转基因动物用微生物安全性评价

转基因动物用微生物安全性评价第一页，共74页。第二页，共74页。个体小繁殖快数量大易变异分布广泛生命力强容易扩散第三页，共74页。（1）动、植物用转基因微生物的发展概况；（2）动物用转基因微生物的安全性评价（受体微生物的安全性评价、转基因操作的安全性评价、动物用转基因微生物的安全性评价、动物用转基因微生物产品的安全性评价）；（3）植物用转基因微生物的安全性评价（受体微生物的安全性评价、转基因操作的安全性评价、植物用转基因微生物的安全性评价、植物用转基因微生物产品的安全性评价）；（4）动、植物用转基因微生物的安全管理（国外、国内）。第四页，共74页。动物用转基因微生物主要包括动物用转基因活疫苗和动物用转基因活微生物饲料添加剂；植物用转基因微生物是指通过重组DNA技术研制的，直接应用于植物上具有杀虫、防病、固氮、调节生长等作用的微生物。第五页，共74页。转基因动物用微生物的研究与开发起步于20世纪80年代初口蹄疫病毒是最早研究的对象国际上发达国家对基因工程疫苗的研究与开发十分重视已相继研制成功一些用于动物疫病免疫预防用的基因工程亚单位疫苗、基因工程重组活载体疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗等第六页，共74页。酶制剂以基因工程研制能高效表达植酸酶的重组毕氏酵母。抗菌肽减少或完全替代抗生素药物。重组生长激素第七页，共74页。利用体外表达系统（如大肠杆菌，酵母，动物细胞，杆状病毒-昆虫细胞等）表达病毒的主要保护性抗原蛋白作为亚单位疫苗不仅具有优良的安全性，而且便于规模化生产利用非疫苗用蛋白作为抗原建立的诊断方法将可以区分亚单位疫苗免疫的动物和自然感染的动物第八页，共74页。大多数禽、猪、牛等动物的病原体免疫原性蛋白（保护性抗原）FMDVVP1、狂犬病病毒的囊膜蛋白G，AIVHA蛋白，伪狂犬病病毒的囊膜糖蛋白gP50，新城疫病毒F和HN蛋白,传染性法氏囊病毒VP2蛋白，传染性胃肠炎病毒的纤突蛋白，鸡传染性贫血病病毒的衣壳蛋白（VP1）……….第九页，共74页。痘病毒、疱疹病毒、腺病毒或细菌作为载体具有常规弱毒疫苗的所有优点便于构建多价疫苗利用非疫苗用基因或其表达产物可以建立鉴别诊断方法

第十页，共74页。痘苗病毒数十种病原的基因在痘苗病毒中进行了表达，都显示出不同程度的免疫保护性。比较成功的有表达狂犬病病毒G蛋白的重组痘苗病毒和表达牛瘟病毒F和HA蛋白的重组痘苗病毒疫苗

禽痘病毒（鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、鸽痘病毒）第十一页，共74页。新城疫病毒F和HN蛋白禽流感病毒的HA和NP蛋白马立克氏病毒gB糖蛋白禽白血病囊膜蛋白传染性法氏囊病病毒VP2蛋白禽网状内皮增生症病毒囊膜蛋白火鸡出血性肠炎病毒Hexon蛋白第十二页，共74页。目前已有许多外源基因被插入腺病毒并得到表达SIV水疱性口炎病毒狂犬病病毒牛副粘病毒3型牛疱疹病毒I型牛冠状病毒猪传染性胃肠炎病毒第十三页，共74页。火鸡疱疹病毒、伪狂犬病病毒、牛疱疹病毒I型和鸡传染性喉气管炎病毒已完成动物试验并显示出良好前景的重组疱疹病毒疫苗：口蹄疫病毒VP1基因，猪瘟病毒E2基因，猪繁殖与呼吸综合症病毒GP5基因，猪流感病毒HA基因的重组伪狂犬病毒疫苗表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组马立克氏病毒疫苗表达禽流感病毒HA基因的重组传染性喉气管炎病毒疫苗第十四页，共74页。大肠杆菌沙门氏菌李氏杆菌目前国际上基因工程疫苗研究与开发的热点之一第十五页，共74页。一类发展前景很好的基因工程疫苗伪狂犬病基因缺失疫苗(双基因和三基因缺失疫苗，如TK-/gG-、TK-/gE-、TK-/gC-和TK-/gE-/gI-等，并已商品化生产牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）TK基因缺失疫苗第十六页，共74页。DNA疫苗可诱导机体同时产生体液免疫和细胞免疫已发现DNA接种对许多病毒、细菌、寄生虫感染以及肿瘤的预防均有一定的效果第十七页，共74页。可食性疫苗(利用转基因植物)多表位疫苗T细胞疫苗RNA复制子疫苗第十八页，共74页。含狂犬病毒gB基因的重组牛痘病毒疫苗，已在北美和欧洲广泛应用于预防野生动物的狂犬病TK和gE双基因缺失的伪狂犬病疫苗已在美国和大部分欧盟国家广泛应用于预防猪伪狂犬病和猪伪狂犬病根除计划TK和gE双基因缺失的牛传染性鼻气管炎病毒疫苗也在许多国家使用，荷兰于1998年5月在全国范围内推广使用TK和gE双基因缺失的疫苗以便根除此病表达禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒疫苗和表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒疫苗也已获得美国农业部注册，开始产业化生产第十九页，共74页。我国动物用基因工程疫苗的研究与发达国家之间没有实质性差距，而且取得了巨大进展十五期间，国家863计划在动物用基因工程疫苗与诊断试剂的研究与开发方面的投入有所加强近几年，我国动物用基因工程疫苗研究呈现出加速发展的态势，已有多种基因工程疫苗已经问世，并进入安全性评价的不同阶段第二十页，共74页。禽流感病毒鸡新城疫病毒禽传染性喉气管炎病毒鸡传染性法氏囊病病毒鸡马立克氏病病毒猪伪狂犬病病毒猪瘟病毒口蹄疫病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌大肠杆菌猪囊虫第二十一页，共74页。第一个商品化的疫苗——仔猪腹泻大肠杆菌K88/K99二价基因工程疫苗第二十二页，共74页。禽流感重组灭活疫苗禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗传染性喉气管炎重组鸡痘病毒活载体疫苗伪狂犬病基因缺失疫苗“O”型口蹄疫病毒基因工程疫苗

以新城疫病毒为载体的重组禽流感疫苗第二十三页，共74页。猪生长抑素基因工程疫苗马立克氏病基因工程活载体疫苗猪囊虫核酸疫苗幼畜腹泻双价基因工程苗新城疫重组鸡痘病毒基因工程疫苗动物去势疫苗第二十四页，共74页。各类动物疫病的基因工程亚单位疫苗以禽痘病毒、伪狂犬病病毒、腺病毒为载体的基因工程重组活载体疫苗细菌的基因缺失疫苗DNA疫苗第二十五页，共74页。转植酸酶酵母已通过农业部转基因生物安全评价，并已产业化生产和应用近年来以转基因植物为表达系统的可食性疫苗也已成为我国的研究热点第二十六页，共74页。如何提高基因工程疫苗免疫效力，达到或超过常规传统疫苗的免疫保护效果，以期在我国动物疫病的预防和控制中发挥作用，也是目前和今后我国科学家所面临的重要任务第二十七页，共74页。杀虫转基因微生物转基因病毒杀虫剂、转基因Bt制剂、防病转基因微生物。转基因微生物肥料遗传改良的联合固氮菌和根瘤菌。第二十八页，共74页。安全评价原则

安全评价内容及其技术指标要求

第二十九页，共74页。1、是以促进基因工程技术发展和应用，同时保障人类健康和生态环境的平衡为基本原则2、采取个案分析，实事求是的原则3、从受体微生物的安全性、基因操作的安全性和转基因动物用微生物遗传工程体及其产品的安全性等三个方面内容和对动物、人类与环境的安全性三个角度进行评价（1）从动物安全的角度，着重评价转基因动物用微生物遗传工程体及其产品对靶动物和非靶动物的安全性（2）从人类健康角度，着重评价对人类、畜禽以及形成的食物链（食品）的影响（3）从生态环境角度，着重评价转基因动物用微生物遗传工程体及其产品对自然生态环境和畜牧业生态环境的影响第三十页，共74页。4、涉及到危害人类、动物健康和生态环境平衡的转基因微生物遗传工程体及其产品，应对其安全性进行严格评价5、从事转基因动物用微生物研究的机构或个人应逐级申报。国外公司在我国申请注册的转基因动物用微生物遗传工程体及其产品，应按阶段进行安全性评价6、农业部农业基因安全审评委员会仅负责对转基因微生物遗传工程体及其产品的安全性进行评价，因此通过安全性评价（指获得生物安全证书）的转基因微生物遗传工程体及其产品，需申报兽用新生物制品进行审批，获得兽用新生物制品证书后方能进行商品化生产和应用第三十一页，共74页。安全性评价的总体内容安全性评价的阶段及其要求试验方案

主要动物用转基因微生物及其产品的安全性评价的相关技术资料

第三十二页，共74页。受体微生物的安全性评价与安全等级的确定（1）所用受体微生物(包括细菌、病毒)可接触到的环境（2）受体微生物的生物学背景与特性学名和分类地位，分布、繁殖方式在环境中的定殖、存活和传播能力与途径及影响因素致病性和产生毒素及毒性物质的能力，在国内外的应用情况（3）受体微生物对人类、动物和其它微生物的影响和潜在的危险程度，受体微生物受人类和动物其它病原体的侵染情况（4）受体微生物对生态环境的影响和潜在的危险程度（5）受体微生物的质粒状况，发生遗传变异的可能性及其潜在危险程度（6）对受体微生物的监测方法和监控技术受体微生物的安全性等级按《农业转基因生物安全评价管理办法》（第二章）确定第三十三页，共74页。基因操作的安全性评价内容与等级确定

（1）目的基因的来源、结构、免疫学与生物学功能和用途

（2）基因操作所用载体的名称、来源、特性与结构、安全性，载体所带的抗性标记基因及其特性（3）重组DNA分子的结构、构建方法、复制特性和安全性（4）转基因方法（5）目的基因在受体微生物及宿主体内的表达及其遗传稳定性基因操作的安全性等级按《农业转基因生物安全评价管理办法》（第二章）确定第三十四页，共74页。转基因动物用微生物遗传工程体及其产品的安全性评价内容

（1）转基因动物用微生物遗传工程体的分子学与生物学特性（2）在自然界的存活能力（3）遗传物质转移到其他生物体的能力和可能后果（4）与其它病原微生物重组的能力和可能产生的后果（5）遗传工程体的应用目的和范围（6）对遗传工程体应有适当的监测方法和监控手段第三十五页，共74页。在靶动物和非靶动物体内的生存前景对靶动物和可能的非靶动物高剂量接种后的影响与传统的产品相比较，其相对的安全性宿主范围与载体的漂移度免疫动物与靶动物以及非靶动物接触时的排毒和传播能力遗传工程体回复传代时的毒力返强能力对妊娠动物的安全性对免疫动物子代的安全性第三十六页，共74页。人类接触和感染的可能性及其危险性广泛应用后对人类的潜在危险性第三十七页，共74页。遗传工程体在环境中释放的范围影响遗传工程体在外界环境中的存活、增殖和传播的理化因素感染靶动物和非靶动物的可能性或潜在的危险性第三十八页，共74页。中间试验环境释放生产性试验安全证书申请第三十九页，共74页。项目名称应包括目的基因名称、动物用转基因微生物及产品名称、试验所在省（市、自治区）名称和试验阶段名称四个部分，如表达鸡新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒基因工程疫苗在江苏省的中间试验一份申请书中菌株不超过20个，且是由同一种受体微生物、相同的目的基因、相同的基因操作所获得的，而且每个转基因菌株都应有明确的名称或编号第四十页，共74页。试验地点不超过3个省（市、区），每省不超过2个点试验动物总规模（上限）大动物（马、牛）20头中小动物（猪、羊等）40头禽类（鸡、鸭等）200羽鱼2000尾试验地点应明确试验所在的省（市、自治区）、县（市）、乡、村试验年限一般为1~2年第四十一页，共74页。目的基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列目的基因与载体构建的图谱试验地点的位置图和试验隔离图试验设计（包括进行安全性评价的主要指标和研究方法等，如转基因微生物的稳定性、竞争性、生存适应能力、外源基因在靶动物体内的表达和消长关系等）第四十二页，共74页。项目名称应包括目的基因名称、动物用转基因微生物及产品名称、试验所在省（市、自治区）名称和试验阶段名称四个部分，如表达鸡新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒基因工程疫苗NF16和YF9在江苏省的环境释放一份申报书中菌株不超过5个，且是由同一种受体微生物、相同的目的基因、相同的基因操作所获得的，每个菌株都应有明确的名称或编号，并与中间试验阶段的相对应第四十三页，共74页。试验地点不超过3个省（市、区），每省不超过3个点试验动物总规模（上限）大动物（马、牛）100头中小动物（猪、羊等）500头禽类（鸡、鸭等）5000羽鱼10000尾试验地点应明确试验所在的省（市、自治区）、县（市）、乡、村一次申请环境释放的期限一般为1~2年第四十四页，共74页。目的基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列目的基因与载体构建的图谱中间试验阶段的安全性评价试验总结报告毒理学试验报告（如果必要的话）试验地点的位置图和试验隔离图试验设计（包括进行安全性评价的主要指标和研究方法等，如转基因微生物的稳定性、竞争性、生存适应能力、外源基因在靶动物体内的表达和消长关系等）第四十五页，共74页。项目名称应包括目的基因名称、动物用转基因微生物及产品名称、试验所在省（市、自治区）名称和试验阶段名称四个部分，如表达鸡新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒基因工程疫苗NF16在江苏省的生产性试验一份申报书只能申请1种动物用转基因微生物，且名称应与前期试验阶段的名称和编号相对应第四十六页，共74页。试验地点应在批准过环境释放的省（市、自治区）进行，但不能超过2个省（市、区），每省不超过3个点试验动物总规模（上限）大动物（马、牛）1000头中小动物（猪、羊等）10000头（只）禽类（鸡、鸭等）20000羽鱼100000尾试验地点应明确试验所在的省（市、自治区）、县（市）、乡、村一次申请生产性试验的期限一般为1~2年第四十七页，共74页。目的基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列目的基因与载体构建的图谱环境释放阶段审批书的复印件中间试验和环境释放安全性评价试验的总结报告食品安全性检测报告（如果必要的话）目的基因或动物用转基因微生物向环境中的转移情况报告试验地点的位置图和试验隔离图试验设计（包括进行安全性评价的主要指标和研究方法等，如转基因微生物的稳定性、竞争性、生存适应能力、外源基因在靶动物体内的表达和消长关系等）第四十八页，共74页。安全证书的申请项目应包括目的基因名称、转基因微生物名称，如表达鸡新城疫病毒F基因的重且鸡痘病毒基因工程疫苗NF16的安全证书一份申报书只能申请1种动物用转基因微生物，其名称应当与前期试验阶段的名称或编号相对应一次申请安全证书的使用期限一般不超过5年第四十九页，共74页。目的基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列目的基因与载体构建的图谱目的基因的分子检测或鉴定技术方案重组DNA分子的结构、构建方法；各试验阶段审批书的复印件各试验阶段安全性评价试验的总结报告目的基因或转基因微生物向环境中转移情况的报告稳定性、生存竞争性、适应能力等的综合评价报告对非靶生物影响的报告食品安全性检测报告（如果必要的话）该类动物用转基因微生物在国内外生产应用的概况其它相关资料第五十页，共74页。试验方案应明确：试验所在地区及畜禽场的名称及其周围的环境资料试验所在区域的生态类型与动物种类试验所在区域的动物疫病流行情况试验所在区域生态环境对遗传工程体存活、繁殖、扩散和传播的有利或不利因素，特别是环境中其它生物从遗传工程体获得目的基因的可能性第五十一页，共74页。有明确的试验起止时间确定试验动物、动物数量和试验区域大小参加试验的人员情况相应的隔离和环境监控措施第五十二页，共74页。提出用于监测试验区域和周围环境中遗传工程体的适当的方法和程序，监测方法应当敏感性高和特异性强详细记录监测结果，提出遗传工程体及其产品的稳定的生产工艺，包装规格和贮存条件，明确遗传工程体及其产品的接种剂量和途径，使用产品总量，剩余产品的处理方法，提出试验动物的饲养和试验后的处理方法，应提出试验所在区域的消毒措施，提出试验实施过程中出现意外事故的应急措施，明确试验结束后的监控措施和年限第五十三页，共74页。基因工程亚单位疫苗和基因工程灭活疫苗重点评价受体微生物、基因操作、重组微生物的安全性，其产品本身的安全性不存在问题利用重组微生物、基因缺失微生物制备的基因工程灭活疫苗应重点评价受体微生物、基因操作和转基因微生物的安全性，基因重组和基因缺失对受体微生物的致病性及其表型可能造成的影响、转基因微生物的安全性（亚单位疫苗或灭活疫苗可通过中间试验后，直接申报安全证书）第五十四页，共74页。基因工程重组活载体疫苗应重点评价受体微生物、基因操作和重组微生物及其产品的安全性评价试验内容：重组微生物的稳定性、重组微生物中外源基因的稳定性、外源基因在免疫动物体内的表达和消长情况、重组微生物对免疫动物的安全性及对环境的安全性等（利用已知的载体研制的基因工程重组活载体疫或者可跨越环境释放或生产性试验，而申请安全证书）

第五十五页，共74页。基因缺失活疫苗应重点评价祖代微生物、基因操作和缺失微生物及其的安全性安全性评价试验内容：缺失微生物的稳定性、缺失微生物的致病性和对免疫动物的安全性、缺失微生物与野生型微生物重组的可能性、基因缺失微生物排毒和传播能力及其对环境的安全性第五十六页，共74页。DNA疫苗应评价质粒DNA的安全性重组质粒DNA在免疫动物体内的存留时间与对宿主染色体或基因的影响与宿主染色体整合的潜在可能性DNA疫苗免疫接种时的局部反应性和全身性毒性DNA疫苗潜在的致肿瘤性第五十七页，共74页。国外对涉及基因操作制备的转基因动物用微生物及其产品（基因工程疫苗）的安全性也十分重视美国和欧洲一些国家虽然没有设立专门的评价机构和管理机构，但在评价这类产品的安全性方面，增设了与转基因安全相关的评价内容和规定，在进行疫苗评审时一同进行审查第五十八页，共74页。我国十分重视农业转基因生物的安全管理，将转基因动物用微生物（疫苗等）的安全管理纳入国家农业转基因生物安全管理范畴，颁布了相关管理法规和条例，在国家农业转基因安全评价委员会设立了动物用转基因微生物安全评价小组，对转基因动物用微生物的安全性进行评价，同时与我国农业部新生物制品的评审相衔接第五十九页，共74页。

以基因工程活载体疫苗——（表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒基因工程疫苗）为例第六十页，共74页。受体微生物的安全性评价基因操作的安全性评价动物用转基因微生物的安全性评价动物用转基因微生物产品的安全性评价

参照《农业转基因生物安全评价管理办法》附录“动物用转基因微生物安全性评价”,逐条进行评价和表述，并提出安全性评价的依据

第六十一页，共74页。鸡痘病毒S-FPV-017疫苗株，广泛应用，有长期应用的安全记录对人类健康或生态环境没有危害

第六十二页，共74页。所涉及的载体、启动子、目的基因已在国内外实验室广泛使用，均具有科学试验数据和良好的长期安全应用记录，所构建的转移载体不带危险性的标记基因