结核病的实验室诊断技术及应用

结核病的实验室诊断技术及应用第1页/共56页全球范围内结核病疫情急剧恶化

全球1/3人口（约20亿）已感染了结核菌，人口的大规模流动

结核病与艾滋病同时流行结核菌耐多药菌株的出现我国是世界上仅低于印度和印尼的第三结核病大国

患病率高，新发患者93万/年，结核菌感染率为约40％

死亡率高，每年死亡人数达13万

耐药率高早期快速诊断与治疗成为制约结核病防控的关键因素

常规结核病实验室检测方法诊断阳性率不到60％。

《摘自2014年中国结核病监测报告》第2页/共56页结核病检测技术发展历程分子诊断时代DNA诊断：PCRLAMPGeneXpert基因芯片RNA诊断：TMANASBA免疫学检测：AbAgPPDT-SPOT细菌法：直接镜检体外培养SAT19世纪中叶20世纪60年代20世纪80年代20世纪90年代灵敏度低检测周期长成本低交叉污染仪器要求复杂反应抑制高灵敏度高特异性交叉污染少血清学检测WHO不推荐r-干扰素释放实验结核病检测技术发展历程第3页/共56页一、细菌法直接涂片

（阳性率低—5000以上细菌/ml；

不能区分真假、死活）第4页/共56页一、细菌法结核菌的培养

结核病病原学诊断的金标准(培养时间长是其软肋)第5页/共56页一、细菌学检测的新方法

—提高阳性率发光二极管荧光显微镜（LED）液体培养（可同时缩短培养时间）自动化涂片/染色技术（夹层杯法）不能区分真假、死活；培养仍是金标准但耗时长、第6页/共56页分枝杆菌固体培养与液体培养比较液体培养（BDMGIT960）固体培养（罗氏L-J）疑似新发患者报阳时间（d）13.63±7.1428.67±10.04复诊患者报阳时间(d)22.94±9.5528.53±10.40疑似新发患者阳性率32.00%17.90%复诊患者阳性率9.30%2.60%污染率6.57%4.0%液体培养在提高阳性率、缩短报阳时间上均优于固体培养。吴学兵，陆彬，桂晓虹等。液体MGIT培养法在结核分枝杆菌检测中的应用评估。检验医学，2013,3（28）：211-214仍然不能满足临床快速诊断的需要第7页/共56页二、免疫学检测

血清学检测（抗体、抗原）结核菌素试验（灵敏度、特异性？）结核感染T细胞检测（γ-干扰素检测）第8页/共56页WHO关于血清学检测声明2011年7月20日，世界卫生组织（WHO）正式声明，要求禁止将血清学检测方法（抗原，抗体，蛋白芯片等）用于肺结核和肺外结核的诊断。WHOwarnsagainsttheuseofinaccuratecommercialserologicaltestsforpulmonaryandextra-pulmonaryTB.蛋白质组学的发展

3、4、7种结核杆菌优势表位抗原（16KD、38KD、MPT64、ESAT-6、CFP10、Mtb8、Mtb8.4、Mtb16.3）制备多靶点蛋白微阵列大量的文献报道其敏感性特异性均显著高于涂片与培养法可用于结核病的临床辅助诊断，提高痰涂片和痰培养假阴性的检测率参考文献略第9页/共56页γ-干扰素释放实验（IGRAs)10Interferon-GammaReleaseAssays第10页/共56页结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失RD1和RD2绝大多数的环境分枝杆菌(NTM)也不存在RD1和RD2区11ESAT-6

:早期抗原靶6（EarlySecretedAntigenicRarget6）CFP10

:培养滤液蛋白10（CultureFiltrateProtein10）第11页/共56页12结核杆菌特异抗原：ESAT-6与CFP10结核菌群抗原ESAT6CFP-10Mtuberculosis++Mafricanum++Mbovis++BCGsubstrain

gothenburg--moreau--tice--tokyo--danish--glaxo--montreal--pasteur--抗原

ESAT6CFP-10Mabcessus--Mavium--Mbranderi--Mcelatum--Mchelonae--Mfortuitum--Mgordonii++Mintracellulare--++Mmalmoense--Mmarinum++Moenavense--Mcrofulaceum----Mszulgai++Mterrae--Mvaccae--Mxenopi--环境分枝杆菌MsmegmatisMkansasii--第12页/共56页准确—T-SPOT临床诊断性能

特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应美国FDA数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性94.1%(478/508)

灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)13阴性预测值：93.9%（478/509）阳性预测值：95.4%（624/654）第13页/共56页

T-SPOT相关指南T-SPOT®.TB是采用γ-干扰素释放试验（IGRA）原理，获得美国FDA认证、欧盟CE认证和首个中国CFDA认证的商业化产品列入欧美25个国家结核诊疗指南2011年英国NICE指南、2010年美国最新结核诊疗指南、2010年加拿大结核指南美国CDC推荐—卡介苗（BCG）接种人群结核感染检测首选国内风湿科和消化科已列入专家共识14第14页/共56页快速—T-SPOT的实验步骤用BDCPT管或Ficoll提取液收集外周血单个核细胞结核特异抗原（ESAT-6/CFP10）刺激结核特异的效应T淋巴细胞使其分泌γ-干扰素效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素与膜板预包被的抗γ-干扰素抗体结合并固定在细胞周围1个斑点=1个效应T细胞加入显色液，观察结果过夜孵育，洗板，加入酶标二抗15第15页/共56页实验效果图阴性结果阳性结果空白对照抗原AESAT-6抗原BCFP10阳性对照（PHA）一个斑点=一个结核效应淋巴细胞第16页/共56页T-SPOT结果的解读-阳性结果活动性结核病

—典型结核中毒症状

—影像学支持

—排除其他诊断MTB感染状态

—典型结核中毒症状

—未发现结核患病证据潜伏性结核感染

—无结核中毒症状

—无其它结核患病证据陈旧性结核

—无结核中毒症状

—既往TB史或明确TB证据NTM（四种）感染高孟秋，γ-干扰素释放试验检测结果的临床意义解读，中华结核和呼吸杂志，2014第17页/共56页T-SPOT结果解读-阴性结果除外结核感染

—所用抗原为MTB特异性抗原

—机体没有结核特异抗原致敏的T淋巴细胞

—

目前未感染结核分枝杆菌假阴性：感染阶段不同（窗口期）少数免疫系统功能不全/基础疾病的情况，如HIV感染者、肿瘤患者、婴幼儿等特殊肺外结核：结核性脑膜炎、粟粒性结核灵敏度相对较低实验非正常操作：细胞计数不够等高孟秋，γ-干扰素释放试验检测结果的临床意义解读，中华结核和呼吸杂志，2014第18页/共56页T-SPOT的应用优点：使用血液标本，取样简单；可用于肺内和肺外结核检测；阴性预测值很高，可用于排除结核感染。缺点：

阳性预测值约80%，不能用于结核的确诊

不能确定是否是肺结核（肺外）

不能区分是活动性和潜伏性结核不能区分某些非结核分枝杆菌（堪萨斯、苏氏、戈登、海分枝杆菌）操作复杂，时间长；对于原发感染初期或免疫低下人群，可能存在假阴性。能否疗效监测？——无大量数据第19页/共56页

三、结核DNA检测技术测序——金标准荧光定量PCR环介导恒温扩增法（LAMP）基因芯片检测鉴定技术基因XpertMTB/RIF检测技术第20页/共56页1.荧光定量PCR是应用最为广泛的TB-DNA定量PCR检测方法具有灵敏度高（10CFU/ml）、特异性强、线性关系好、操作简单等优点。第21页/共56页

2.环介导恒温扩增法（LAMP）

是在恒温下进行PCR扩增，因此操作更为简便，反应更加快速。65℃扩增40min即可用肉眼观察结果。扩增阳性标本呈现绿色荧光，反之为阴性。是结核分枝杆菌DNA检测技术的代表-灵敏、快速、特异、简捷将会极大地推动结核病的防治工作第22页/共56页DNA检测---LAMP结果判读：显色目测或SYBRGreenI等荧光染料第23页/共56页LAMP法和其他PCR法的比较第24页/共56页LAMP法在结核菌检测中的应用临床试验——

LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果灵敏度＝89.54%阳性结果预期值＝98.13%特异性＝98.93%阴性结果预期值＝93.77%总符合率＝95.31%第25页/共56页26

JournalofClinicalMicrobiology.2010,48(10):3654–3660.结核

胞内通量：可同时检测16-22种常见分枝杆菌速度：6小时灵敏度：103CFU/ml可自动或肉眼判读结果

3.基因芯片检测技术第26页/共56页检测全程仅需6小时第27页/共56页MSM耻垢分枝杆菌MTC结核分枝杆菌复合群MTR次要分枝杆菌MIN胞内分枝杆菌MAV鸟分枝杆菌MGA胃分枝杆菌MKA堪萨斯分枝杆菌MSC瘰疠分枝杆菌MUA母牛分枝杆菌MCH龟分枝杆菌龟亚种MAB龟分枝杆菌脓肿亚种MSZ苏尔加分枝杆菌MMA海/溃疡分枝杆菌MXE蟾蜍分枝杆菌MDI迪氏分枝杆菌MFO偶发/猪分枝杆菌MGI浅黄分枝杆菌MSI猿猴分枝杆菌MTE土分枝杆菌MPH草分枝杆菌CC质控点MNO不产色分枝杆菌MGO戈登分枝杆菌同时鉴定MTC与21种NTM第28页/共56页4.XpertMTB/RIF检测技术

第29页/共56页GeneXpert应用1、TB复合群鉴定。2、利福平耐药检测。3、WHO推荐4、Xpert®MTB/RIF检测试剂的阳性检出率低于人们对分子生物学诊断试剂高敏感度的预期值，（1000CFU/ml）第30页/共56页DNA用于临床检验的不足“死菌检测呈阳性”，与临床相关性差不能区分“潜伏感染”“活动性感染”

易交叉污染

反应易受抑制第31页/共56页NASBA（国外）TMA（国外）SAT（国内）四、常见的RNA检测技术第32页/共56页SAT技术是将核酸恒温扩增和实时荧光检测相结合的一种新型RNA检测技术。TB—SAT检测技术第33页/共56页TB-RNA释放恒温扩增实时检测超声波（300W）15min痰液预处理42℃40min与反应液混合60℃10min42℃5minTB-SAT操作流程50µl稀释液全程2小时，会做PCR，就学的会SAT第34页/共56页TB-SAT检测技术优点灵敏

检测下限1--10条菌/ml快速

42℃恒温扩增,30分钟内扩增10亿倍简便无提取步骤，扩增结束即得出结果。特异rRNA特异性非常高污染率低

RNA易降解，环境中存在时间短第35页/共56页RNA诊断技术的优势灵敏度高：RNA≥DNA拷贝数与临床相关性好：区分“死活菌”：

减少抗生素滥用可以诊断“活动性感染”：

活动性感染：RNA转录活跃

潜伏感染：RNA不转录不易污染：靶标和扩增产物都是RNA第36页/共56页TB-SAT检测区分MTB和NTM结核分枝杆菌复合群（MTB）：人型结核分枝杆菌牛型结核分枝杆菌非洲型结核分枝杆菌非结核分枝杆菌（NTM）：研究表明，TB-SAT可以区分如下NTM：堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、海分枝杆菌等18种NovelReal-TimeSimultaneousAmplificationandTestingMethodToAccuratelyandRapidlyDetectMycobacteriumtuberculosisComplexJ.Clin.Microbiol.2012,50(3):646.DOL:10.1128/JCM.05853-11.第37页/共56页活菌检测技术，可用作肺结核治疗效果评估据文献报道：每个结核分枝杆菌含有约2000个拷贝rRNA研究表明：rRNA与结核分枝杆菌的生活力有着很好的相关性，rRNA可以反映结核分枝杆菌的死菌活菌状态研究表明：在用药治疗期内，随着结核分枝杆菌的死亡，rRNA大约在7天左右时间全部降解。而DNA含量几乎保持不变VIVIANJONAS,etal.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,Sept.1993,p.2410-2416CLAUDIOPIERSIMONI,etal.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,Jan.1997,p.193–196.GABRIELLEM.E.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,Sept.1994,p.1959-1965

第38页/共56页免疫法常有既往感染问题SAT更有利于治愈判断窗口期时间示意相对浓度示意抗体RNADNA病原体感染前后各检测靶标的含量变化死菌的RNA快速降解，有助治愈判断用药治疗DNA需要一段时间降解RNA快速降解第39页/共56页相比DNA,RNA检测能更好的体现疗效服用利福平和氧氟沙星后，第三天和第七天DNA和RNA的滴度变化，相比DNA,RNA与药物浓度变化的符合率更高，RNA检测能更好的进行疗效评估。GABRIELLEM.E.Assessment

of

Mycobacterial

Viability

by

RNA

Amplification.ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,Sept.1994,p.1959-1965

DNARNA第40页/共56页SAT与培养的监测结果一致，可应用于疗效评估监测项目阳性患者数（%）0月0.5月1月2月4月6月集菌涂片150（100.0）53（35.3）20（13.3）9（6.0）4（2.7）6（4.0）罗氏培养150（100.0）83（55.3）32（21.3）16（10.7）12（8.0）12（8.0）TB-PCR148（98.7）84（56.0）47（31.3）20（13.3）12（8.0）13（8.7）SAT法150（100.0）86（57.3）35（23.3）16（10.7）12（8.0）12（8.0）胡永领，刘成永，成松.应用RNA恒温扩增实时荧光检测技术观察抗结核药物的疗效.海峡药学,2015年第27卷第1期SAT在抗结核治疗药物效果检测方面，虽不能直接作出药物敏感试验，但可以最快地直接判断所用药物的疗效，及时调整药物使用，可大大降低医疗成本和耐药产生的机会，大幅度减少医疗时间和费用。第41页/共56页TB-SAT检测体液、病灶组织标本的灵敏度蔡杏珊,马品云,张院良，谭耀驹

中国防痨杂志,2014,36(6):458-461第42页/共56页小结TB-SAT是国内唯一的结核分枝杆菌RNA检测产品，2小时报告结果，可以快速对开放性肺结核患者进行排查。TB-SAT可以区分结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌，准确鉴别出肺结核患者。中国防痨协会与结核病权威专家推崇TB-SAT用于早期发现传染性肺结核，减少肺结核导致的公共卫生安全问题。第43页/共56页美国CDC关于RNA检测技术

在TB诊断的指南1996：美国首个结核病的RNA检测技术通过FDA认证，配合培养法对涂阳患者进行诊断2000：美国CDC指出RNA检测技术用于TB疑似患者(涂阳、涂阴)痰液检测、DNA检测技术仅用于涂阳患者的痰液检测2009：更新关于分子诊断技术在TB实验室诊断的指南至少一个痰液样本使用分子诊断技术检测TB实验室初步诊断同时参照分子诊断和涂片的结果第44页/共56页中国结核病诊断专家共识结核病诊断专家组：庄玉辉、万利亚潘毓瑄、成诗明赵雁林、王国治吴雪琼、万康林周林、许卫国居金良、胡忠义专家共识：TB-SAT显著提高结核分枝杆菌的阳性检出率，对早期发现传染性肺结核患者，控制结核病传染源有极其重要的意义中国防痨协会，2012年6月第45页/共56页结核实验室检测方法中推荐SAT胡忠义.实验结核病学.军事医学科学出版社.2014.赵雁林.结核病实验室检验规程.中国防痨协会.2015第46页/共56页五、耐多药结核病诊断现状47

固液体培养（时间、生物安全等）分子生物学技术应用使快速检测耐药成为可能MDR、XDR的出现对结核病的防控提出了严峻的考验第47页/共56页结核耐药分子诊断技术测序（金标准-检测突变的理想方法）实时荧光PCR探针溶解曲线法实时PCR技术（GeneXpert）线性探针杂交（HainLPA）基因芯片（Genechip）48检测已知的突变位点耐药分子诊断检测的灵敏度：103CFU/ml第48页/共56页结核病耐药与基因64-68%

rpsL基因突变70%embB基因突变70%65%耐药基因93%95%95%

rpoB基因突变利福平异烟肼50-70%

katG基因突变5-10%

inhA基因突变6-13%

ahpC基因启动子区域突变链霉素乙胺丁醇

多数研究报告提示：耐药的发生与结核杆菌的基因突变有关。总体上是基因一个或几个核苷酸突变（表现增加、缺失、替代），造成核苷酸编码错误致氨基酸错位排列，影响药物与靶位酶结合产生耐药第49页/共56页结核耐药分子诊断技术测序-与标准序列进行比照检测未知的突变位点（金标准-检测突变的理想方法；设备、检测的费用昂贵）实时荧光PCR探针溶解曲线法-检测利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇已知的耐药突变位点-2小时实时PCR技术（Gene