生物技术制药展示PPT课件 杨然-何倩柠-蒙太鑫-棘白菌素Ｂ脱酰基酶工程菌

棘白菌素Ｂ脱酰基酶工程菌的构建及酶学性质研究HereologousexpressionandenzymaticpropertiesofechinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor小组成员：杨然、何倩柠、蒙太鑫日期：2017-06-08Contents目录ResearchBackground研究背景1EchinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor工程菌的构建2Enzymaticproperties酶学性质3References&QA参考文献4研究背景ResearchBackground1免疫低下患者人数增多真菌发病率升高深部真菌感染发病率和病死率显著增多棘白菌素类抗真菌药物非竞争性抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性作用机制独特毒副作用低对一些唑类和两性霉素Ｂ耐药的真菌具有很强的抗菌活性临床治疗系统性真菌感染的“王牌抗生素”研究背景ResearchBackground研究背景ResearchBackground棘白菌素Ｂ（ECB）构巢曲霉次级代谢产物阿尼芬净ECB脱酰基酶ECB母核犹他游动放线菌及链霉菌属表达产量低，活性不高改进过程研究背景ResearchBackground改进过程改进过程结论：天蓝色链霉菌(S.coelicolorA3)具有遗传稳定性高，胞外分泌能力强，能够正确表达高GC％的基因片段等优点，是理想的链霉菌表达宿主S.lividansTK24S.lividans1236犹他游动放线菌ECB脱酰基酶基因4.1倍250倍FR901379脱酰基酶基因不同表达系统中酶的表达量及活性均存在显著差异放线菌①②③研究背景ResearchBackground犹他游动放线菌DNA克隆ECB脱酰基酶基因天蓝色链霉菌工程菌分析酶学性质ECB脱酰基酶高效表达产业化生产工程菌的构建EchinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor2一、重组质粒pSET152-ecbD的构建二、重组S.coelicolorA3/pSET152-ecbD的构建三、重组S.coelicolorA3/pSET152-ecbD的复选四、重组ECB脱酰基酶在S.coelicolorA3中表达五、ECB脱酰基酶酶活检测棘白菌素Ｂ脱酰基酶工程菌的构建EchinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor一、重组质粒pSET152-ecbD的构建正向引物为5’-AAAACTAGATCTTGTTGGTCGAGAGGAAAGATC-3’反向引物为5’-AAACCGCGGTGGCAGGTCCATGGGC-3’棘白菌素Ｂ脱酰基酶工程菌的构建EchinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor犹他游动放线菌ZJB-0801基因组引物各200ngPrimix50ng25μLPCR扩增正向反向一、重组质粒pSET152-ecbD的构建棘白菌素Ｂ脱酰基酶工程菌的构建EchinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor大肠杆菌JM109表达质粒pSET152-ecbD

序列正确T4DNA连接酶转化二、重组S.coelicolorA3/pSET152-ecbD的构建棘白菌素Ｂ脱酰基酶工程菌的构建EchinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor表达质粒pSET152-ecbD

导入E.coliET12567/pUZ8002S.coelicolorA3孢子2×YT打散悬浮50℃水浴热激处理10min置于37℃的摇床预萌发3h直至长出芽管稀释涂布，28℃培养抗生素覆盖，培养7~10d菌落面积稳定三、重组S.coelicolorA3/pSET152-ecbD的复选棘白菌素Ｂ脱酰基酶工程菌的构建EchinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor30℃培养7~10d转移带抗性的MS平板定时观察并记录生长直径单菌落转化子筛选接种含抗生素液体TSBY培养基培养48h收集菌丝体提取DNApSET152-ecbD质粒为阳性对照S.coelicolorA3总DNA为银性对照PCR扩增验证一、重组质粒pSET152-ecbD的构建二、重组S.coelicolorA3/pSET152-ecbD的构建三、重组S.coelicolorA3/pSET152-ecbD的复选四、重组ECB脱酰基酶在S.coelicolorA3中表达五、ECB脱酰基酶酶活检测棘白菌素Ｂ脱酰基酶工程菌的构建EchinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor酶学性质Enzymaticproperties3酶学性质Enzymaticproperties不同宿主菌对酶活性的影响最适温度在酶促反应中，温度对催化剂的活性和稳定性都会产生影响，同时温度还会对反应的平衡产生影响。研究发现，不同宿主菌表达的ECB脱酰基酶的最适温度不同。最适pH在酶促反应中，相缓冲液的pH值不仅改变了反应中底物和带有电荷的酶的离子状态，还会对酶的催化活性产生影响。研究发现，不同宿主菌表达的ECB脱酰基酶的最适pH不同。总结Conclusion从A.utahensisZJB-0801中克隆到ECB脱酰基酶基因以pSET152作为表达质粒构建重组天蓝色链霉菌基因工程菌能够高效表达ECB脱酰基酶酶活330mU/mL目前已报道ECB脱酰基酶活性的较高水平参考文献References&QA4References&QA参考文献[1]ZOUShuping,LIAOSixing,NIUKun,ZHENGYuguo,SHENYinchu.HereologousexpressionandenzymaticpropertiesofechinocandinsBdeacylaseinStreptomycescoelicolor[J].JournalofZhejiangUniversityofTechnology,2016,(01):99-103.

[2]SHAOLei,LIJian,LIU

Aijuan,etal.EfficientBioconversionofEchinocandinBtoItsNucleusbyOverexpressionofDeacylasegenes