细胞免疫学技术

细胞免疫学技术第1页/共43页第二节吞噬细胞功能检测技术一、中性粒细胞功能检测二、巨噬细胞功能检测第三节免疫细胞功能检测的临床应用思考题小结第2页/共43页

对淋巴细胞群，中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等功能测定可以有效评价机体特异性和非特异性免疫功能。第3页/共43页第一节淋巴细胞的功能检测

淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定第4页/共43页淋巴细胞T细胞（负责细胞免疫功能）B细胞（执行体液免疫功能）NK和K细胞（非特异性免疫作用）第5页/共43页一、T细胞功能的检测T细胞增殖试验T细胞分泌功能测定T细胞介导的细胞毒试验体内试验第6页/共43页（一）T淋巴细胞增殖试验1.原理：淋巴细胞DNA合成分化母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松第7页/共43页

未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞过渡型细胞大小(直径μm)12～2012～166～8核大小、染色质增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4个有或无无有丝分裂有或无无无胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色浆内空泡有或无有或无无伪足有或无有或无无第8页/共43页2.淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：

PHA------T细胞

ConA-------T细胞

PWM-------T、B细胞

LPS-------B细胞特异性刺激物：异种抗原同种组织抗原

第9页/共43页3.检测方法

形态法：刺激物淋巴细胞（4-6天）母细胞化同位素法：PHA淋巴细胞（54h）

DNA合成期+3HTdR掺入

收集细胞

检测β射线

测定细胞内的3H－TdR第10页/共43页（1）形态学检查法第11页/共43页方法学评价：优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。第12页/共43页（2）3H-TdR掺入法优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。第13页/共43页(二)T细胞分泌功能测定

体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。

第14页/共43页（三）T细胞介导的细胞毒试验1.原理：靶细胞抗原T细胞观察杀伤活力致敏CTL靶细胞第15页/共43页形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞同位素法：淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞肿瘤细胞破坏51Cr释放测定γ射线2.方法意义：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力

第16页/共43页图15-2T细胞细胞毒试验示意图第17页/共43页(四)体内试验特异性抗原皮肤试验PHA皮肤试验第18页/共43页二、B细胞功能检测B细胞增殖能力的试验溶血空斑试验B细胞抗体形成功能的检测体内试验第19页/共43页(一)B细胞增殖能力的试验抗IgM细菌脂多糖SAC的SPA

B细胞增殖形态学3H－TdR掺入法第20页/共43页(二)溶血空斑试验1.原理：第21页/共43页2.方法学：经典溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验

第22页/共43页3．临床应用与评价溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。

第23页/共43页(三)

B细胞抗体形成功能的检测

——酶联免疫斑点法1.原理：第24页/共43页2．应用与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。第25页/共43页(四)体内试验体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。第26页/共43页染色计数离心取上清测LDH或AKP离心取沉淀测活细胞荧光测发光强度测CPM值形态法酶释法荧光法同位素法化学发光法三、NK细胞活性测定靶细胞溶解常用靶细胞:

K562细胞株第27页/共43页第二节吞噬细胞功能检测技术

吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。一、中性粒细胞功能检测技术二、巨噬细胞功能检测技术第28页/共43页吞噬细胞的功能：

趋化

吞噬胞内杀灭作用

第29页/共43页一、中性粒细胞功能的检测

细胞趋化功能的检测吞噬和杀菌功能的检测第30页/共43页(一)细胞运动功能——趋化功能检测1.原理：第31页/共43页2.方法学：琼脂糖平板法

滤膜渗透法（Boyden小室法）第32页/共43页(二)吞噬和杀菌功能测定1．显微镜检查法：第33页/共43页2.溶菌法3．NBT还原试验

第34页/共43页二、巨噬细胞功能检测(一)炭粒廓清试验

正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。第35页/共43页(二)吞噬功能检测

巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。第36页/共43页(三)巨噬细胞溶酶体酶的测定1．酸性磷酸酶的测定硝酸铅法偶氮法2．非特异性酯酶的测定常用α-萘醋酸法第37页/共43页(四)细胞毒作用测定

用IFN-γ激活小鼠巨噬细胞，观察其对125I-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815的杀伤活性。第38页/共43页(五)巨噬细胞促凝血活性测定

激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经37℃预温的正常兔血浆和CaCl2混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置37℃，即时记录血浆凝固时间。第39页/共43页反映机体免疫功能状态。肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。第三节免疫细胞功能检测的临床应用第40页/共43页思考题T细胞功能检测内容有哪些？什么是T细胞增殖试验的原理、刺激物及方法学？何谓T细胞介导的细胞毒试验的原理和方法学？何谓结核菌素皮肤试验？B细胞功能检测的方法学有哪些？何谓溶血空斑试验的原理和方法学？NK细胞活性测定的方法学有哪些？中性粒细胞功能检测方法学及相应原理。巨噬细胞功能检测方法学及相应原理。免疫细胞功能检测的临床应用有哪些？第41页/共43页小结免疫细胞功能试验包括体内和体外试验。免疫细胞功能体外试验主要根据免疫细胞的增殖活性、分泌活性和杀伤活性等特性而进行实验