内毒素实验凝胶法专家讲座

内容基本概念试验方法操作注意事项内毒素实验凝胶法专家讲座第1页细菌内毒素细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁产物,它主要化学成份是脂多糖。细菌在生活状态下不会释放出来，只有当细菌死亡后才会表现出毒性。内毒素实验凝胶法专家讲座第2页一、概念及相关知识热原反应：病人在静脉给药15分钟后发生冷感、寒战、发烧、头痛、恶心、呕吐、昏迷、休克等症状。热原：任何能够造成肌体发烧物质。机理：外源性热原质经过内源性热原质起作用。外源性热原质吞噬性白细胞内源性热原质体温调整中心发热新蛋白合成新mRNA翻译内毒素实验凝胶法专家讲座第3页1942年，美国药典首次收载热原检验法，中国药典自第一版（1953年版）起收载。全部注射用药品（肌肉注射、静脉注射）都要经过热原检验。热原检验法不足：1、重现性差。2、对药品引发增加、抑制作用无法控制。3、不一样细菌产生热原质致热域有差异。4、非定量反应。即使不排除有其它热原物质存在，但细菌内毒素是最主要热原物质。内毒素实验凝胶法专家讲座第4页细胞壁结构：肽聚糖脂蛋白革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌外膜磷壁酸脂多糖细菌内毒素：革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中脂多糖（LPS）。当细胞壁外膜结构完整时不具备生物活性，只有当细菌死亡，脂多糖脱落才显示出内毒素活性。脂多糖结构：多糖O抗原＋关键多糖＋类脂A致热活性部分内毒素实验凝胶法专家讲座第5页细菌内毒素生物活性

1、致热性。2、致死性毒性。3、白细胞降低。4、激活凝血系统。5、降低血压，休克。6、Shwartzman反应。7、刺激淋巴细胞有丝分裂，等等。内毒素实验凝胶法专家讲座第6页细菌内毒素耐热性细菌内毒素具很强耐热性，普通高压灭菌不能去除细菌内毒素，需250℃最少30分钟以上干热灭菌才能使其灭活。

内毒素实验凝胶法专家讲座第7页试验用器具处理

内毒素试验中使用器皿都要经过处理去除可能存在外源性内毒素。耐高温玻璃器皿等置于电热干烤箱内180℃干烤最少2h或者250℃干烤最少30分钟；塑料器皿置于30％双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒素检验用水充分冲洗，60℃烘干备用。

内毒素实验凝胶法专家讲座第8页细菌内毒素单位内毒素量值：1、内毒素单位（EU）1982年FDA将当初美国代号为EC－2内毒素标准品要求为5EU/ng。1983年内毒素单位（EU）被USP正式引用。2、国际单位（IU）WHO先后两次组织协作标定，建立内毒素国际标准品，其中第二批内毒素国际标准品适合用于全部内毒素检验法，且明确1IU＝1EU。内毒素实验凝胶法专家讲座第9页细菌内毒素检验法凝胶法浊度法光度法显色基质法重现性好能定量能控制药品增强/抑制干扰操作简便。节约时间方法分类方法特点内毒素实验凝胶法专家讲座第10页细菌内毒素检验法概念本方法是利用鲎试剂检测由革兰氏阴性菌产生细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素限量是否符合要求一个方法。细菌内毒素检验法包含凝胶法和光度测定法，因为凝胶法操作简单快捷、灵敏度高，而且药典要求当不一样试验方法结果存在争议时，除另有要求外，以凝胶法为准，所以凝胶法被广泛应用。内毒素实验凝胶法专家讲座第11页鲎：一个古老栖身于沿海海洋生物，节肢动物门，在我国主要分布于浙江、福建及两广沿海一带。鲎试剂：利用鲎血液中变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到一个细胞溶解物，能与极微量细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应速度和凝胶坚固程度与内毒素浓度相关，是体外检测内毒素敏感试剂。内毒素实验凝胶法专家讲座第12页内毒素实验凝胶法专家讲座第13页凝胶法概念

凝胶法是经过鲎试剂与内毒素产生凝集反应原理来检测或半定量内毒素方法。内毒素实验凝胶法专家讲座第14页鲎试剂与内毒素反应机理内毒素C因子活化C因子凝胶B因子凝固酶原凝固酶活化B因子凝固蛋白原鲎凝血系统－酶联反应内毒素实验凝胶法专家讲座第15页二、细菌内毒素凝胶法试验程序1、试验准备：试剂、仪器及用具2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度3、鲎试剂灵敏度复核4、供试品干扰试验（新药或新方法）5、供试品内毒素限量检验内毒素实验凝胶法专家讲座第16页凝胶法中用到仪器

1.超净工作台

内毒素实验凝胶法专家讲座第17页凝胶法中用到仪器2.恒温培养箱

孵育样品浸提液以及培养试验结果。内毒素实验凝胶法专家讲座第18页凝胶法中用到仪器3.干烤箱

用于试验用耐高温器皿去热源，温度范围要求最少300℃内毒素实验凝胶法专家讲座第19页凝胶法中用到仪器4.移液器和无热源移液尖（或者去热源刻度吸管）

5.计时器、漩涡混合器、电子天平等内毒素实验凝胶法专家讲座第20页凝胶法中用到器皿器具分类器具名称反应试管玻璃试管（外径10×75mm）、试管架、小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头其它酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、封口膜、记号笔内毒素实验凝胶法专家讲座第21页凝胶法中用到试剂

1）鲎试剂：含有国家颁发同意文号2）细菌内毒素工作品3）细菌内毒素检验用水（内毒素含量小于0.015EU/ml无菌水）

4）75％乙醇内毒素实验凝胶法专家讲座第22页鲎试剂灵敏度复核试验

当使用新批号鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

内毒素实验凝胶法专家讲座第23页鲎试剂灵敏度复核试验

依据鲎试剂灵敏度标示值（λ）,将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检验用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟,然后制成2λ、1λ、0.5λ和0.25λ四个浓度内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。内毒素实验凝胶法专家讲座第24页鲎试剂灵敏度复核试验

取复溶后0.1ml/支规格鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不一样浓度内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管各加入0.1ml细菌内毒素检验用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃适宜恒温器中，保温60分钟±2分钟。

内毒素实验凝胶法专家讲座第25页鲎试剂灵敏度复核试验结果观察

将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，若管内形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或形成凝胶但倒转180°后从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应防止受到振动造成假阴性结果。

内毒素实验凝胶法专家讲座第26页鲎试剂灵敏度复核试验

若最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。计算反应终点浓度几何平均值，即为鲎试剂灵敏度测定值（λc），计算方法见中国药典。反应终点浓度是指系列递减内毒素浓度中最终一个呈阳性结果浓度。当λc在0.5λ～2.0λ（包含0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检验，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂灵敏度。

内毒素实验凝胶法专家讲座第27页凝胶法试验步骤

下面我们结合中国药典、GB14233.2医用输液、输血、注射器具检验方法以及GB15810一次性无菌注射器来学习详细试验方法。

内毒素实验凝胶法专家讲座第28页试验步骤

浸提介质（细菌内毒素检验用水）体积计算公告：V－－浸提介质体积，单位为（ml）；L－－产品细菌内毒素限值（该产品允许含有细菌内毒素量），单位为EU/件；λ－－鲎试剂灵敏度标示值，单位为EU/ml。内毒素实验凝胶法专家讲座第29页试验步骤样品处理方法：

a）管类和容器类器具用细菌内毒素检验用水浸泡器具内腔，在（37±1）℃恒温箱中孵育不少于1h，取浸提液进行试验；b）小型配件或实体类样品置无热源玻璃器皿内，加入细菌内毒素检验用水振荡数次，在（37±1）℃恒温箱中孵育不少于1h，取浸提液进行试验。制备供试液储存不应该超出2h。普通要求供试液PH值在6.0~8.0之间，如不在该范围内，可用鲎试剂厂家提供PH缓冲液调整浸提液PH值。内毒素实验凝胶法专家讲座第30页试验步骤内毒素实验凝胶法专家讲座第31页结果观察

B、C溶液反应管必须要阳性，就是轻轻倒转180度过来，鲎试剂安瓿里反应溶液形成了凝胶体，不滑落。而D溶液，就是细菌内毒素检验用水那2管，必须要阴性，3个条件都满足，就说明试验结果是可信。最终看A溶液反应情况：阳性就说明原套器具每件大于20EU，判定为不合格；阴性就说明小于20EU,结果是合格；1管阳性、1管阴性则要重新复查，复试时，溶液A需做4支平行管，若全部平行管均为阴性则判断合格；不然判断为不合格。内毒素实验凝胶法专家讲座第32页注意事项1.每批鲎试剂在用于试验前首先要进行灵敏度复核试验；2.安瓿开启前应先用砂石划痕(不论是色点或包环易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，千万不能用镊子敲击，预防碎玻屑掉入安瓿。3.在鲎试剂溶解、样品稀释及加入时，取样均应准确，缓缓加入防止气泡。

4.保温过程中不可随时取出观察，预防形成凝胶受到振动后变形而误判为阴性。

内毒素实验凝胶法专家讲座第33页注意事项5.冻干鲎试剂应存放在2-8℃下；防止长时间放置在高于25℃温度条件下。已复溶鲎试剂在间歇使用过程中最好放在2-8℃冰箱里，可存放24小时，在-20℃以下，可存放四个星期，鲎试剂只能冻融一次。

内毒素实验凝胶法专家讲座第34页三、操作注意事项试验前准备：1、玻璃器具应规范化，便于除热原、计量准确、清洗操作方便。洗净去污去内毒素去洗涤剂精洗除外源性热原：250

℃干烤最少1小时。2、尽可能用铝制器具和不锈钢用具，且用蒸馏水冲洗后250

℃干烤最少1小时。3、用于内毒素检测稀释试管最好用玻璃试管；塑料用具只能为一次性且确保无内毒素。内毒素实验凝胶法专家讲座第35页试验环境：最好在洁净室或洁净工作台内进行，确保环境温度、湿度及通风稳定。试验人员：用适宜洗涤剂洗手，用75％酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。试验过程：1、内毒素工作标准品应严格按要求低温保留；工作标准品开封后尽快使用且应一次性用完，不再保留。2、溶解后标准品用封口膜封口后在漩涡振荡器上混匀15min；深入稀释时每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30s。内毒素实验凝胶法专家讲座第36页内毒素实验凝胶法专家讲座第37页振荡前振荡后内毒素分子在水溶液中状态内毒素实验凝胶法专家讲座第38页3、每一步稀释液所用移液器不能重复、交叉使用。4、鲎试剂复溶时应将检验用水顺着瓶壁加入，防止产生气泡。5、操作时间长短。环境温度改变都会影响试验结果，故