分枝杆菌课件

第14章分枝杆菌、

放线菌与诺卡菌

概述分枝杆菌与放线菌属放线菌目（Actinomycetates）分枝杆菌属（Mycobacterium）是一类细长略带弯曲专性需氧性杆菌。该菌一般认为革兰染色阳性。多数细菌在生长的一定时期抵抗酸-醇（acid-alcohol-fast），故又称抗酸杆菌（acid-fastbacillus）放线菌（Actinomyces）是一群在生物学特性上与细菌类同的原核细胞型微生物，与分枝杆菌、棒状杆菌等有着亲缘关系放线菌是多数不致病，对人致病的主要有放线菌属和诺卡菌属。前者为厌氧或微需氧菌，细胞壁中不含分枝菌酸，多引起内源性感染。后者为需氧菌，细胞壁中含有分枝菌酸，非人体正常菌群的成员，常引起外源性感染。概述结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）简称结核杆菌人和动物结核病的病原菌第一节结核分枝杆菌MTB包括人结核分枝杆菌（M.tuberculosis）牛分枝杆菌（M.bovis）非洲分枝杆菌（M.africanum）坎纳分枝杆菌（M.canettii）田鼠分枝杆菌(M.microti)等前四种对人类致病，其中人型MTB感染率最高一、分类WHO已把结核病与AIDS、疟疾一起列为人类的最主要杀手二、临床意义

二、临床意义

(一)所致疾病

通过呼吸道、消化道和损伤的皮肤等多途径感染机体，引起多种脏器的结核病，其中以肺结核为多见(二)免疫性有菌免疫或称传染性免疫细胞免疫

迟发型超敏反应二、临床意义

(三)变异结核分枝杆菌易发生形态、菌落、生长温度、毒力以及耐药性的变异卡介苗（BacillusCalmette-Guérin，BCG）是有毒力的牛型结核分枝杆菌在甘油、胆汁和马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒变异株现已广泛用于人类结核病的防治三、微生物学检验（一）基本特性结核分枝杆菌尚未发现产生内毒素、外毒素及侵袭性酶致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症、代谢物质的毒性以及菌体成分引起的免疫损伤有关结核分枝杆菌的致病物质主要是荚膜、脂质和蛋白质三、微生物学检验（二）标本采集据感染部位的不同采集不同的标本疑肺结核：收集清晨第一口痰，清洁干燥的容器内送检疑泌尿系结核：清晨一次全部尿量或24小时尿沉淀10～15ml送检，必要时作无菌导尿送检（诊断泌尿道结核通常需3～5份标本）采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物,深部脓肿用无菌注射器抽取送检其他：无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌试管送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养三、微生物学检验（三）标本直接检查

形态学检查（1）直接涂片染色镜检

（2）浓缩集菌涂片检查法

2.核酸检测

形态学检查用荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下菌体呈橘黄色

涂片镜检的报告方式半定量报告石炭酸复红染色：抗酸杆菌（1000×）荧光染色：抗酸杆菌（450×）未找到抗酸菌可疑抗酸杆菌；再送标本检测01～2/300视野01～2/70视野1＋1～9/100视野2～18/50视野2＋1～9/10视野4～36/10视野3＋1～9/视野4～36/视野4＋>9/视野>36/视野用PCR法快速诊断MTB感染PCR法检测DNA特异性更强，敏感性更高PCR须按法规要求规范操作，应防止标本污染出现假性结果核酸检测2.分离培养标本接种于选择性培养基中(常用罗氏，所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长)37℃，5％～10％CO2培养8周结核杆菌出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落涂片染色为抗酸阳性Bactec–TB960快速培养系统三、微生物学检验（四）分离培养与鉴定

3.菌种鉴定

(1)生化反应（2）噬菌体鉴定法（3）分子生物法菌种鉴定

(4)高效液相色谱（HPLC）检测分枝菌酸生化反应--烦琐、费时（4～8周）,影响因素多结核分枝杆菌不发酵糖类能产生触酶人型MTB能合成烟酸，还原硝酸盐，耐受噻吩-2-羧酸酰肼，而牛型MTB则不能人型和牛型的毒株中性红试验均阳性，无毒株则为阴性，并失去索状生长现象高效液相色谱（HPLC）检测分枝菌酸：由于不同种的分枝杆菌细胞壁中的分枝菌酸不同，所以利用HPLC检测分枝菌酸可鉴定菌种。三、微生物学检验（五）免疫学诊断1．结核菌素试验

2．结核分枝杆菌抗原检测3.结核分枝杆菌抗体检测4.全血干扰素测定法结核菌素试验针对旧结核菌素(OT)与结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)两种菌体蛋白原理：当将蛋白注入皮内后，如受试者已感染结核杆菌，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，在局部释放淋巴因子，形成迟发性超敏反应性炎症，若受试者未感染MTB则无反应。结核分枝杆菌抗原检测用ELISA方法在血清中检测结核分枝杆菌抗原-结核菌外分泌特异性抗原(externalsecretedspecificantigen)浓度。任何体液如血液、痰液、脊髓液、尿液和各式组织萃取液等体液可用于检测特异蛋白抗原。结核抗体作为活动性MTB感染的快速诊断方法之一比传统的痰涂片抗酸染色、MTB培养等方法简便、快速、敏感性高，但存在一定的假阳性。近年，胶体金、蛋白芯片检查结核杆菌IgG抗体抗体，特别是后者，针对三种抗原（脂阿拉伯甘露糖、38KDa和16KDa蛋白质抗原），其灵敏度和特异性均有所提高。全血干扰素测定法原理：当全血与PPD和对照抗原（植物血凝素）共同孵育后，致敏的淋巴细胞可分泌IFN-γ，通过检测IFN-γ的含量来鉴定菌种。2004年，Quantiferon-TBGoldassay问世，应用结核分枝杆菌RD1区域编码的早期分泌抗原靶（ESAT）和培养滤液蛋白（CFP-10）特异抗原刺激细胞检测。近来ESAT/CFP-10融合蛋白-ELISPOT用于诊断活动性结核病，准确、灵敏、特异、快速。结果与结核菌素试验相当，干扰因素小。（六）药物敏感性试验将纯培养物菌悬液，接种含各种浓度药物的固体培养基上，同时做不含药物的对照组。经过培养，含有药物的培养基上菌落数目是对照组的75％以上，则认为该菌对该药物浓度为完全耐药，如无菌落生长则为敏感。三、微生物检验第二节非结核分枝杆菌一、概述与分类二、临床意义三、微生物学检验一、概述与分类非结核分枝杆菌（ＮontuberculosisMycobactericum，NTM）

:指结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、坎纳分枝杆菌和田鼠分枝杆菌)和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。

NTM种类众多，现已被鉴定的有150余种,包括专性寄生菌、腐生菌和中间型。国际分枝杆菌分类研究组（IWGMT）分为三类，即缓慢生长菌、快速生长菌和不能培养菌三种类型。Runyon按细菌产色素和生长速度将临床重要分枝杆菌分为RunyonⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ群概述Runyon分类法Ⅰ群———光产色菌,如猿猴分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌;Ⅱ群———暗产色菌,如苏加分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌;Ⅲ群———不产色菌,如鸟分枝杆菌复合群(M1aviumcomplex,MAC)、玛尔摩分枝杆菌、土地分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、嗜血分枝杆菌;Ⅳ群———快生长菌,如偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌。二、临床意义迄今为止已发现NTM有150余种，其中约1/3与人类疾病有关。条件致病菌毒力低于结核分枝杆菌自然界中广泛存在可以在人体某些部位定植结核病和NTM感染的治疗不同

为何要关注NTM？自然界中广泛存在，如水、土壤和气溶胶，可导致免疫力低下的患者感染。近年来，因手术器械、注射器具及医疗用水等灭菌不合格、使用不规范造成患者手术切口、注射部位NTM感染暴发事件。如：广东省某中心卫生院剖宫产患者手术切口感染事件。该事件是由于手术器械灭菌不合格导致的手术切口感染，病原菌为快速生长型分枝杆菌。警钟长鸣——NTM潜在杀手？

卫生部关于严重医院感染事件通报—1.关于深圳市某医院发生严重医院感染事件的通报2.卫生部关于安徽省某立医院恶性医疗损害事件的通报3.关于西安交通大学医学院某医院发生严重医院感染事件的通报4.关于山西省太原某中心医院血液透析感染事件的通报5.关于天津市蓟县某院新生儿医院感染事件的通报6.卫生部关于安徽省某县医院血液透析患者感染丙肝事件的通报7.关于广东省汕头市潮阳区某中心卫生院剖宫产患者手术切口感染事件的通报

———摘自江苏省卫生厅《严重医院感染事件通报与处罚规定选编》（2010年7月）光产色分枝杆菌（RunyonⅠ群）堪萨斯分枝杆菌（M.kansaii）：能引起肺内和肺外类似结核样的病变海分枝杆菌(M.marinum)：存在于淡水或海水。除可引起冷血动物（如鱼）感染外，亦能引起人的感染。通过皮肤微小创口侵入皮肤而引起所谓的“游泳池肉芽肿”。渔业工人可经受损皮肤遭受感染猿分枝杆菌（M.simiae）：首先从猿分离到此菌，形态同结核分枝杆菌，可感染人类暗产色分枝杆菌（RunyonⅡ群）瘰疬分枝杆菌（M.scrofulaceum）：可引起人的淋巴结炎或肺部感染。斯氏分枝杆菌(M.szulgai)：可引起成人肺部的慢性感染。不产色分枝杆菌（RunyonⅢ群）鸟-胞内分枝杆菌复合体(M.avium-intracellularecomplex,MACorMAIC)：鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌有许多相似之处，故合起来称之为MAC。近年来发现HIV感染和AIDS患者易感染MAC。溃疡分枝杆菌（M.ulcerans）：对人可通过创伤局部感染，常在四肢伸侧形成无痛性溃疡，叫做Buruli溃疡，缓慢愈合或出现继发感染。蟾蜍分枝杆菌（M.xenopi）：是蟾蜍肉芽肿的病原菌，对人则多引起老年男性的慢性肺部感染。快速生长分枝杆菌（RunyonⅣ群）⑴偶发分枝杆菌（M.fortuitum）：可引起人的局部感染或肺部感染，对现有的抗结核药物均耐药。⑵龟分枝杆菌（M.chelonei）：该菌在引起免疫力低下患者感染的快速生长非结核分枝杆菌中最常见，外伤引起的软组织病变及手术后继发感染，亦可引起肺部感染。⑶脓肿分枝杆菌（M.abscessus）：以前曾作为龟分枝杆菌脓肿亚种。常存在于自来水中，引起注射后医院感染的暴发。该菌也可散发引起丰胸术后、中心静脉插管、动脉插管以及透析导管所致的菌血症。另外，该菌可导致：近90%由快速生长分枝杆菌引起的肺部感染，外伤后感染以及超过90%鼓膜切开管植入术后耳炎。与龟分枝杆菌相似，该菌引起免疫力缺陷患者播散性皮下感染。脓肿分枝杆菌引起的注射后感染脓肿分枝杆菌引起的注射后感染脓肿分枝杆菌引起的注射后感染难于愈合的伤口潮湿治疗室曾导致肌肉注射感染表现：

1998年4月1日～5月31日共手术292例，4月22日～7月14日发生切口感染166例。潜伏期为20～30天。切口部位开始为小结节，继而化脓成窦道，有线头挟出。清创换药后创面清洁但不愈合，或愈合后又复发，并有淋巴结炎倾向。调查：20份切口分泌物标本培养出龟分枝杆菌（脓肿亚型）。医院环境和无菌物品细菌学检查合格。使用中和未启用的戊二醛半小时不能杀灭金葡菌、1小时不能杀灭龟分枝杆菌，测浓度为0.137%。结论：戊二醛浓度错配导致手术器械分枝杆菌污染，从而引起切口感染。某医院手术切口分枝杆菌感染暴发

（广东深圳，1998）

深圳孕妇感染事件开庭：

46人索赔2000多万元

肌注部位偶发分枝杆菌感染暴发

（福建南平，1998）表现：

1998年8月～11月某诊所59例患者发生肌注部位感染，潜伏期2～80天。起初肌注无明显不适，少数针孔持续疼痛，多数在洗澡或接通知后抚摸发现注射处肿块长期不消。15天约长0.5～1.0cm，后期硬块出现波动感，压痛明显，出现水样脓液。继发腹股沟淋巴结炎4例。脓液或病理标本43份中33份检出偶发分枝杆菌。调查：检查27种药物、一次性注射器和输液器均合格；其他诊所肌注者无发病；诊所卫生条件差，1个水龙头，自来水直接从河中抽取，未消毒；玻璃注射器15枝，煮沸消毒，时间凭经验，每天消毒1次；患者多时使用同种药物者换针头不换注射器。结论：污染注射器是引起感染暴发的主要原因，细菌则可能来自河水。（一）标本采集见结核杆菌部分（二）涂片抗酸染色本菌为抗酸杆菌，但较结核分枝杆菌短而粗，大小约1～8µm×0.3～0.5µm，抗酸染色着色均匀，呈束状或团状排列（三）分离培养与鉴定三、微生物学检验（三）分离培养与鉴定⑴光产色分枝杆菌（RunyonⅠ群）菌落特点是在暗处一般不产生或仅产生少量色素，光照1h后能在48h内转为黄色或橘黄色需在营养复杂的培养基上才能生长，生长缓慢，菌落光滑有时可形成索状生长三、微生物学检验（三）分离培养与鉴定（2）暗产色分枝杆菌（RunyonⅡ群）无论有光或无光均能产生色素，呈黄色或橘黄色生长缓慢，菌落为光滑型三、微生物学检验（三）分离培养与鉴定⑶不产色分枝杆菌（RunyonⅢ群）缺乏β-胡萝卜素，故在光照和暗处均不能产生色素三、微生物学检验（三）分离培养与鉴定⑷快速生长分枝杆菌（RunyonⅣ群）在普通培养基上即可生长最适生长温度为25～45℃生长速度快，3～6d即可形成菌落三、微生物学检验微需氧培养4天三、微生物学检验（四）其他鉴定方法NTM非培养方法的鉴定与结核分枝杆菌类似，可参考结核杆菌部分。NTM的实验室诊断可跟据细菌生长速度、色素等表型特征进行初步鉴定，再进行分子诊断，后者应用越来越广泛。第三节麻风分枝杆菌麻风病的病原菌，麻风是一种慢性传染病，主要表现为皮肤、黏膜和神经末梢的损害。晚期可侵犯深部组织和器官，形成肉芽肿。根据临床表现、免疫病理变化和细菌检查结果等将麻风分为瘤型、结核样型和界限类综合征等三种病型。麻风分枝杆菌（M.leprae）麻风病的病原菌1873年挪威学者ArmauerHansen从麻风患者皮肤结节中发现，又名Hansen杆菌。革兰染色阳性具有抗酸性一、临床意义WHO自1995年始对麻风患者实施免费治疗麻风病发病率直线下降2008年全球新发现麻风患者249000例中国现症麻风病患者由解放初期的50多万人减少至目前的6000余人2001～2008年,我国每年新发现患者1400～1700例二、微生物学检验（一）基本特性本菌为抗酸杆菌，较结核分枝杆菌短而粗，大小约1～8µm×0.3～0.5µm，抗酸染色着色均匀，呈束状或团状排列。麻风分枝杆菌为典型的胞内寄生菌，有麻风分枝杆菌存在的细胞胞浆呈泡沫状，称为麻风细胞。用药后细菌可断裂为颗粒状、链杆状等，着色不均匀，叫做不完整菌。革兰染色阳性，无鞭毛、无荚膜、无芽胞。二、微生物学检验（二）标本采集通常自眶上、颧下、下颌、耳廓及鼻腔黏膜等数处采取标本二、微生物学检验（三）标本直接检查1.显微镜检查用刀刮取组织液做涂片，火焰固定，抗酸染色、镜检，麻风分枝杆菌呈红色，细胞呈蓝色。金胺“O”染色、荧光显微镜检查，可提高阳性率麻风分枝杆菌多呈束状或成团聚集，结核分枝杆菌多散在，偶有聚集。麻风分枝杆菌菌体粗直，两端尖细，而结核分枝杆菌则细长略弯曲，且有分枝现象。在镜下可见大量麻风细胞。2.活组织切片抗酸染色及病理学检查。

二、微生物学检验（四）其他诊断方法该菌目前尚不能人工培养近年采用PCR技术检测麻风菌基因、运用新发现抗原血清学与T细胞试验可以对麻风病进行早期诊断。第四节放线菌属放线菌（Actinomyces）能引起牛和人的疾病1891年，Wolff和Israel应用厌氧培养法，首先将人型放线菌培养成功。因菌落生长呈放射状而得名。一、分类放线菌是引起人放线菌病（Actinomycosis）的病原菌，属于内源性感染。目前发现衣氏放线菌（A.israelii）、内氏放线菌（A.naeslundii）粘放线菌(A.viscous)、龋齿放线菌（A.odontolyticus）及丙酸蛛网菌。（Arachniapropionica）5种可引起人的放线菌病，其中衣氏放线菌最多见。牛型放线菌（A.bovis）是本属的典型菌种，主要引起牛的放线菌病。放线菌目（Actinomycetales）放线菌属（Actinomyces）诺卡菌属（Nocardia）分枝杆菌属（Mycobacterium）分类（1）含分枝菌酸诺卡菌属分枝杆菌属棒状杆菌属（2）不含分枝菌酸放线菌属二、临床意义放线菌：正常菌群所致疾病：1.内源性感染(放线菌病)：软组织肉芽肿性炎症(慢性,无痛,多发性瘘管,排出硫磺样颗粒。)2.龋齿和牙周炎（一）基本特性G+、非抗酸性丝状菌培养困难，厌氧或微需氧硫磺样颗粒（菌落）压片或组织切片，显微镜下可见颗粒呈菊花状。三、微生物学检验硫磺样颗粒(sulfurgranule)（二）分离培养培养：厌氧或微需氧气体环境：5％CO2营养培养基：脑心浸液琼脂平板温度与时间：37℃，24～48h菌落:灰白色蜘蛛状、不规则结节状或臼齿状菌落,

初分离(粗糙)生化特性:溶血(-)

葡萄糖(+)

甘露醇(+)

吲哚(-)

触酶试验(-)【黏液放线菌除外】三、微生物学检验放线菌菌落特点第五节诺卡菌属1.需氧菌2.含分枝菌酸3.分布土壤中，多数不致病菌4.致病菌星形诺卡菌（N.asteroides）巴西诺卡菌（N.brasiliensis）一、概述诺卡菌属（Nocardia）革兰染色不定，一般认为该菌为革兰阳性杆菌有细长的分枝菌丝，生长于表面并伸入琼脂培养基中生长的某个时期有弱抗酸性形态与放线菌相似，但菌丝末端不膨大二、分类该属包括至少包括22个菌种医学上常见的有13个种：脓肿诺卡菌、非洲诺卡菌、星形卡菌、巴西诺卡菌、短链诺卡菌复合群、肉色诺卡菌、鼻疽诺卡菌、新星诺卡菌、豚鼠耳炎诺卡菌、少食诺卡菌、假巴西诺卡菌、南非诺卡菌、老兵诺卡菌。三、临床意义广泛分布于土壤，多为腐物寄生性的非病原菌。诺卡菌感染在人类罕见，可发生在一些其他慢性进行性疾病或免疫缺陷疾病。星形诺卡菌主要通过呼吸道引起人的原发性、化脓性肺部感染，可出现类似肺结核的症状。巴西诺卡菌可因侵入皮下组织，引起慢性化脓性肉芽肿，表现为肿胀、脓肿及多发性瘘管，好发于腿部，称为足分枝菌病。致病性侵入途