组织病理学制片技术

组织病理学制片技术第1页/共66页组织病理学制片技术

Histopathologic

technology生命科学研究中心邢立强emxlq@163.com2

牛牛文库文档分享第2页/共66页目的和要求

AimsandRequirements了解生物组织的特点及取材的注意事项；熟悉切片的原理、一般要求及注意事项；掌握石蜡切片制作技术；

牛牛文库文档分享第3页/共66页病理学常用的观察手段

Thecommonsurveymeansinpathology1、大体标本观察：主要用肉眼、量尺及各种衡器等辅助工具，对所检标本的大小、形状、色泽、重量、表面及切面、病灶特点进行观察及测量。2、组织切片的观察：取正常或病变组织进行切片、染色(HE染色最常用)在显微镜下进行观察。

牛牛文库文档分享第4页/共66页病理学标本的种类

Typesofpathologicsamples1、活体组织检查(Biopsy)：简称活检，从患者活体局部切取、钳咬、细针吸取和摘取等手术方法获取病变组织进行病理检查。2、脱落细胞学检查(Exfoliativecytologicalexam)：对患者痰液、胸腹水、尿液以及阴道刮片、食管拉网、纤维胃/支气管镜所取得的材料进行涂片，以检查脱落细胞，是早期发现和诊断肿瘤的好方法。

牛牛文库文档分享第5页/共66页3、尸体解剖(Autopsy)：通过尸检可查出病因和病变，及时发现和确诊某些传染病、新发现的疾病，积累经验，提高诊疗水平。4、动物实验(Animalexperiment)：根据研究需要，在动物身上复制人类某些疾病的模型、进行观察研究，了解疾病的病因、发病机制及药物疗效等。5、组织/细胞培养(TissueandCellculture)：将某种组织或单细胞在适宜的培养基中体外培养，来研究各种病因作用下组织、细胞的病理变化及治疗效果。

牛牛文库文档分享第6页/共66页病理技术的应用Applicationofpathologictechnique帮助临床查明死因(尸检);手术后病变标本，明确诊断(临床活检);为教学、科研提供资料;

牛牛文库文档分享第7页/共66页取材(Samplecollection)→固定(Fixation)→脱水(Dehydration)→透明(Transparentizing)→浸蜡(Paraffinsoaking)→包埋(Embedding)第一节组织处理

Tissueprocessing

牛牛文库文档分享第8页/共66页

1.人为因素

2.标本大小

3.取材时间

4.包埋方向

5.边缘标记一、取材(Samplescollection)

牛牛文库文档分享第9页/共66页6.小标本的处理方法

7.特殊情况取材

8.取材数量

9.清除多余成分10.重复取材11.核对取材12.剩余组织存放

牛牛文库文档分享第10页/共66页二、固定(Fixation)固定就是用物理或化学方法，阻止组织细胞离体或培养细胞脱离生存环境后发生形态学变化。(一)固定的目的1.迅速阻断组织细胞离体后的自溶性变化，防止腐败，尽量保持组织细胞生活状态下的形态结构。2.使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变成不溶性物质，并保持原有的空间位置。3.固定剂有硬化作用,增加组织的硬度,便于制片。4.组织中的各种物质经固定后产生对染料的亲和力，利于染色和观察。

牛牛文库文档分享第11页/共66页（二）常用的固定方法1.浸泡固定法2.灌注固定法3.细胞涂片的固定方法4.微波固定法5.蒸气固定法

牛牛文库文档分享第12页/共66页（三）常用的固定液1.单纯固定液(1)甲醛(formaldehyde)(2)酒精(alcohol)(3)苦味酸(picricacid)

(4)丙酮(acetone)(5)醋酸(aceticacid)

牛牛文库文档分享第13页/共66页2.混合固定液(1)Bouin液：用于结缔组织及脂肪染色；(2)Zenker液：常用于三色染色；(3)4%多聚甲醛-磷酸二氢钠-氢氧化钠液；

牛牛文库文档分享第14页/共66页（四）固定后的处理1.一般固定液(甲醛等)固定组织后，用流水冲洗以清除组织内的固定液终止固定。2.含有乙醇、乙酸及苦味酸的固定液，组织固定后不需要或不能用水冲洗。3.含有铬酸、重铬酸钾和锇酸的固定液，组织固定后应充分水洗，一般为12~24h。4.用含汞的固定液固定组织后，要进行脱汞处理，可在组织脱水前或切片染色前进行，一般多在染色前脱汞。其方法为切片脱蜡入水后，入0.5%碘乙醇5~10min，水洗后再入3%~5%硫代硫酸钠或95%乙醇1~2min，再充分水洗，蒸馏水洗后进行染色。

牛牛文库文档分享第15页/共66页（五）固定时的注意事项1.标本应新鲜并及时取材，快速放入固定液中。特殊标本应单独固定和存放。2.固定液的用量一般固定液用量为组织块体积的10~20倍，贵重的固定液不少于3~5倍。避免组织紧贴容器底部，影响固定效果。对于特殊染色的组织(如神经染色及酶组织化学染色等)固定时应考虑组织块的大小、固定液种类、固定时间和温度等。酶组织化学染色组织的固定应置于冰箱4℃固定。

牛牛文库文档分享第16页/共66页3.防止组织变形柔软或较薄的组织先平铺在吸水纸上，再投入固定剂中；含气或脂肪多的组织易浮于液面，可在组织表面覆盖棉花以达到充分固定。4.固定液的穿透性一般固定液在24h内不能穿透厚度大于2~3mm的实体组织或5mm的多孔疏松组织，故取材组织块的厚度原则上不应超过3~4mm。5.固定时间固定的时间与固定液的种类、组织类型、块大小、温度等有关。一般1.5cm×1.5cm×0.2~0.3cm大小的组织块,固定时间为12~24h。6.固定温度大多数可在室温(25℃)固定，在低温(如4℃)固定时，固定时间要相应延长。

牛牛文库文档分享第17页/共66页三、脱水(Dehydration)组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混溶。因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水。常见的脱水剂有乙醇、正丁醇、丙酮等。为防止水份丢失过快，造成组织变形，一般采用梯度脱水法。也就是使脱水剂的浓度逐渐升高，脱水过程尽量缓和，减少组织变形。

牛牛文库文档分享第18页/共66页四、透明(Transparentizing)常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、环己酮、苯甲酸甲酯、香柏油、冬青油和苯胺油等。目前也有用环己酮作为透明剂，环己酮为无色无毒液体，可与苯、二甲苯和酒精等相混合，也可溶解石蜡。而且脱水时组织不收缩变硬，用于快速石蜡切片效果较好。

牛牛文库文档分享第19页/共66页五、浸蜡(Paraffinwaxsoaking)用熔化的切片石蜡逐渐替换组织中二甲苯的过程。

牛牛文库文档分享第20页/共66页

牛牛文库文档分享第21页/共66页

牛牛文库文档分享第22页/共66页六、组织的包埋和包埋方法(Embedding)（一）常规石蜡包埋（二）脱落细胞标本的包埋（三）微小标本的包埋

牛牛文库文档分享第23页/共66页

牛牛文库文档分享第24页/共66页

牛牛文库文档分享第25页/共66页

牛牛文库文档分享第26页/共66页

牛牛文库文档分享第27页/共66页第二节组织切片法

(Tissuesectioning)

组织切片法包括石蜡切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、树脂包埋薄切片法和大组织石蜡切片法等。常用的切片工具包括组织切片机、切片刀和自动磨刀机等。

牛牛文库文档分享第28页/共66页一、组织切片机和切片刀1.石蜡切片机

2.火棉胶切片机

3.恒冷箱切片机

4.震动切片机

石蜡切片机震动切片机恒冷箱切片机

牛牛文库文档分享第29页/共66页切片刀切片刀是切片机的重要部件，常见的有两种：一种为可重复使用的钢刀，一般有4cm、8cm、14cm、18cm、20～24cm等，根据切片刀的形态，有平凹型、深平凹型、平楔型、双凹型。

另一种为一次性钢刀片，是一种薄型切片刀片，用于普通石蜡切片。使用时固定在特制的刀架上。

牛牛文库文档分享第30页/共66页各种切片刀的剖面图a平凹形

b深平凹形

c平楔形

d双凹形

牛牛文库文档分享第31页/共66页石蜡切片机用一次性钢刀片

牛牛文库文档分享第32页/共66页二、组织切片(Tissuesectioning)石蜡切片仍是目前各种切片制作方法中最常用、最普遍的一种方法。

牛牛文库文档分享第33页/共66页(一)切片前的准备1.备齐常用器具,如玻片、毛笔和铅笔或刻字笔。2.检查切片机的工作状态,将固件都拧紧，检查切片刀是否锋利,切片刀质量是保证切片的关键。如果使用一次性刀片,应根据切片情况及时调整刀刃位置。

牛牛文库文档分享第34页/共66页3.清洁玻片的方法（1）新载玻片的处理：先用清洁液浸泡12~24h,流水充分冲洗后,用蒸馏水洗3~5遍,95%酒精浸泡2h,用绸布擦干或用烘箱烤干备用。清洁液是用重铬酸钾和浓硫酸按比例配成的洗液。常用的有以下几种配方：①重铬酸钾(g):浓硫酸(ml):蒸馏水(ml)=1:1:10;②重铬酸钾:浓硫酸:蒸馏水=2:3:25;③重铬酸钾:浓硫酸:蒸馏水=2:5:15。

牛牛文库文档分享第35页/共66页（2）盖玻片的处理：盖玻片可按以上方法处理，但因盖玻片很薄，以上处理程序应缩短。清洁液浸泡2h，流水冲洗。也可用以下方法清洗:盖玻片立排于卧式染缸(排2行，中间隔以载玻片)。松紧度以玻片可轻松转动为好，以下步骤应保持液体进入每个玻片间隙，玻片之间不能有气泡。用1%盐酸酒精浸泡2h，然后流水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗数次。入95%酒精浸泡2~3h，无水酒精浸泡20min，倒掉酒精放60℃烘箱烤干备用。

牛牛文库文档分享第36页/共66页（二）切片制作过程1.蜡块在冰箱中预冷，然后固定在切片机上。将切片刀装在刀架上。调整蜡块与刀的位置，使蜡块切面与刀刃接近。2.切片机多为轮转式，使用时左手执毛笔，右手旋转切片机转轮。先修出标本，直到组织全部暴露于切面为止，标本过小时修块应多加注意，大标本要切全。切出蜡带后，用毛笔轻轻挑起一端，用镊子夹起另一端，正面向上放入展片水槽中(水温一般低于蜡熔点10~12℃)，待切片展平后，即可进行捞片。

牛牛文库文档分享第37页/共66页3.切片时刀是由下向上运动，为得到完整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬脆难切的部分放在上端(如皮肤组织的表皮部分，胃肠等组织的浆膜面等)。4.捞片时注意组织片的摆放位置，尽量整齐美观。要留出贴标签的空间，5.捞片时注意在切片和玻片之间不要留有气泡。捞好的切片应在60℃左右烤箱内烤至少30min。以防染色时脱片。

牛牛文库文档分享第38页/共66页

牛牛文库文档分享第39页/共66页

牛牛文库文档分享第40页/共66页

牛牛文库文档分享第41页/共66页（三）石蜡切片制作时的注意事项(Attentions)1.组织的取材和固定；2.组织脱水、透明和浸蜡；3.切片组织块固定不牢时；4.切片刀和切片机；5.特殊要求切片的制作。

牛牛文库文档分享第42页/共66页第三节冰冻切片法

(Frozensectioning)冰冻切片可用于新鲜组织、甲醛固定的组织和低温冰箱冷藏的组织块等。已固定的组织块经流水冲洗后再进行切片。

牛牛文库文档分享第43页/共66页一、冰冻切片法（一）恒冷箱切片机提前开机预冷，一般工作温度设定在-22℃左右。待刀台、样品台和箱内达到设置温度后即可切片。顺序如下：①将组织用OCT粘在样品托后放置在速冻台上；②组织冻结后，将样品托固定到样品台上；③调整组织切面与刀刃位置，初步修出组织切面后，放下防卷板，关闭观察窗，开始切片。④切出的切片粘贴到载玻片上，直接冻存或吹干固定。（二）半导体制冷切片机

牛牛文库文档分享第44页/共66页二、冰冻组织的取材及保存方法（一）取材负责诊断的医师应亲自检查大体标本，做多切面详细检查，必要时可在解剖镜下观察。选取最具代表性的组织制片，必要时应多点取材。如切面有特殊要求，应向技术人员说明。取材和切片的剩余组织须进一步做石蜡切片进行对照，有利于病理医师对照阅片，不断提高观察冰冻切片的水平。

牛牛文库文档分享第45页/共66页（二）保存方法组织速冻的方法很多，常用方法为液氮和干冰~丙酮法。1.液氮法：将组织块平放于瓶盖或标本盒等适当容器内，缓慢放入盛有液氮的容器内。当组织块冻结后，取出用铝箔包好，做好标记后入液氮罐或-70℃低温冰箱保存。可保存数月至数年。如短期内使用，可保存于-30℃冰箱。

牛牛文库文档分享第46页/共66页2.干冰-丙酮法：将组织块放入盛有OCT包埋剂的标本盒内，使组织块完全浸没。将丙酮倒入盛有10g干冰的保温杯调成糊状。将装有组织块的标本盒放入保温杯，待包埋剂成白色冻块时，取出如上法保存。此法组织速冻快，组织结构保存好。

牛牛文库文档分享第47页/共66页3.异戊烷-液氮法：此法的优点可防止冰晶破坏组织细胞的形态结构，对含水较多的组织适宜用此法进行速冻。先用甲基纤维素包埋组织块。将盛有异戊烷的小烧杯放入装有液氮的大保温杯或冰壶内，搅拌异戊烷待杯底出现一层白色糊状物时，放入包埋好的组织块，数秒钟即可取出，按上述方法保存。

牛牛文库文档分享第48页/共66页（三）注意事项1.液氮速冻时，标本盒不能直接浸入液氮，以免组织膨胀破碎。2.速冻的包埋剂应适量。3.新鲜组织不能放入-10℃冰箱内缓慢冷却，否则组织内水分可逐渐析出形成冰晶，造成组织结构破坏。4.冷冻后的组织块应密封保存，防止失水。5.在组织块复温时，应在37℃加温速融，自然复温将造成组织结构破坏。

牛牛文库文档分享第49页/共66页第四节脱落细胞制片技术

PreparationofExfoliativecytologicsamples脱落细胞标本包括：胸水、腹水、尿液、脑脊液穿刺液和一些涂片、刷片及印片的细胞，在临床上具有非常重要的诊断价值。

牛牛文库文档分享第50页/共66页一、细胞标本的取材细胞标本取材和制片方法一般有印片法、穿刺法、沉淀法和活细胞标本的制备等。(一)印片法常用于活检和手术标本，新鲜标本沿病灶中心剖开，将载片轻压于切面上，吹干后立即浸入固定液内5~l0min，取出自然干燥，低温储存。优点是操作简单，细胞抗原保存好。

牛牛文库文档分享第51页/共66页(二)穿刺液沉淀法常用于淋巴结、软组织、肝、肾和肺等，穿剌液少，可直接涂片，细胞尽量涂均匀。穿刺液多，细胞丰富，可置离心管内，以500rpm低速离心5~l0min，弃上清，将沉淀制成细胞悬液(2×105细胞/ml)。

牛牛文库文档分享第52页/共66页涂片镜检,以细胞较密不重叠为好。干燥后固定。胸水、腹水、尿液和脑脊液等如细胞较少时，也可用此方法制片。此法细胞保存好，操作简单。注意涂片时，尽量涂均匀。(三)单核细胞分离法主要用于外周血和胸腹水中淋巴细胞的分离。如为血性胸腹水，经上述方法分离淋巴细胞然后在37℃培养30min，离心沉淀取上清，制成浓度为2×106细胞/ml的细胞悬液，吸50µl涂片，略干后固定l0min。

牛牛文库文档分享第53页/共66页

牛牛文库文档分享第54页/共66页

牛牛文库文档分享第55页/共66页2023/4/2356宫颈脱落细胞涂片见分化不良细胞体积大、核深染；正常上皮细胞核小、胞浆丰富。

牛牛文库文档分享第56页/共66页二、血涂片的制作血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，制备厚薄适宜、分布均匀、染色良好的血涂片是血液学检查的基本技术之一。(一)操作步骤1.消毒：先按摩取血部位，使血流通畅；再用酒精消毒采血针和取血部位(如指尖)。2.取血：待酒精干后，刺破皮肤，使血自然流出，勿挤。取干净载片，让血滴在离载片一端中4~5mm处，注意手指持握载片的边缘，勿触及其表面。不能使载片接触取血部位的皮肤。

牛牛文库文档分享第57页/共66页3.推片：取一张边缘光滑的载片。将其一端置于血滴前方，向后移动到接触血滴，使血液均匀分散在推片与载片的接触处。然后使推片与载片呈30°~40°角，向另一端平稳地推出。涂片推好后，通过摇摆使之快速干燥。4.染色：用特种玻璃铅笔在血膜两侧画两条线，防止染液外溢。再将瑞氏染液(伊红-亚甲基蓝)滴在血膜上，至染液淹没全部血膜，染半分钟。加等量蒸馏水(或缓冲液)与染液混合再染5分钟。最后用蒸馏水把染液冲掉，用吸水纸吸干，自然干燥后，即可观察。

牛牛文库文档分享第58页/共66页（二）注意事项活细胞标本制备中玻片的清洗：新玻片常有游离碱,因此应用清洗液或10%盐酸浸泡24h,然后再彻底清洗。用过的玻片可放入适量肥皂水或合成洗涤剂的清水中煮沸20min,再用热水将肥皂和血膜洗去，用自来水反复冲洗,必要时再置95