新版蛋白质化学专业知识讲座

蛋白质是由许多不一样α-氨基酸按一定序列经过酰胺键（肽键）缩合而成，含有较稳定构象并含有一定生物功效大分子。新版蛋白质化学专业知识讲座第1页一、蛋白质生物学意义1.生物体组成成份2.酶3.运输4.运动5.抗体6.干扰素7.遗传信息控制8.细胞膜通透性9.高等动物记忆、识别机构新版蛋白质化学专业知识讲座第2页二、蛋白质元素组成C（50~55%）、H（6~8%）、O（20~23%）、N（15~18%）、S（0~4%）、…N含量平均为16%——凯氏（Kjadehl）定氮法理论基础新版蛋白质化学专业知识讲座第3页三、蛋白质氨基酸组成氨基酸是蛋白质基本组成单位。从细菌到人类，全部蛋白质都由20种标准氨基酸（20standardaminoacids)组成。（一）氨基酸结构通式：19种氨基酸含有一级氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）结合到α碳原子（Cα），同时结合到（Cα）上是H原子和各种侧链（R）；Pro含有二级氨基（α-亚氨基酸）新版蛋白质化学专业知识讲座第4页不带电形式

H2N—Cα—HCOOHR+H3N—Cα—HCOO-R两性离子形式Cα如是不对称C（除Gly），则：含有两种立体异构体[D-型和L-型]2.含有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]新版蛋白质化学专业知识讲座第5页（二）氨基酸分类依据R化学结构（1）脂肪族氨基酸：1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys；2）极性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr（3）杂环氨基酸：Trp、His（4）杂环亚氨基酸：Pro依据R极性（1）极性氨基酸：1）不带电：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；2）带正电：His、Lys、Arg；3）带负电：Asp、Glu（2）非极性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp新版蛋白质化学专业知识讲座第6页（三）氨基酸主要理化性质普通物理性质无色晶体，熔点极高（200℃以上），不一样味道；水中溶解度差异较大（极性和非极性），不溶于有机溶剂。两性解离和等电点氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在，在同一个氨基酸分子上带有能放出质子—NH3+正离子和能接收质子—COO-负离子，为两性电解质。3.化学性质（1）与茚三酮反应：Pro产生黄色物质，其它为蓝紫色。在570nm（蓝紫色）或440nm（黄色）定量测定（几μg）。新版蛋白质化学专业知识讲座第7页调整氨基酸溶液pH，使氨基酸分子上—+NH3基和—COO-基解离程度完全相等时，即所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液pH值称为该氨基酸等电点（pI）。H3N—CH—COOHR+在酸性溶液中氨基酸（pH＜pI）H3N—CH—COO-R+在晶体状态或水溶液中氨基酸（pH=pI）H2N—CH—COO-R在碱性溶液中氨基酸（pH＞pI）（当氨基酸相互连接成蛋白质时，只有其侧链基团和末端α-氨基，α-羧基是能够离子化。新版蛋白质化学专业知识讲座第8页氨基酸等电点确实定：1）酸碱滴定（滴定曲线）2）依据pK值（该基团在此pH二分之一解离）计算：等电点等于两性离子两侧pK值算术平均数。pI=————pK1+pK22or（pI=————）pK2+pK32新版蛋白质化学专业知识讲座第9页（2）与甲醛反应：氨基酸甲醛滴定法R—CH—COO-NH3+R—CH—COO-NH2+H+OH-中和滴定HCHOR—CH—COO-NHCH2OHHCHOR—CH—COO-N(CH2OH)2新版蛋白质化学专业知识讲座第10页（3）与2,4-二硝基氟苯(DNFB)反应NO2FO2N+HN—CH—COOHRNO2O2NHN—CH—COOHR+HF弱碱性DNP-氨基酸新版蛋白质化学专业知识讲座第11页H2N—CH—COOH+RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOHRDNS-氨基酸取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高新版蛋白质化学专业知识讲座第12页（4）与异硫氰酸苯酯（PITC）反应—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HF重复测定多肽链N端氨基酸排列次序，设计出“多肽次序自动分析仪”新版蛋白质化学专业知识讲座第13页（5）与荧光胺反应：依据荧光强度测定氨基酸含量（ng级）。激发波长λx=390nm，发射波长λm=475nm。（6）与5,5′-双硫基-双（2-硝基苯甲酸）反应：新版蛋白质化学专业知识讲座第14页H2N—CHCH2SSHNO2HOOCSNO2COOHCOOH+SSNO2NO2HOOCCOOHH2N—CH—COOH+CH2SHpH8.0硫代硝基苯甲酸测定Cys含量（pH8.0λ412nm摩尔消光系数ε=13600）新版蛋白质化学专业知识讲座第15页四、肽——一个氨基酸α-羧基和另一个氨基酸α-氨基脱水缩合而成化合物。氨基酸之间脱水后形成键称肽键（酰胺键）。当两个氨基酸经过肽键相互连接形成二肽，在一端依然有游离氨基和另一端有游离羧基，每一端连接更多氨基酸。氨基酸能以肽键相互连接形成长、不带支链寡肽（25个氨基酸残基以下）和多肽（多于25个氨基酸残基）。多肽依然有游离α-氨基和α-羧基。肽链写法：游离α-氨基在左，游离α-羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。H2N-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-COOHSer-Leu-Phe（S-L-F）新版蛋白质化学专业知识讲座第16页（一）谷光甘肽（GSH）H2N-CHCH2CH2CO—COOHγ-GluNHCHCO—CH2SHCysNHCH2COOHGly2GSHGSSG（二）催产素和升压素均为9肽，第3位和第9位氨基酸不一样。催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，含有催产和促使乳腺排乳作用。升压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，降低排尿。新版蛋白质化学专业知识讲座第17页（三）促肾上腺皮质激素（ACTH）39肽，活性部位为第4~10位7肽片段：Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。（四）脑肽脑啡肽含有强烈镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。Met-脑啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-脑啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leuβ-内啡肽（31肽）含有较强吗啡样活性与镇痛作用。新版蛋白质化学专业知识讲座第18页（五）胆囊收缩素（六）胰高血糖素由胰岛α-细胞分泌（β-细胞分泌胰岛素），29肽。胰高血糖素调整维持血糖浓度。新版蛋白质化学专业知识讲座第19页五、蛋白质结构蛋白质是氨基酸以肽键相互连接线性序列。在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊形状（构象）（conformation）。在结构中，这种构象是原子三维排列，由氨基酸序列决定。蛋白质有四种结构层次：一级结构（primary），二级结构（secondary），三级结构（tertiary）和四级结构（quaternary）（不总是有）。（一）蛋白质一级结构（化学结构）一级结构就是蛋白质分子中氨基酸残基排列次序，即氨基酸线性序列。在基因编码蛋白质中，这种序列是由mRNA中核苷酸序列决定。一级结构中包含共价键（covalentbonds）主要指肽键（peptidebond）和二硫键（disulfidebond）新版蛋白质化学专业知识讲座第20页HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-GlyGlu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOHB链15710151920212530HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH15102015A链711621SSSS牛胰岛素化学结构—S————S——新版蛋白质化学专业知识讲座第21页一级结构确定标准：将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重合位点，排出肽前后位置，最终确定蛋白质完整序列。当前往往采取从待测蛋白质基因序列反推出蛋白质一级结构。（二）蛋白质空间结构（构象、高级结构）——蛋白质分子中全部原子在三维空间排列分布和肽链走向。新版蛋白质化学专业知识讲座第22页因为羰基碳-氧双键靠拢，允许存在共振结构（resonancestructure），碳与氮之间肽键有部分双键性质，由CO-NH组成肽单元展现相正确刚性和平面化，肽键中4个原子和它相邻两个α-碳原子多处于同一个平面上。Cα—C—N—CαOH—CN—O-H+CαCα氨基H与羰基O几乎总是呈反式（trans）而不是顺式（cis）。蛋白质构象稳定原因：1）酰胺平面；2）R影响。新版蛋白质化学专业知识讲座第23页1.蛋白质二级结构——指蛋白质多肽链本身折叠和盘绕方式（1）α-螺旋（α-helix）Pauling和Corey于1965年提出。结构关键点：1）螺旋每圈有3.6个氨基酸，螺旋间距离为0.54nm，每个残基沿轴旋转100°。2）每个肽键羰基氧与远在第四个氨基酸氨基上氢形成氢键（hydrogenbond），氢键走向平行于螺旋轴，全部肽键都能参加链内氢键形成。—C—(NH—C—CO)3N—OHHR3.613(ns)新版蛋白质化学专业知识讲座第24页3)R侧链基团伸向螺旋外侧。RRRRRRRRR螺旋横截面4）ProN上缺乏H，不能形成氢键，经常出现在α-螺旋端头，它改变多肽链方向并终止螺旋。新版蛋白质化学专业知识讲座第25页（2）β-折叠结构（β-pleatedsheet）是一个肽链相当伸展结构。肽链按层排列，依靠相邻肽链上羰基和氨基形成氢键维持结构稳定性。肽键平面性使多肽折叠成片，氨基酸侧链伸展在折叠片上面和下面。CαCαCαCαCαCαRRRRRRNNCNNCCC平行反平行β-折叠片中，相邻多肽链平行或反平行（较稳定）。新版蛋白质化学专业知识讲座第26页（3）β-转角（β-turn）为了紧紧折叠成紧密球蛋白，多肽链经常反转方向，成发夹形状。一个氨基酸羰基氧以氢键结合到相距第四个氨基酸氨基氢上。N—1CH—CC2CHN—HO=C3CHNC—4CH—NRRHOHRROHOβ-转角经常出现在连接反平行β-折叠片端头。新版蛋白质化学专业知识讲座第27页（4）自由回转没有一定规律涣散肽链结构。酶活性部位。2.超二级结构和结构域超二级结构是指若干相邻二级结构中构象单元彼此相互作用，形成有规则，在空间上能识别二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次一个过渡态构象层次。结构域是球状蛋白质折叠单位。多肽链在超二级结构基础上深入绕波折叠成紧密近似球行结构，含有部分生物功效。对于较大蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构。新版蛋白质化学专业知识讲座第28页3.蛋白质三级结构——指多肽链上全部原子（包含主链和侧链）在三维空间分布。肌红蛋白4.蛋白质四级结构——多肽亚基（subunit）空间排布和相互作用。亚基间以非共价键连接。血红蛋白新版蛋白质化学专业知识讲座第29页共价键次级键化学键肽键一级结构氢键二硫键二、三、四级结构疏水键盐键范德华力三、四级结构（三）蛋白质分子中共价键与次级键新版蛋白质化学专业知识讲座第30页肌红蛋白是1957年由JohnKendrew用X射线晶体分析法测定有三维结构第一个蛋白质。它是经典球形蛋白质，高度折叠成紧密结构，疏水氨基酸残基大部分埋藏在分子内部，极性残基在表面。肌红蛋白中有8条α-螺旋。由多肽折叠形成疏水空隙内是血红素辅基，经过肽链上His残基与肌红蛋白分子内部相连，它对肌红蛋白生物活性是必需（与O2结合）。新版蛋白质化学专业知识讲座第31页六、蛋白质分子结构与功效关系蛋白质分子含有多样生物学功效，需要一定化学结构，还需要一定空间构象。（一）蛋白质一级结构与功效关系1.种属差异蛋白质一级结构种属差异十分显著，但相同部分氨基酸对蛋白质功效起决定作用。依据蛋白质结构上差异，能够断定它们在亲缘关系上远近。2.分子病——蛋白质分子一级结构氨基酸排列次序与正常有所不一样遗传病。新版蛋白质化学专业知识讲座第32页镰状细胞贫血（sick-cellanemia）从患者红细胞中判定出特异镰刀型或月牙型细胞。β-链1234567Hb-AVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys…Hb-SVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys…Val取代Glu含氧-HbAO2O2粘性疏水斑点含氧HbS脱氧HbS疏水位点血红蛋白分子凝集新版蛋白质化学专业知识讲座第33页（二）蛋白质构象与功效关系别（变）构作用：含亚基蛋白质因为一个亚基构象改变而引发其余亚基和整个分子构象、性质和功效发生改变作用。因别构而产生效应称别构效应。血红蛋白是别构蛋白，O2结合到一个亚基上以后，影响与其它亚基相互作用。肌红蛋白血红蛋白在肺部O2压力在毛细血管中O2压力饱和度00.5120406080100120O2压力新版蛋白质化学专业知识讲座第34页24681012140.51.01.52.0OH-加入当量pHpK1pIpK2（3）（2）（1）Gly滴定曲线OH-OH-+H3N—C—COOHHH（1）+H3N—C—COO-HH（2）H2N—C—COO-HH（3）Gly解离作用新版蛋白质化学专业知识讲座第35页七、蛋白质性质（一）蛋白质相对分子量蛋白质相对分子量在10000~1000000之间。测定分子量主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。最准确可靠方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25~50*104g离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数（s）：单位（cm）离心场里沉降速度。

s=————vω2xv=沉降速度（dx/dt）ω=离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中心距离（cm）沉降系数单位惯用S，1S=1×10-13（s）新版蛋白质化学专业知识讲座第36页蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）关系M=——————RTsD（1－Vρ）R——气体常数（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——绝对温度D——扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）V——蛋白质微分比容（m3·g-1）ρ——溶剂密度（20℃，g·ml-1）s——沉降系数新版蛋白质化学专业知识讲座第37页（二）蛋白质两性电离及等电点蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。电泳：带电颗粒在电场中移动现象。分子大小不一样蛋白质所带净电荷密度不一样，迁移率即异，在电泳时能够分开。1.自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液支持物上进行电泳，不一样组分形成带状区域。（1）纸上电泳：用滤纸作支持物。新版蛋白质化学专业知识讲座第38页（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圆盘电泳：玻璃管中进行凝胶电泳。+—2）平板电泳：铺有凝胶玻板上进行电泳。-+新版蛋白质化学专业知识讲座第39页等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。++－－－－+－－－－－5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度通电++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－新版蛋白质化学专业知识讲座第40页（三）蛋白质胶体性质布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，含有吸附能力蛋白质溶液稳定原因：1）表面形成水膜（水化层）；2）带相同电荷。++++++新版蛋白质化学专业知识讲座第41页（四）蛋白质沉淀反应1.加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。分段盐析：调整盐浓度，可使混合蛋白质溶液中几个蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。2.加有机溶剂3.加重金属盐4.加生物碱试剂单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。新版蛋白质化学专业知识讲座第42页（五）蛋白质变性天然蛋白质受物理或化学原因影响，其共价键不变，但分子内部原有高度规律性空间排列发生改变，致使其原有性质发生部分或全部丧失，称为蛋白质变性。变性蛋白质主要标志是生物学功效丧失。溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，分子形状改变，肽链涣散，反应基团增加，易被酶消化。变性蛋白质分子相互凝集为固体现象称凝固。有些蛋白质变性作用是可逆，其变性如不超出一定程度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。新版蛋白质化学专业知识讲座第43页反应名称试剂颜色反应相关基团有此反应蛋白质或氨基酸双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键全部蛋白质米伦反应HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物红色

Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色

Trp坂口反应(Sakaguchi反应)α-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基α