微生物学病毒讲义专家讲座

一、病毒特点和定义第一节概述1、特点1）不含有细胞结构，含有普通化学大分子特征。2）一个病毒毒粒内只含有一个核酸，DNA或者RNA。3）大部分病毒没有酶或酶系极不完全，不含催化能量代谢酶，不能进行独立代谢作用。4）严格活细胞内寄生，没有本身核糖体，没有个体生长，也不进行二均分裂，必须依赖宿主细胞进行本身核酸复制，形成子代。5）个体微小，在电子显微镜下才能看见。6）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。比如一些简单病毒仅由核酸和蛋白质外壳（coat）组成，故可把它们视为核蛋白分子。朊病毒甚至仅由蛋白质组成比如利福平可抑制痘病毒复制病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，经过其复制与表示产生子代病毒基因组和新蛋白质，然后由这些新合成病毒组分装配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。病毒这种特殊繁殖方式称做复制（replication）。微生物学病毒讲义专家讲座第1页第一节概述1、特点一、病毒特点和定义病毒是一类既含有化学大分子属性，又含有生物体基本特征；既含有细胞外感染性颗粒形式，又含有细胞内繁殖性基因形式独特生物类群。超显微、没有细胞结构、专性活细胞内寄生实体微生物学病毒讲义专家讲座第2页第一节概述1、特点一、病毒特点和定义单细胞微生物与病毒性质比较aDNA病毒和RNA病毒中一部分;b利福平可抑制痘病毒复制微生物学病毒讲义专家讲座第3页第一节概述2、定义一、病毒特点和定义迄今仍无一个科学而严谨定义病毒为含有独立于其宿主进化史绝对细胞内寄生物，它DNA或RNA基因组被其所编码蛋白质壳体化（encapsidation）。

（Fields等，1990年）非细胞生物（真）病毒：最少含核酸和蛋白质二种组分亚病毒(subvirus)类病毒（viroid)：只含具侵染性RNA组分拟病毒（virusoid)：只含有不具侵染性RNA组分朊病毒（prion)：只含蛋白质微生物学病毒讲义专家讲座第4页二病毒宿主范围第一节概述病毒几乎能够感染全部细胞生物，并含有宿主特异性噬菌体（phage）、植物病毒（plantviruses）动物病毒（animalviruses）微生物学病毒讲义专家讲座第5页三、病毒培养和纯化第一节概述同微生物学其它学科分支一样，病毒学进步完全得益于研究方法和技术伎俩发展。经过病毒分离与纯化取得纯化、有感染性病毒制备物是病毒学研究和实践基本技术。1、病毒培养病毒培养：二元培养物法微生物学病毒讲义专家讲座第6页四、病毒培养和纯化1、病毒培养噬菌体细菌培养物培养液营养琼脂平板细菌培养液变清亮细菌平板成为残迹平板若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，即噬斑（plague）。微生物学病毒讲义专家讲座第7页Microbiology双层平板法优点：①填补玻璃皿底面不平缺点②所形成全部噬菌体斑都靠近处于同一平面上③形成噬菌斑较大，更有利于计数微生物学病毒讲义专家讲座第8页Microbiology噬菌斑微生物学病毒讲义专家讲座第9页四、病毒培养和纯化1、病毒培养动物病毒试验动物鸡胚各种细胞培养微生物学病毒讲义专家讲座第10页四、病毒培养和纯化1、病毒培养植物病毒敏感植物叶片产生坏死斑，或称枯斑微生物学病毒讲义专家讲座第11页

蛋白质提纯方法（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）四、病毒培养和纯化2、病毒纯化标准纯化病毒制备物应保持其感染性病毒是有感染性生物体病毒含有化学大分子属性纯化病毒制备物理化性质应含有均一性方法主要化学组成为蛋白质含有一定大小、形状和密度差速离心梯度离心（超速离心）微生物学病毒讲义专家讲座第12页第二节毒粒性质病毒是一类既含有化学大分子属性，又含有生物体基本特征；既含有细胞外感染性颗粒形式，又含有细胞内繁殖性基因形式独特生物类群。毒粒（病毒颗粒）：

病毒细胞外颗粒形式，也是病毒感染性形式。一团能够自主复制遗传物质保护遗传物质免遭环境破坏，并作为将遗传物质从一个宿主细胞传递给另一个宿主细胞载体。蛋白质外壳包膜微生物学病毒讲义专家讲座第13页第二节毒粒性质一、毒粒形态结构1、病毒大小和形状个体小，必需在电镜下观察；不一样病毒毒粒大小差异很大；毒粒形状:动物病毒有球状、卵圆状、砖形植物病毒有杆状、丝状、球状噬菌体有蝌蚪状和丝状微生物学病毒讲义专家讲座第14页采取各种电镜技术观察毒粒形态结构Orfvirus：口疮病毒(接触性脓疱皮炎病毒)（负染技术）Ebolavirus：埃博拉病毒（正染技术）Vacciniavirus痘苗病毒（投影技术）微生物学病毒讲义专家讲座第15页第二节毒粒性质毒粒化学组成毒粒（化学组成）核酸；蛋白质；脂类；碳水化合物；基本化学组成病毒颗粒在化学上表现为核蛋白微生物学病毒讲义专家讲座第16页二、毒粒化学组成1、病毒核酸核酸是病毒遗传物质；一个病毒毒粒只含有一个核酸：DNA或是RNA；病毒核酸单链DNA（ssDNA，single-strandedDNA）；双链DNA（dsDNA）；单链RNA（ssRNA）；双链RNA（dsRNA）；微生物学病毒讲义专家讲座第17页二、毒粒化学组成2、病毒蛋白质病毒蛋白质结构蛋白非结构蛋白病毒基因组编码，在病毒复制过程中产生并含有一定功能，但并不结合于毒粒中蛋白质。组成一个形态成熟有感染性病毒颗粒所必需蛋白质壳体蛋白；包膜蛋白；存在于毒粒中酶；微生物学病毒讲义专家讲座第18页二、毒粒化学组成2、病毒蛋白质病毒结构蛋白主要生理功效：1）组成蛋白质外壳，保护病毒核酸免受核酸酶及其它理化因子破坏；2）决定病毒感染特异性，与易感细胞表面存在受体具特异性亲和力，促使病毒粒子吸附和入侵；3）决定病毒抗原性，能刺激机体产生对应抗体；4）组成毒粒酶，或参加病毒对宿主细胞入侵（如T4噬菌体溶菌酶等），或参加病毒复制过程中所需要病毒大分子合成（如逆转录酶等）；普通来说，病毒是不具酶或酶系极不完全，所以一旦离开宿主就不能独立进行代谢和繁殖。微生物学病毒讲义专家讲座第19页第二节病毒性质2、病毒壳体结构壳体或衣壳（capsid）：包围着病毒核酸蛋白质外壳，由蛋白质亚基按对称形式、有规律地排列而成，是病毒毒粒基本结构。壳体结构类型螺旋对称壳体二十面体对称壳体双对称结构微生物学病毒讲义专家讲座第20页螺旋对称壳体：亚基有规律地沿着中心轴（核酸）呈螺旋排列，进而形成高度有序、对称稳定结构。微生物学病毒讲义专家讲座第21页二十面体对称壳体：组成对称结构壳体第二种方式是蛋白质亚基围绕具立方对称正多面体角或边排列，进而形成一个封闭蛋白质鞘。微生物学病毒讲义专家讲座第22页含有双对称结构经典例子是有尾噬菌体（tailedphage）,其壳体由头部和尾部组成。包装有病毒核酸头部通常呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。微生物学病毒讲义专家讲座第23页一、病毒形态结构3、病毒包膜结构病毒包膜基本结构与生物膜相同，是脂双层膜。在包膜形成时，细胞膜蛋白被病毒包糖蛋白取代。刺突（spike）：包膜或核衣壳上突起。微生物学病毒讲义专家讲座第24页第二节病毒性质一、病毒形态结构3、病毒包膜结构病毒蛋白质壳体和病毒核酸（关键）组成复合物，又称核衣壳。核壳（nucleocapsid）：仅由核衣壳组成病毒颗粒裸露毒粒（nakedvirion）：如烟草花叶病毒、脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）等一些简单病毒毒粒。包膜（envelope）：有些病毒核衣壳包裹着一层脂蛋白膜，它是病毒以出芽（budding）方式成熟时，由细胞膜衍生而来。有维系毒粒结构，保护病毒核壳作用。尤其是病毒包膜糖蛋白，含有各种生物学活性，是开启病毒感染所必需。有包膜病毒微生物学病毒讲义专家讲座第25页第二节病毒性质一、病毒形态结构4、病毒结构类型四种主要结构类型裸露二十面体；裸露螺旋；有包膜二十面体；有包膜螺旋；有些病毒，如有尾噬菌体、痘病毒等结构更为复杂，不能包含在这些结构类型之内。不一样病毒毒粒结构复杂程度有很大区分微生物学病毒讲义专家讲座第26页第三节病毒复制病毒特点：严格细胞内寄生物，只能在活细胞内繁殖。毒粒宿主细胞有繁殖性病毒基因组含有感染性毒粒消失病毒基因组复制、表示病毒核酸和蛋白质装配形成含有感染性毒粒释放至细胞外原料；能量；生物合成场所；微生物学病毒讲义专家讲座第27页第三节病毒复制病毒复制：病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，经过其复制与表示产生子代病毒基因组和新蛋白质，然后由这些新合成病毒组分装配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。病毒这种特殊繁殖方式称做复制（replication）。微生物学病毒讲义专家讲座第28页第三节病毒复制一、病毒复制周期1、一步生长曲线（onestepgrowthcurve）1939年，MaxDelbruck&EmoryEllis：E.coli/bacteriopage1、用噬菌体稀释液感染高浓度宿主细胞；2、数分钟后，加入抗噬菌体抗血清（中和未吸附噬菌体）；3、将上述混合物大量稀释，终止抗血清作用和预防新释放噬菌体感染其它细胞；4、保温培养并定时检测培养物中噬菌体效价（对噬菌体含量进行计数）；5、以感染时间为横坐标，病毒感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性繁殖曲线；该试验标志着分子病毒学、分子生物学和分子遗传学建立MaxDelbruck所以荣获1969年NobelPrize微生物学病毒讲义专家讲座第29页一、病毒复制周期1、一步生长曲线（onestepgrowthcurve）噬菌体复制（繁殖）三个阶段：1、吸附期；游离噬菌体吸附到宿主细胞2、潜伏期；从噬菌体吸附到细胞到释放出新噬菌体最短时期3、裂解期；伴随菌体不停破裂，新噬菌体数目增加，直到最高值微生物学病毒讲义专家讲座第30页一、病毒复制周期1、一步生长曲线（onestepgrowthcurve）取培养物直接测定病毒数量将培养物过滤去细胞后测定病毒数量将细胞裂解后测定病毒数量。前期可将培养物先离心去上清以消除未吸附病毒影响裂解量：每个受染细胞所产生子代病毒颗粒平均数目。其值等于潜伏期受染细胞数目除以稳定时受染细胞所释放全部子代病毒数目，即等于稳定时病毒效价与潜伏期病毒效价之比。微生物学病毒讲义专家讲座第31页一、病毒复制周期2、隐蔽期（eclipseperiod）在潜伏期前一段，受染细胞内检测不到感染性病毒，后一阶段，感染性病毒在受染细胞内数量急剧增加。自病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新感染性病毒时间为为隐蔽期。隐蔽期病毒在细胞内存在动力学曲线呈线性函数，而非指数关系，从而证实子代病毒颗粒是由新合成病毒基因组与蛋白质经装配成熟，而不是经过双分裂方式产生。不一样病毒隐蔽期长短不一样，比如，DNA动物病毒隐蔽期为5～20小时，RNA动物病毒为2～10小时。微生物学病毒讲义专家讲座第32页一、病毒复制周期1、一步生长曲线（onestepgrowthcurve）一步生长曲线是研究病毒复制一个经典试验，最初是为研究噬菌体复制而建立，以后推广到动物病毒和植物病毒复制研究中。以适量病毒接种于标准培养高浓度敏感细胞，待病毒吸附后，离心除去未吸附病毒，或以抗病毒抗血清处理病毒—细胞培养物以建立同时感染，然后继续培养并定时取样测定培养物中病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性繁殖曲线，即一步生长曲线。不一样病毒潜伏期长短不一样，噬菌体以分钟计，动物病毒和植物病毒以小时或天计。潜伏期：噬菌体裂解量普通为几十到上百个，植物病毒和动物病毒可达数百乃至上万个。裂解量：微生物学病毒讲义专家讲座第33页一、病毒复制周期3、病毒复制周期复制周期（replicativecircle）或称复制循环：自病毒吸附于细胞开始，到子代病毒从感染细胞释放到细胞外病毒复制过程。①吸附；

②侵入；

③脱壳；

④病毒大分子合成，包含病毒基因组表示与复制；⑤装配与释放；微生物学病毒讲义专家讲座第34页第三节病毒复制二、病毒感染起始1、吸附：毒粒敏感细胞随机碰撞而接触（静电引力或氢键）可逆吸附，无特异性（非细胞颗粒也可吸附）病毒表面蛋白与细胞受体结合特异性，不可逆吸附，开启病毒感染第一阶段微生物学病毒讲义专家讲座第35页二、病毒感染起始1、吸附：病毒吸附蛋白与细胞受体间结协力起源于空间结构互补性，相互间电荷、氢键、疏水性相互作用及范得华力。不一样种系细胞含有不一样病毒细胞受体，病毒受体细胞种系特异性决定了病毒宿主范围。微生物学病毒讲义专家讲座第36页二、病毒感染起始2、侵入：侵入又称病毒内化，它是一个病毒吸附后几乎马上发生，依赖于能量感染步骤。不一样病毒-宿主系统病毒侵入机制不一样微生物学病毒讲义专家讲座第37页二、病毒感染起始2、侵入：有尾噬菌体：注射方式将噬菌体核酸注入细胞经过尾部刺突固着于细胞；尾部酶水解细胞壁肽聚糖，是细胞壁产生小孔；尾鞘收缩，核酸经过中空尾管压入胞内，蛋白质外壳留在胞外；吸附尾钉固着尾鞘收缩尾管穿入DNA注入假如大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多小孔，也可引发细胞马上裂解，但并未进行噬菌体增殖，这种现象称为自外裂解（lysisfromwithout）。微生物学病毒讲义专家讲座第38页二、病毒感染起始2、侵入：植物病毒：经过因人为地或自然机械损伤所形成微伤口进入细胞；或者靠携带有病毒媒介，主要靠是有吮吸式口器昆虫取食将病毒带入细胞。植物病毒一旦进入细胞后，增殖产生子代病毒或病毒核酸可经过病毒编码运动蛋白（movementprotein）与胞间连丝相互作用从受染细胞进入邻近细胞。微生物学病毒讲义专家讲座第39页二、病毒感染起始3、脱壳：脱壳是病毒侵入后，病毒包膜和/或壳体除去而释放出病毒核酸过程。脱壳是病毒基因组进行功效表示所必需感染事件。T-偶数噬菌体脱壳与侵入是一起发生动物病毒存在不一样结构类型和不一样侵入方式，其脱壳过程也较复杂。微生物学病毒讲义专家讲座第40页第三节病毒复制三、病毒大分子合成病毒基因组进入胞内宿主细胞代谢发生改变病毒利用宿主生物合成机构和场所，使病毒核酸表示和复制，产生大量病毒蛋白质和核酸。微生物学病毒讲义专家讲座第41页四、病毒装配与释放第三节病毒复制新合成毒粒结构组分组装成完整病毒颗粒，称做病毒装配，亦称成熟（maturation）或形态发生（morphogenesis）。成熟子代病毒颗粒然后依一定路径释放到细胞外病毒释放标志病毒复制周期结束微生物学病毒讲义专家讲座第42页吸附侵入早期：病毒特异性酶合成病毒核酸复制病毒结构蛋白质合成装配释放病毒大分子合成微生物学病毒讲义专家讲座第43页噬菌体与宿主关系1、烈性噬菌体：凡能引发宿主细胞快速裂解噬菌体。2、温和性噬菌体：噬菌体侵染宿主后，并不增殖，裂解，而与宿主DNA结合，随宿主DNA复制而复制，此时细胞中找不到形态上可见噬菌体，这种噬菌体称为温和性噬菌体。含有温和性噬菌体细菌称为溶源性细菌lysogenicbacteria微生物学病毒讲义专家讲座第44页第四节病毒非增殖性感染温和噬菌体溶源性反应：烈性噬菌体（virulentphage）：感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，形成裂解循环（lyticcycle）。温和噬菌体或称溶源性噬菌体（lysogenicphage）：感染宿主细胞后不能完成复制循环，噬菌体基因组长久存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生。这一现象称做溶源性（lysogeny）现象在大多数情况下，温和噬菌体基因组都整合于宿主染色体中（如λ噬菌体），亦有少数是以质粒形成存在（如P1噬菌体）。微生物学病毒讲义专家讲座第45页温和性噬菌体存在状态1）游离具感染性virion；2）前噬菌体（prophage）：附着或整合在宿主染色体上，一道复制；3）营养期噬菌体：指导合成。微生物学病毒讲义专家讲座第46页温和噬菌体溶源性反应：整合于细菌染色体或以质粒形成存在温和噬菌体基因组称做原噬菌体（prophage）在原噬菌体阶段，噬菌体复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细菌染色体同时复制，并随细胞分裂而传递给子代细胞。细胞中含有以原噬菌体状态存在温和噬菌体基因组细菌称做溶源性细菌（lysogenicbacteria）溶源性细菌经自发裂解或诱发裂解，进入裂解循环微生物学病毒讲义专家讲座第47页5节：病毒对理化原因抵抗力1、物理原因主要是温度、光、干燥。可低温保留，但不耐热，60度，30分钟。X射线、γ射线、紫外线可灭活。无包膜病毒在相对湿度（RH）较高时存活很好，而有包膜病毒在低RH时存活最好。2、化学原因：体内灭活物质是抗体和干扰素体外普通消毒剂可灭活，对氯耐受力比肠道菌强，对酸性不敏感，对高pH敏感。可用脂溶剂（醚、十二烷基硫酸钠、氯仿、去氧胆酸钠等）判别有没有包膜。微生物学病毒讲义专家讲座第48页3、病毒在环境中存活：在海水和淡水中，温度是影响病毒存活主要原因，与病毒类型也相关；土壤中受温度和湿度影响最大，干燥易使病毒灭活；空气中病毒附着在尘埃上，存活时间受各种原因影响。污水处理中一级处理是物理过程，去除病毒效果很差，最多30%。二级处理是生物处理，病毒去除率90-99%。三级处理可深入去除病毒。微生物学病毒讲义专家讲座第49页亚病毒1、类病毒viroid：没有衣壳包裹RNA分子。2、拟病毒virusoids(类类病毒）：一类包含在植物病毒粒子中类病毒，RNA。3、朊病毒prion,virino：一类能侵染动物并在宿主细胞内复制小分子无免疫性疏水性蛋白。微生物学病毒讲义专家讲座第50页Microbiology类病毒(viroid)当前所知道最小、只含RNA一个成份、专性细胞内寄生分子生物。只在植物体中发觉。马铃薯纺锤形块茎病是1922年在美国发觉，它可使马铃薯减产20～70％——马铃薯纺锤形块茎病类病毒：它是一条长50nm棒状dsRNA分子微生物学病毒讲义专家讲座第51页Microbiology拟病毒（virusoids）又称类类病毒（viroid-like），可认为是一类包裹在植物病毒粒子中有缺点类病毒普通仅由裸露RNA或DNA组成“寄生”于真病毒内——辅助病毒（helpervirus）其复制必须依赖辅助病毒微生物学病毒讲义专家讲座第52页Microbiology朊病毒（prion，virino）朊病毒有哪些特点

首先，它没有核酸，能使正常蛋白质由良性转为恶性，由没有感染性转化为感染性；其次，它没有病毒形态，是