原位杂交操作流程

原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1）二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3）95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4）PBS清洗3分钟；5）2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6）PBS清洗10分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml,37C孵育15分钟；8）PBS清洗2次，每次3分钟；9）0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次3分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗2次，每次5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17）PBS清洗3分钟；18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37C孵育30分钟；19）PBS清洗5分钟；20）室温，2XSSC清洗10分钟；21）37C，1XSSC清洗10分钟；22）37C，0.5XSSC清洗10分钟；23）缓冲液A孵育10分钟；24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim），37C孵育3小时；26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30）固红，脱水以及封片进行核的复染。2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1）二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3）95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4）PBS清洗5分钟；5）2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6）PBS清洗5分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8）PBS清洗2次，每次5分钟；9）0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次5分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。FISH步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100%酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。2、蛋白酶处理：1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2xSSC40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。2）37C水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37C孵育20min。3）xSSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。4）梯度酒精脱水（-20C预冷）。3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78C水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78C孵育8min；4）即移入-20C预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20C预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10M探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37C孵育12h〜16h。杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43C预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2xSSC（37C）洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1xPBS内待检测，勿使切片干燥。检测：9）从IxPBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。10）每张切片使用30gl^60gl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；11）去掉塑料盖膜，把切片放入含IxPBS的染色缸。IxPBS室温下洗3次，每次2min。扩增：12）从IxPBS中取出切片，斜置切片使液体排出；13）每张切片滴30gl-60gl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1xPBS的染色缸。1xPBS室温下洗3次，每次2min；15）从1xPBS中取出切片，斜置切片使液体排出；16）每张切片滴30gl-60gl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；17）1xPBS室温下洗3次，每次2min。5、细胞核染色：1）张切片加10gl-20glDAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2〜5ml；2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20°C冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。地高辛标记寡核昔酸探针组织处理（1）冷冻切片：厚10〜20rm，贴于事先经清洁处理及涂有粘附剂的切片上。切片保存于-80C，在应用于杂交实验前，使迅速回升到室温，干燥，固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4。PBS漂洗5minX3,孵育在2XSSe10min。（2）石蜡包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蜡，以100%乙醇10minX2,空气干燥10min，从高到低梯度乙醇（95%，80%，70%）1min/每个浓度°PBs5minX3，孵育在2XSSe10min。（3）离心细胞涂片：将细胞先以4%多聚甲醛固定，应用离心沉淀法，将沉淀物涂于有粘附剂的载片上，应用PBS（含5mmol/lMgCl2）5minX3漂洗。在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%（V/V）乙酸酐10min。在0.2mol/lTris-HCl含（0.1mol/L甘氨酸）pH7.410min。孵育在2XSSe10min。探针准备35pmol的寡核昔酸（oligo-）探针，3’终末标记以地高辛-11-dUTP。预杂交和杂交加约300ul预杂交液（配制法见附录）在每张载片上，室温孵育1h。如为鲱鱼精子DNA，在应用前须在沸水浴中加热10min，而对酵母tRNA可不用加热变性。（1）应用预杂交液稀释地高辛标记的Oligo-探针，探针理想工作浓度根据于待测核昔酸含量和实践的结果。如对于检测大鼠垂体的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC）mRNA的Oligo-探针，其理想工作浓度为342ng/ml（0.342ng/ul）o（2）预杂交后以2XSSC漂洗，以吸水纸拭干切片周围水份，加30ul杂交液在切片上，加硅化盖玻片，在37C过夜。如探针大于36碱基则杂交温度为42C。次日室温2XSSC液漂洗切片1h，1XSSC漂洗切片1h（室温），0.5XSSc37C洗半小时，0.5XSSC室温漂洗半小时。地高辛显示。地高辛标记eRNA探针组织前处理在组织制片中以冷冻切片（厚10〜30rm）最佳。切片贴在预先清洁，高温处理并涂以粘附剂载玻片上，先在37C预干燥4h，然后置于37C烤箱中过夜。经过上述处理的切片如在-20C可保存2〜3周，在-70°C可保存数月之久，有报告可保存数年之久的。但仍以新鲜制片为好。如为石蜡包埋切片，应脱蜡经梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在细胞内mRNA含量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。经水洗后入37C烤箱4h或过夜，然后进行杂交前处理。在烘烤及低温保存时，为防尘埃及空气中RNA酶的污染，宜用锡箔纸(foilpaper)包被，内加少许干燥剂(变色硅胶)。下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。PBS洗2X3min。选择少数几张切片作为“RNA酶对照片”。其它切片暂放于PBs内。RNA酶对照片处理方法：加RNA酶(100Pg/ml)在预热37C的溶液内。放在潮湿的盛有少许2XSSC塑料盒或蒸发皿内。在每张切片上覆以过量的RNA酶溶液，在37C孵育30min后用2XSSC冲洗，2X3min，然后与其它保存在PBS的切片一起进行下列处理。蛋白酶K消化：将组织切片放在0.1mol/lTris/50mmo/LEDTApH8.0，内含蛋白酶K1ug/ml，孵育15〜20min。消化时间应根据组织的种类，厚度反复试验调整。时间过短探针不易进入，过长影响细胞或组织的形态结构。0.1mol/L甘氨酸/PBs5min终止蛋白激酶K反应。0.25%乙酸酐(0.1mol/l三乙醇胺配制)10min。在4%多聚甲醛/PBS3min。以PBs漂洗2X3min。浸入新鲜配制的0.25%乙酸酐(0.1mol/L三乙醇胺配制)10min，以封闭非特异性结合部位。2XSSC漂洗15min。杂交以含cRNA探针(0.5ng/ml)的杂交液，按每张切片10〜2pl的量覆盖切片。地高辛配基标记的cRNA核酸探针保存浓度为2.5ng/ml，用前稀释备用。覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量2XSSC温盒内在42C，16〜18h或过夜。显示用缓冲液1冲洗杂交后的载片2X3min。在缓冲液1中10min，室温以封闭非特异性结合部位。拭干切片周围的载片，注意保持切片湿润。加数滴抗地高辛抗血清(工作浓度1：500，以缓冲液1稀释)，孵育2h，室温。缓冲液1漂洗3X3min。浸入缓冲液210min室温。浸入底物中孵育10〜30min(或更长时间，视需要而定)，底物内含显色BCIP/NBT，室温。最好用锡箔纸包裹反应盒，使显色在黑暗中进行。定期取出切片在显微镜下检测反应强度。根据反应强度决定延长或终止反应。反应颜色为紫蓝色。将切片浸入缓冲液3以终止反应。复染，可用1%伊红、1%苏木精、1%亮绿或5%的焦宁(又称派咯宁Y)(pyronin丫)10〜30s。流水洗5〜10min，直至水无色为止。在切片未干前，以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可以用DPX在盖片四周封固。为去除水份，在封固前可进行梯度酒精脱水，透明，DPX封固，但每步时间仅需几秒钟，时间过长易致褪色。原位杂交实验步骤1质粒的转化和扩增1.1制备XL1-Blue感受态细菌取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37°C、100rpm培养4h,离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200u/tube)，-80C保存。转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/u1的质粒DNA4u1加入到8Ou1感受态菌中。轻轻摇匀，冰浴30min。4.42C热激90秒，然后迅速冰浴2min。加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37C，100转/min水浴孵育60min。取200ul菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1ul/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37C培养12-16h。1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37C，200转/分培养2h，取1ml之一Eppendorf离心管，加50ul10mmol/LEDTA(pH8.0)。加入50ul新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。在70C温育5min，然后冷却到室温。力口1.5u14mol/LKCl和0.5u1含0.4%漠酚兰染液，振荡30秒后，冰浴5min。12000g，4C离以3min，以除去细菌碎片。制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5ug/ml)，取50ul上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V，进行电泳。当漠酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。1.3质粒的扩增和纯化用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30mlLB-氨苄青霉素(50ug/ml)培养液的聚丙烯管中，于37C，200转/分培养3h。将菌液转入含70mlLB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37C，200转/分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170u/ml)。37C，200转/分培养12-16h。将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm，4C离,th,15min，沉淀细菌。弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5min加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10min。加入预冷的溶液III3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10min，出现白色絮状沉淀。6000rpm，4C离心15min，保留上清。将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10min。(或-20C4h，或4C过夜，可便核酸沉淀)10.12000rpm，4C离心15min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残兼上清液流尽。于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。用500ulTE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5mlEppendorf管中。加入用冰预冷的5mol/L的LiCl溶液600ul,充分混匀。12000rpm,4°C离心15min,以沉淀高分子量的RNA。将上清转移到另一1.5mlEppendorf管中，加等量异丙醇，充分混匀，于室温静置10min。15.12000rpm,4C离心15min,回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。16.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。17.400ul含无DNA酶的RNA酶(20Pg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到另一1.5mlEppendorf管中，室温放置1.5mlEppendorf管中30min。加入400ul13%(v/v)的PEG8000-NaCl(1.6mol/L)，混匀，4C12000rpm离心5min以回收质粒DNA，弃去上清。加入400ulTE缓冲液(pH8.O)溶解沉淀，再分别用等体积的Tris饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。将水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中，加入O.1体积(约50U13M的醋酸钠(pH5.2)和2倍体积(大约1ml)的无水乙醇，充分混匀后于4C放置30min。于4C12000rpm离心5min回收沉淀的质粒DNA。尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。加入400Pl处于4C的70%乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，4C12000rpm离心2min。吸去上清，室温敞开管口，直到乙醇完全挥发。用100p1TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀。取4p1溶液1：100稀释后，测定其OD260、OD280，以确定质粒DNA的纯度和浓度(OD260/D280>1.8。OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。；DNA浓度=OD260X0.05X稀释倍数(pg/pl)。质粒DNA溶液于-20C保存待用。二、cRNA探针的标记将质粒DNA，用相应的限制性内切酶线性化，通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化，作为cRNA探针标记的模板，用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探针。进行体外转录，步骤如下：在冰上将各试剂加入一1.5ml无RNA酶的Eppendorf管中。DEPC处理的三蒸水8P1质粒DNA模板0.05pg/pl1P110xNTP地高辛标记混合物1x2pl0.1MDTT溶液10mM2pl5x转录缓冲液1x4plRNAse抑制剂2U/P11plRNA聚合酶2U/pl2pl反应体系总体积20pl加入上述各试剂后，混匀，简短离心后在37C孵育2h。加入2pl无RNA酶的DNA酶I(10U/p1)，37C孵育15min降解模板DNA。加入0.2MEDTA(pH8.0)溶液2pl终止反应。加入2.5Pl的4MLicl和7.5P1冷的无水乙醇，混匀，-20C放置2h。12000g下离以15min，弃上清，小心地用50Pl冷的70%乙醇洗涤沉淀。室温下稍干燥，溶于100P1DEPC处理过的三蒸水中，混匀分装，-20°C下保持备用。三、原位杂交3.1冰冻切片与杂交前预处理将子宫样品从-80C取出，用OCT包埋，在-23C（切片机腔体温度）平衡至少30min。将包埋好的样品固定在样品头上，切10Pm厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸（1mg/m1）的玻片上（玻片预先经180C干烤6小时），保存于-70C冰柜备用。冰冻切片经室温干燥10min后，在4%的多聚甲醛-PBS（pH7.4）固定lOmin。活跃的DEPC-PBS（未高压的0.1%DEPC-1XPBS溶液）洗2次，每次5min。在0.2M的盐酸作用中作用10min后，重复步骤4）。在切片上滴加蛋白酶K（0.1Pg/m1），37C孵育15min，重复