab和一个完整Fc段，后者酶解则产生一个F（ab′）2和Fc段碎片。Fab优点是分子量小，易渗透，而且也可进行标识，同时因无Fc段，可消除抗体与含有Fc受体无关细胞结合，从而大大降低假阳性。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第55页

⑶基因工程抗体特点和制备

基因工程抗体又称重组抗体，它是应用DNA重组技术和蛋白质工程技术制备抗体，特点是：①无种系异源性，不会诱发宿主免疫反应；②能直接制备人源性抗体；免疫组织化学与杂交组化原理和实验第56页③不但保持鼠源性单抗特异性和亲和力等优点，而且其免疫作用更强；④应用范围加宽，使用路径增多，针对性更强，可广泛应用于免疫学研究和肿瘤免疫基因治疗；⑤可作为建立“抗体库”筛选试剂。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第57页

*“

抗体库（antibodicbank）”是指经过将某种生物体全部抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表示，再利用不一样抗原与其反应，从而筛选出携带特异抗体基因克隆，并由此而取得对应高亲和力特异性抗体一项基因工程技术。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第58页第三节补体系统

⒈补体（complement）概念

补体是一类存在于人和动物血清中含有酶活性、能与任何抗原抗体复合物发生结合反应复合蛋白质。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第59页⒉补体性质补体由9个成份11种血清蛋白质组成，即C1┄C9及C1q、C1r和C1s。C1q可经过两种激活路径即经典激活路径和旁路激活路径，并按一定补体激活次序展现连锁酶促反应，最终成为一个化学介质或免疫效应物质参加机体免疫病理过程。在免疫组化工作中，主要作为制备证实有没有免疫复合物存在桥连抗体示踪试剂。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第60页第四节核酸⒈核酸是组成一切生物细胞生命活性物质基本成份，由多个核苷酸分子连接而成，为此，核酸又叫多聚核苷酸。核酸是由碱基、戊糖和磷酸三种成份组成大分子化合物，可分二大类：去氧核糖核酸（DNA）及核糖核酸（RNA）。

免疫组织化学与杂交组化原理和实验第61页⒉DNA

主要以双股链存在于细胞核内，其基本成份为碱基（A、G、T、C）、去氧戊（核）糖及磷酸。DNA分子结构有三级：一级结构为长核苷酸单链；二级结构为双股核苷酸链组成双螺旋模型；三级结构为超螺旋结构。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第62页DNA复制和转录均是在其双股链解聚成单链后，按照碱基互补规律（A-G，T-C，G-A，C-T或U-C，C-U）进行。链间氢键能量相对较低，体外高温即可解链，这是核酸杂交理论基础。免疫组织化学与杂交组化原理和实验第63页⒊核糖核酸（RNA）

主要存在于细胞浆内，以单链形式存在，由碱基（A、G、U、C）、戊糖和磷酸分子所组成，依其功效可分为四类：转运核糖核酸（tRNA）、信使核糖核酸（m