分子生物学知识点归纳

--10-分子生物学DNA的一级构造：指DNADNADNADNA的三级构造：双链DNADNA的甲基化：DNA的一级构造中，有一些碱基可以通过加上一个甲基而被修饰，称为DNA的甲基化。甲基化修饰在原核生物DNA中多为对一些酶切位点的修饰，其作用是对DNADNA核生物DNA中，几乎全部的甲基化都发生于二核苷酸序列5’-CG-3’的C上，即5’-mCG-3’.CGDNA中大局部CGCGCG“CG”G+CCGDNADNADNA10对碱基，螺距为3.4nm.DNA2nm。每个碱基旋转角度为36DNADNA间的识别有关。疏水力和氢键维系DNA双螺旋构造的稳定。DNA双链构造的稳定横向依靠两条链互补碱基间的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性积存力维持。核小体的组成：染色质的根本组成单位被称为核小体，由DNA5H1,H2A,H2B,H3H4构成。各两分子的H2A,H2B,H3H4DNA这一核心上形成核小体的核心颗粒。核小体的核心颗粒之间再由DNA和组蛋白H1构成的连接区连接起来形成串珠样构造。顺反子Cistro：由构造基因转录生成的RNA序列亦称为顺反子。单顺反子monocistro因，即一个表达单位，转录物为一个单顺反子。从一条mRNA多顺反子(polycistron):原核生物具有操纵子构造，几个构造基因转录在一条mRNA链上，因而转录物为多顺反子。每个顺反子分别翻译出各自的蛋白质。原核生物mRNA原核生物mRNA往往是多顺反子的，即每分子mRNA带有几种蛋白质的遗传信息。mRNA5‘端无帽子构造，3‘端无多聚AmRNA12．真核生物mRNA〔1〕57－甲基鸟嘌呤－三磷酸鸟苷m7GpppN。〔2〕3‘端大多数带有多聚腺苷酸尾巴。分子中可能有修饰碱基，主要有甲基化。分子中有编码区和非编码区。14．tRNAtRNAtRNAtRNA5‘端总是磷酸化，5’末端核苷酸往往是pG.tRNA3‘端是CCA－OHtRNA〔DTtRNA的三级构造是倒LD环和T环在L15．rRNArRNA是细胞内含量最丰富的RNA，它们与核糖体蛋白共同构成核糖体，后者是蛋白质合成的场所。核糖体和rRNA一般都用沉降系数S70S，50S30S30S16SrRNA2150S23S5SrRNA3480S，由大小亚基组成。40S18SrRNA3060SrRNA5S、5.8S28SrRNA45核酶ribozym：某些RNA分子能催化自身或其他RNARNA3(1)异体催化的剪〔2〕〔3〕内含子的自我剪切型。核内不均一RN〔hnRN：真核生物转录生成的mRNA前体即为hnRN。这类mRNA前体必需经过一系列的加工处理才能变成成熟的mRN〔‘端加帽〔2〕3’端加尾〔3〕〔4〕分子内部的甲基化修饰核苷酸序列的编辑作用。miRNA:是一种单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNAmiRNA和细胞的功能特异性，也可能参与了简洁的基因调控，对组织的发育起重要作用。siRNA：小干扰RNA。是人工合成的短的双链RNA，它可抑制细胞内特定基因的表达，导致转录后基因失活。siRNARNAiRNAmRNARNARNARNARNAmRNAmRNARNA调控功能。顺式作用元件cis-actingelemen件,包括：启动子和上游启动子元件，增加子，反响元件，Poly(A)加尾信号。增加子enhance：是一段短的DNA序列，其中含有多个作用元件，可以特异性与转录因子结合，增加基因的转录活性。增加子可以位于基因的任何位置，增加子的功能与其位置和方向无关。基因：是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，是指贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。一个基因不仅仅包括编码蛋白质肽链或RNA5‘端上游的非3’端下游的非编码序列。基因组：泛指一个细胞或病毒的全部遗传信息。在真核生物体中单倍体DNA和线粒体DNA病毒基因组包括：单链正股RNA，单链负股RNA，双链RNA，双链DNA和单链正股DNA。SARS单链正股RNA逆转录病毒属于：单链正股RNA逆转录病毒基因组包括三个构造基因：gag、polenv核心蛋白、逆转录酶和膜蛋白。操纵子〔operon〕:是指数个功能上相关联的构造基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区〔包括启动子和操纵序列〕和下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA质粒：是存在于细菌染色体之外的、具有自主复制力气的环状双链DNA分子。质粒的不相容性：具有一样复制起始位点和安排区的两种质粒不能共存于一个宿主菌，这种现象称为质粒的不相容性。DNA分子内部或两个DNADNAMu。重复序列组成。而成，去除编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质这些基因称为断裂基因。snRNA:核内小RNA，分子中尿嘧啶含量最丰富。snRNA和核内蛋白质组成小分子核糖核蛋白体，作为RNA启动子：能够被RNA聚合酶识别并结合并起始转录的核苷酸序列。典型的启动子包括TATA，CAATGC反响元件：一些信息分子的受体被细胞外信息分子激活后，能与特异的DNA序列结合，调控基因的表达。这些特异的DNA序列实际上也是顺式元件，由于能介导基因对细胞外的某种信号产生反响，被称为反响元件。基因家族：指核苷酸序列或编码产物的构造具有确定程度同源性的一组基因。端粒DNATTAGG微卫星DNA(ACTG。卫星DNA：是消灭在非编码区的串联重复序列。其特点是具有固定的重复序列，该重复单位首尾相连形成重复序列片段，通常存在于间隔DNA和内含子中。卫星DNA可分为大DNA、小卫星DNADNA。DNA的末端都有一种特别的构造，端粒。该构造是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，仅在真核细胞染色体末端存在。端粒的功能主要有：保护线性DNAAluAlu300bp.属短散在核元件，为灵长类基因组所特有。假基因：是指与某些有功能的基因构造相像，但不能表达基因产物的基因。。遗传图指基因或DNA标记在染色体上以遗传距离表示的相对位置。物理图指基因或DNA标记间的实际距离。序列图指人类基因组的全部核苷酸序列，也是最详尽的物理图。转录图指基因图谱。端粒酶：由三局部组成，端粒RNA，端粒酶逆转录酶，端粒酶协同蛋白。端粒酶兼有提供RNA半保存复制：子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整的承受过来，另一股单链则完全重DNA都和亲代DNA半不连续复制：顺着解链方向生成的子链，复制是连续进展的，这股链称为领头链。另一股链由于复制方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，必需等模板链解开至足够长度，然后从5’-3’生成引物并复制子链。延长过程中，又要等待下一段有足够长度的模板再次生成引物而延长。这股不连续复制的链称为随从链。领头链连续复制而随从链不连续复制，这就是复制的半不连续复制。引物接着延长。复制中形成的不连续复制片断就是冈崎片段。DNADNA外作母链复制，内环不翻开一边滚动一边复制。最终，一个双链环就滚动复制成两个双链环。TTDNADNAXP蛋白。切除修复：DNADNA-polIdNTP聚合而填补，最终由DNAUvr真核生物需XP起的嘧啶二聚体分开，恢复原来的非聚合状态，称为光修复。DNA光修复、切除修复、重组修复和SOS。重组修复时，recA蛋白被激活，使得LexA突变的分子转变类型：〔1〕错配:DNA 框移突变是指三联体密码的阅读方式转变，造成蛋白质氨基酸排列挨次发生转变，其后果是翻译出的蛋白质可能完全不同。〔3〕重排：DNA转换和颠换种嘌呤。颠换是指由嘧啶变成嘌呤，或由嘌呤换为嘧啶。突变的意义：突变是进化、分化的分子根底。(2)只有基因型转变的突变。致死性的突变。突变是某些疾病的发病根底。D－环复制：是线粒体DNA的复制形式。复制时需合成引物。MtDNA为双链，第一个引物以内环为模板延长。至其次个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进展反向的延长，最终完成两个双链环状DNA逆转录酶有三种活性：RNA指导的DNA(2)DNA指导的DNA(3)RNAH〔RNaseH〕活性。RNA复制：是指某些病毒在宿主细胞中以自身RNA4dNTP5’-3’方向催化合成互补的RNARNARNA4dNTP5’-3’方向催化合成与RNADNA逆转录病毒复制过程：〔1〕逆转录酶以RNA为模板，催化dNTP聚合生成DNA互补链，产物是RNA/DNA链。〔2〕杂化双链中的RNA被逆转录酶中有RNA酶活性的组分如RNaseH利用单链DNA2DNAKlenowDNA3’-5’核酸外切酶活性。DNA－polIDNA：遵守严格的碱基配对规律。聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能。复制出错时有即时的较读功能。引发体：解螺旋酶，DnaC蛋白，引物酶和DNA起始复制区域组成。拓扑异构酶作用：I切断DNADNA口封闭，使DNAATP。拓扑酶II在无ATPDNA口使超螺旋松弛；在利用ATP功能的状况下，松弛状态的DNA又进入负超螺旋状态，断端在同一酶催化下连接恢复。复制和转录的异同：相像之处：都是酶促的核苷酸聚合反响。都以DNA都需依靠DNA聚合过程中都是核苷酸之间形成磷酸二酯键。都从5‘-3’方向延长聚核苷酸链。都遵从碱基配对规律。区分：模板。复制：两股链均复制。转录：不对称转录。原料。复制：dNTP。转录：NTP。酶。复制：DNARNA产物。复制：子代双链DNA〔半保存复制。转录：mRNA,rRNA,tRNA.碱基配对。复制：A-T，C-G。转录：A-U，G-C，T-A。.真核生物RNA聚合酶转录产物和对鹅膏蕈碱的反响。RNA-polI：转录产物：45S-rRNA对鹅膏蕈碱的反响：耐受。RNA-polII：转录产物：hnRNA对鹅膏蕈碱的反响:极敏感。RNA-polIII：转录产物：5S-RNA,tRNA，snRNA.对鹅膏蕈碱的反响：中度敏感。转录：以DNA一条链为模板，以四种NTP为原料，在DNA指导的聚合酶作用下，依据碱基互补原则〔 A-U,T-A,G-C〕合成RNA链的过程。不对称转录：转录时由于〔1〕DNA分子双链一股链用作模板指引转录，另一股链不转录。〔2〕模板链并非总是在同一条链上。故称为不对称转录。原核生物聚合酶组成：由四种亚基组成αββ‘σ五聚体的蛋白质。其中αββ’亚2 2基称为核心酶。σ因子识别起始点。α打算哪些基因被转录。β起催化作用。β’起结合DNA模板〔开链〕作用。74．操纵子：转录是不连续、分区段进展的。每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵RNA聚合酶结合模板DNADNA。RNA多聚核蛋白体。转录和翻译都在高效率的进展。转录空泡：由酶-DNA-RNA形成的转录复合物。依靠ρ因子的转录终止：ρ因子是由一样亚基组成的六聚体，它是原核生物转录终止因子。可结合转录产物RNA3‘CATPρ因子与转录产物RNA3‘端的多聚CρRNARNA旋酶活性使DNARNA非依靠ρ因子的转录终止：RNA茎－环构造。这种二级构造是阻挡RNARNA聚合酶的构象。由于酶构象的转变导致酶－模板结合方式的转变，可使酶不再向下游移动，于是转录停顿。其二，转录复合物〔酶－DNA-RNA〕RNA/DNA双链。RNA分子和DNA分子都要形成自己的双链，杂化链形成的时机不大，原来不稳定U是使RNA进因素，由于全部的碱基配对中以UATFIITFIID：TBP〔TATA〕结合TATATAF〔TBP〕关心TBP-DNATFIIA：稳定IID-DNATFIIB：促进RNA-polIITFIIF:解螺旋酶TFIIE：ATPaseTFIIH:蛋白激酶活性。转录起始前复合物PI形式与RNADNA真核生物mRNA转录终止及加尾修饰真核生物mRNA约百个或上千个核苷酸处常有一组共同的序列AATAAAGT这些序列称为转录终止的修饰点。转录越过修饰点后，mRNA在修饰点被切断，随即参与polyARNARNARNA外显子：在断裂基因及其初级转录产物上消灭，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子：隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。人类最浩大的一个基因是：抗肌萎缩蛋白基因。snRNPhnRNA体。剪接体是mRNA二次转酯反响。mRNA编辑：通过对mRNAmRNAtRNAtRNA前体的剪接。先由核酸内切酶进展催化进展剪切反响，再由连接酶将外显子连接起来。3‘端CCA-OH。化学修饰。包括：甲基化反响，使某些嘌呤变成甲基嘌呤。，使某些尿嘧啶复原成双氢尿嘧啶DHU。，尿嘧啶核苷转变为假尿嘧啶核苷〔Φ。，某些腺苷酸脱氨成为次黄嘌呤核苷酸rRNArRNA前体的剪接。45S-rRNA经剪接后，分出属于小亚基的18S－rRNA，余下的局部5.8S,28SrRNA。rRNA一起形成核蛋白体，输出胞浆。化学修饰.主要是甲基化反响。开放阅读框架OR：从mRNA‘端起始密码子AUG到序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放阅读框架。遗传密码的特点：连续性。编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读。简并性。除甲硫氨酸和色氨酸外，其他氨基酸都有2个或多个密码子为之编码，密码子中第三位碱基是可以不同的，这称为密码子的简并性。通用性。蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。摇摆性。反密码与密码之间不严格遵守常见的碱基配对规律，尤其是密码子的第三位碱基对反密码子的第一位碱基，即使不严格配对也能识别配对，这种现象称为摇摆配对。原核生物翻译起始复合物形成：IF-1,IF-3与小亚基结合，促进大小亚基分别。mRNAmRNA其一，在各种原核mRNA起始AUG8－134－9富含嘌呤碱基如AGGAGG，称为S-D16S－rRNA3‘端有一段富含嘧啶的段序列如UCCUCCS-D序列碱基配对使mRNAS-D序列又称核蛋白体结合位点RB，mRNA上紧接S-D序列后的小核苷酸序列可被核蛋白体小亚基蛋白rpS-1起始氨基酰－tRNAfMet-tRNAfMetGTP结合的IF-2i对应小亚基P位的mRNA起始密码AUG，起始时A位被IF-1酰－tRNA核蛋白体大亚基结合。上述结合mRNA、fMet-tRNAfMet的小亚基再与核蛋白体大亚iIF－2结合的GTP3IF体、mRNA、起始氨基酰－tRNA组成的翻译起始复合物。此时，结合起始密码AUGfMet-tRNAfMet占据P位，而A位空留，对应mRNAAUGi码，预备相应氨基酰－tRNA的进入。肽链的延长。进位。核糖体A位上mRNAtRNA进入核糖体A这一过程需延长因子EF－T延长因子有三种：EF-Tu.功能：帮助氨基酰－tRNAtRNAGTPEF-Tu-GTP-氨基酰-tRNA,将氨基酰-tRNAAEF-Ts.功能：促进EF-Tu-GTPEF-Tu-GTPEF-Tu-GDP，EF-TsEF-Tu-GDP再转变成EF-Tu-GTP，后者可被再利用。3．EF-G.功能：促进肽酰-tRNAmRNA-肽酰-tRNAA位移到PtRNA(2)成肽。在转肽酶的催化下，P位上的肽酰基与AA位进展，卸载的tRNAP〔3〕-tRNA连同mRNA从A位移到PtRNAEA终止因子：又称释放因子RF。其功能是识别mRNA并释放出肽链。原核生物中释放因子是RF-1,RF-2,RF-3.RF-1识别密码子UAAUAG，RF-2能识别UAAUGA。RF-3结合GTP，并能促进RF-1,RF-2结合。原核肽链终止过程：肽链延长到mRNA终止密码在核蛋白体A被任何氨基酰-tRNARF-1,RF-2进入ARF-1RF-2P位的tRNA再促使mRNA、卸载tRNARFRF-3GTPRF-1,RF-2能域和整体蛋白质的正确折叠。细胞中至少有两类分子伴侣家族：热休克蛋白和伴侣素。蛋白质合成后的加工：生肽链的折叠。一级构造的修饰N，个别氨基酸的修饰，多肽链的水解修饰。空间构造的修饰。包括：亚基聚合，辅基连接，疏水脂链的共价连接。97．起始因子:IF-1.能促进IF-2、IF-3IF-2.促进fMet-tRNAfMet30SGTPiIF-330SmRNA止大小亚基重聚合。98．信号假说机制：这一假说认为，分泌性蛋白初级产物的N-端有信号肽构造。在分泌性蛋白合成中，信酶切断，使成熟的蛋白质释放到细胞外。抗生素类作用位点：四环素类：作用于核蛋白体小亚基，抑制氨基酰-tRNA链霉素、卡那霉素：作用与核蛋白体小亚基，转变构象引起读码错误。氯霉素：作用与核蛋白体大亚基。抑制转肽酶，阻断延长。红霉素：作用与核蛋白体大亚基。抑制转肽酶，阻碍转位。放线菌酮：作用与真核核蛋白体大亚基。抑制转肽酶，阻断延长。-tRNA类似物，进位后引起未成熟肽链脱落。白喉毒素作用机制：可使真核生物延长因子eEF-2发生ADP干扰素作用机理：诱导特异蛋白激酶活化，该活化的激酶使真核主要的起始因子eIF2磷酸化失活，从而抑制病毒蛋白质的合成。干扰素与双链RNA共同活化5’A5’A可活化核酸内切酶RNaseL，后者使病毒mRNA管家基因：有些基因产物对生命全过程都是必不行少的。这类基因在一个生物个体的几乎全部细胞中持续表达，通常称为管家基因。管家基因的表达水平受环境因素影响很小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。这类基因表达称为根本〔或组成性〕基因表达。诱导：可诱导基因在确定环境中表达增加的过程称为诱导。阻遏：可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏。103．基因表达调控的生物学意义：适应环境、维持生长和增殖。维持个体发育与分化。104．原核生物转录的影响因素：启动子。启动子打算转录的效率和方向。σ因子。阻遏蛋白具有负调控作用。正调控蛋白促进基因的转录。倒位蛋白通过DNA重组倒位而调整基因表达。倒位蛋白是一种位点特异性的重组酶。RNARNA衰减子。衰减子〔attenuator〕:细菌中mRNA转录和翻译是偶联在一起的。这一特点使细菌中的一些操纵子的特别序列可以在转录过程中把握转录水平乳糖操纵子乳糖操纵子的构造：含有Z、Y、A三个构造基因，分别编码β－半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶。此外，含有一个操纵基因O，一个启动序列P，一个CAP结合位点和一个基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，与操纵基因O结合。启动序列P、操纵序列O和CAP组成乳糖操纵子的调控区。阻遏蛋白的负性调控作用：β－。真正的诱导剂是半乳糖而不是乳糖。乳糖可与阻遏蛋白结合，导致阻遏蛋白与操纵OO，发挥负性调控作用，基因不转录。CAPcAMPcAMPCAPCAP结合在CAP结合位点，刺激RNA当有葡萄糖存在及cAMPcAMPCAPlac表达下降。协调调整：当葡萄糖存在，乳糖存在时：尽管乳糖作为诱导剂和阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白与操纵序列O解离。但由于cAMPcAMPCAP状态。DNA结合。而且由于葡萄糖的存在，CAP当葡萄糖和乳糖都不存在时：CAP阻遏蛋白的负调控作用使基因仍处于关闭状态。当葡萄糖不存在，乳糖存在时：此时CAP可以发挥正性调控作用，阻遏蛋白由于诱导剂的存在而失去复调控作用，基因被翻开，启动转录。色氨酸操纵子调控机制：当细胞内色氨酸增多时，构造基因转录受到抑制。衰减子转录物有4段特别序12，23，341/22/33/4。片段3/4ρ因子的转录终止信号。当细胞内有色氨酸存在时，形成色氨酰－tRNA，核糖体编译可通过片段1并通2，核糖体在到达片段3之前就从mRNA1/22/3都不能形成发夹构造，只有片段3/4形成发夹构造，即形成转录终止信号，从而RNA当细胞内没有色氨酸存在时，色氨酰－tRNA1/22/33/4SDmRNA原核翻译水平的调控：SDmRNA翻译产物也可以对相应mRNA的翻译进展调控。小分子RNA可以抑制特定mRNA的翻译。110．真核生物基因表达在DNA水平的调控主要通过以下几种方式：染色质丧失。基因扩增。基因重排。DNA染色质构造可影响基因表达。111．反式作用因子：真核细胞内有大量的序列特异的DNA结合蛋白，其中一些蛋白的主要功能是使基因开放或关闭，称为反式作用因子。112．转录起始复合物形成的步骤：TFIID结合TATARNA－pol识别并结合TFIID－DNARNA－polDNA113．反式作用因子的特点：一般具有三个功能构造域：DNA构造域、转录活性域和结合其他蛋白的结合域。能识别并结合基因调控区中的顺式作用元件。对基因表达有正性和负性调控作用，即激活和阻遏基因的表达。DNA(Cys)和组氨酸(His)的区域，2Cys2His4Cys同源构造域：很多反式作用因子结合DNA的构造域中有一段一样的保守序列。是由60个左右的氨基酸组成的螺旋－回折－螺旋构造的区域，称为同源构造域。DNA3061α侧是排列成行的亮氨酸，具有疏水性，称为亮氨酸拉链区。两个亮氨酸拉链区的单体以疏水作用形成亮氨酸拉链。反式作用因子DNA结合域的构造模式：锌指构造。同源构造域。亮氨酸拉链。螺旋－环－螺旋构造。碱性α－螺旋。118．转录活化构造域构造模型：酸性α－螺旋构造域富含谷氨酰胺构造域富含脯氨酸构造域。119．mRNA外显子选择方式可保存或局部保存外显子。内含子选择方式可删除或局部删除内含子。互斥外显子是指两个外显子不能同时被保存。内部剪切位点造成内含子或外显子的局部序列被切除或保存。120．翻译起始的调控阻遏蛋白的调控作用。翻译起始因子的功能调控。〔3〕5‘AUG〔4〕mRNA121．翻译后水平的调控生肽链的水解。肽链中氨基酸的共价修饰。通过信号肽分拣、运输、定位。同源重组：是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列之间进展单链或双链片段的交换。又称根本重组。Holliday两个同源染色体DNA排列整齐一个DNA的一条链断裂，并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday(3)通过分支移动产生异源双链DNA。(4)Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组DNA。即片段重组体和拼接重组体。124．细菌的基因转移：细菌中，可以通过接合、转化、转导和细胞融合四种方式，在不同DNA分子间发生共价连接，即基因转移。125．接合作用：当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA可以从一个细胞〔细菌〕转移导另一个细胞〔细菌，这种类型的DNA转移称为接合作用。126．转化作用：通过自动猎取或人为的供给外源DNA，使细胞或培育的受体细胞获得的遗传表型，这就是转化作用。127．转导作用：当病毒从被感染的细胞〔供体〕释放出来，再次感染另一细胞〔受体〕时，发生在供体细胞和受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。自然界常见的例子就是噬菌体感染宿主时伴随发生的基因转移是溶菌生长途径，二是溶源菌生长途径。特异位点重组：由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点之间发生的整合称为位点特异的重组。重组DNA限制性核酸内切酶：识别特异序列，切割DNA。DNADNA聚合酶I5’-3’聚合，3’-5’5’-3’外切活性。用枯草杆菌蛋白酶可将DNA聚合酶IKlenow具有5’-3’聚合，3’-5’5’-3’外切活性。在cDNADNA补齐双链DNA3’端。33’端标记。4．逆转录酶。碱性磷酸酶。能去除末端磷酸基。末端转移酶。在3＇羟基末端进展同聚物加尾。多聚核苷酸激酶。催化多聚核苷酸5’羟基磷酸化，或标记探针。限制性核酸内切酶：就是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其四周切割双链DNA的一类内切酶。IIDNA，通常称这种特别构造挨次为回文构造。值：基因组的大小常以其DNADNA量称为C133．作为克隆载体的质粒应具备：分子量相对较小，能在细菌中稳定存在，有较高的拷贝数。具有一个以上的遗传标志。具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。134．常用作克隆的载体：质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、粘性质粒、病毒载体、酵母人工染色体和细菌人工染色体。DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体结合成一具有自我复制力气的DNA分子――复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进展扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。又称基因克隆。实现基因克隆所承受的方法及相关工作称为基因工程或重组DNA基因克隆的步骤：〔1〕目的基因的猎取。1．化学合成法。基因组DNAcDNAPCR。克隆载体的选择和构建。外源基因和载体的连接。1．粘性末端连接。平端连接。同聚物加尾连接。人工街头连接。重组DNA转化DNA型的过程。感染：λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA具有感染力气的病毒或噬菌体颗粒，然后才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。3．转染：转染是转化和感染两个词构成的词，指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得的遗传表型的过程。常用方法有：电穿孔法、磷酸钙共沉淀法和脂质体融入法等。重组体的筛选。1．遗传学方法免疫学方法核酸杂交法PCR酶切鉴定克隆基因的表达137．真核细胞转染的方法：〔1〕磷酸钙共沉淀法(2)电穿孔法DEAE－葡聚糖法脂质体介导基因转染显微注射法138．重组DNA疾病基因的觉察和克隆生物制药基因诊断基因治疗遗传病的预防139.细胞间信息物质〔第一信使胞间信息物质。包括：神经递质、内分泌激素、局部化学介质和气体信号。140．细胞内信息物质：在细胞内传递细胞调控信号的化学物质称为细胞内化学物质。141．其次信使：通常将Ca2+、cAMP、cGMP、DAG、IP3、Cer、花生四烯酸及其代谢产物这类在细胞内传递信息的小分子化合物称为其次信使。142．第三信使：负责细胞核内外信息传递的物质称为第三信使。是一类可与靶基因特异序列结合的核蛋白，能调整基因的转录，因此又称为DNA膜受体分为：环状受体、G蛋白偶联受体、单次跨膜α螺旋受体和具有鸟苷酸环化酶活性的受体。胞内受体包括四个区域：高度可变区、DNA结合区、铰链区和激素结合区。受体与配体结合的特点：高度专一性、高度亲和力、可饱和性、可逆性和特定的作用模式。膜受体介导的信息转导途径(1)cAMP－蛋白激酶途径。cAMP的生成与降解。一些激素如肾上腺素、胰高血糖素等作用于相应的受体后，活化相Gs的GDPGTPGsα亚基与βγαs－GTP，αs－GTP可导致AC活化，使得ATP转变为cAMP，细胞内cAMPcAMPACcAMPcAMP对细胞的调整作用是通过激活cAMP的。PKA〔C2R2〕CR亚基上有两个cAMP/苏氨酸残基磷酸化的功能。调整亚基与催化亚基结合时，PKA4cAMP合后，调整亚基脱落，游离的催化亚基具有蛋白激酶活性。PKAPKAcAMPATP/苏氨酸残基磷酸化，从而调整细胞的物质代谢和基因表达。对代谢的调整作用：肾上腺素调整糖原分解的级联反响。肾上腺素与质膜上的受体结合后，通过感动型GACACATPcAMP。后者进一步激活PKA，PKA无活性的磷酸化酶激酶bbb活性的磷酸化酶a.磷酸化酶ab。磷PKAPKA也使有活性的糖原合酶的特定丝/苏氨酸残基磷酸化转变成无活性。:在基因的转录调控区有一类cAMP应答元件CRE，它可与cAMP应大元件结合蛋白〔CREB〕相互作用而调整此基因的转录。当PKA的催化亚基进入细胞核后，可催化反式作用因子－CREB/CREB与DNA上的CRE结合，从而激活受CRECa2+-依靠性蛋白激酶途径1．Ca2+-磷脂依靠性蛋白激酶途径IP3和DAG的生物合成和功能：去甲肾上腺素等激素作用于靶细胞膜上相应的受体后，通过GpPI-PLC，后者可水解PIP2而生成DAGIP3。DAG丝氨酸和Ca2+的协作下激活PKC。IP3生成后，从膜中集中到胞浆中与内质网和肌浆网上的受体结合，促进这些钙储存库内Ca2+的释放，Ca2+能与胞浆内的PKCDAGPKCPKC的生理功能：对代谢的调整作用和对基因表达的调整作用。2．Ca2+-钙调蛋白依靠性途径CaM4Ca2+结合位点，这些位点被占满后其构象发生转变。当胞浆内Ca2+10-2mmol/LCa2+CaMCa2+－CaM酸化很多蛋白质的丝/Ca2+－CaM既可以激活腺苷酸环化酶又可cAMP的生成又加速cAMP快速消逝。Ca2+－CaMcGMP-蛋白激酶系统cGMPGTP〔ANP〕与靶GTP转变为cGMcGMP能激活cGMP依靠性蛋白激酶〔PK生生物学效应，即松弛血管平滑肌和增加尿钠，还可以降低血压。酪氨酸蛋白激酶体系1．受体型TPK-Ras-MAPK途径：受体与配体结合后，发生自身磷酸化和磷酸化GRB2和SOS。磷酸化的受体与GRB2－SOSRasRas蛋白又称小GG蛋白中的Gα亚基，它的活性和其结合GTPGDPRasGDPGTP结合而活化。活化的RasRafRaf/苏氨酸蛋白激酶活性，它可进一步激活有丝分裂原激活蛋白激酶〔MAPK〕系统。MAPK系统包括MAPK、MAPKK、MAPKKK，MAPK更具广泛的催化活性，它既能催化丝/苏氨酸残基又能催化酪氨酸残基磷酸化，故是具双重催化活性的蛋白激酶。MAPK除调整花生四烯酸代谢和细胞微管形成外，更重要的是可催化细胞核内很多反式作用因子的丝/苏氨酸残基磷酸化，导致基因转录或关闭。受体型TPK活化后还可通过激活AC，多种磷脂酶等发挥调控基因的作用。2．JAKs-STAT一局部生长因子和大局部细胞因子可借助细胞内非受体型酪氨酸蛋白激酶JAKs完成信息传导。JAKsSTAT核因子κB传递。TGF-β途径调整增殖、分化、迁移和凋亡等多种细胞反响。147.双脱氧链终止法测序的根本原理：和模版互补结合的引物在DNA〔通常是DNAI的大片段KlenowT7DNA酶〕作用下发生互补链的延长反响，反响体系中的2’-3’-双脱氧链核苷三磷酸(ddNTP)与底物脱氧核苷三磷酸(dNTPA、G、T、C位置的不同大小的DNA20－500碱基的DNADNA化学裂解法测序原理：承受化学试剂处理末端放射性标记的DNA具不同长度的DNADNA大片段DNA序列测定的策略：随机法、嵌套缺失法、引物延长法。核酸分子杂交：是指具有互补序列的两条核酸单链在确定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。151．核酸分子杂交的原理：具有互补序列的两条单链核酸分子在确定条件下〔适宜的温度及离子强度〕核酸序列。在杂交体系中的核酸序列称作探针，探针通常用于进展核素或非核素标记。15DNA变性：在物理或化学因素作用下DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中全部的共价键不受影响，称为DNA153．导致DNA153.Tm值：双链DNA变性一半所需要的温度称作DNA的溶解温度。154．复性：两条互补的单链DNA分子在变性条件除去后能重按碱基互补配对原则以氢键相连形成双链DNADNA155．影响杂交的因素：核酸分子的浓度和长度温度离子强度杂交液中的甲酰胺核酸分子的简洁性非特异性杂交反响FISH(荧光原位杂交)：是一种非放射性原位杂交方法，用特别荧光标记核酸探针，可在染色体、细胞和组织切片上进展DNA杂交，能够格外有效地检测细胞内是否存在特定的DNARNASouthernBlotting步骤：1．待测核酸样品的制备。包括制备待测DNADNA待测DNA凝胶中核酸的变性。Southern毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法。探针的制备Southern7．杂交结果的检测。158：预杂交：能够结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进展杂交前必需将膜上全部能与DNA159．SouthernBlotting：是指DNADNADNA与确定的固相支持物上，然后用标记的DNA探针检测待测DNA的一种方法。160．NorthernBlottingRNA进展固－液相杂交，检测RNA〔主要是mRNA〕的方法。161．斑点印迹：将RNADNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜上或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量争论，称为斑点印迹〔DotBlot〕.原位杂交：核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进展杂交，称为原位杂交。原位杂交的步骤：组织或细胞的固定组织细胞杂交前的预处理。一般用去垢剂〔TritonX－100、SDS〕或蛋白酶消化。探针的选择和标记杂交杂交结果检测液相杂交：是指待测核酸分子与核酸探针都存在与杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子，常用的液相杂交有RNA酶保护分析法、核酸酶S1保护分析法。RNARnaseARnaseT1能专一性降解单链RNA而双链RNA到保护的特点，用放射性标记的RNA探针与待检mRNA进展液相杂交，使互补序列RNA探针和待测RNA形成杂交体。此法用于mRNAmRNA位置等。RPA制备待测RNARNA杂交除去单链RNA电泳分析探针的种类：cDNA探针、基因组DNARNA标记物：核素标记物：32P、35S32P最常用。非核素标记物：半抗原、配体、荧光素、化学发光探针。168．标记方法：缺口平移法、随机引物法、PCR法、末端标记法探针的纯化方法：乙醇沉淀法、SephadexG-50、微柱离心法DNaseI在DNA53’端，3’端即可作为引物，在DNAI的5’-3’DNADNAdNTP3’端，合成DNADNA聚合酶I5’-3’核酸外切酶活性在切口处将旧链从5’合成链不断延长，从而使原DNA分子上的局部核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。171．随机引物法原理：随机引物是人工合成的长度为6个核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的DNA六核苷酸排列的多种可能性而设计的DNADNADNA物为引物，以变性后的单链DNA为模版，在Klenow酶的催化下，以四种dNTP〔其中一种为标记物标记的DNA〕为底物，合成与探针互补的且带有标记物的DNAPCRPCR是一种体外扩增DNADNA列依据碱基互补配对原则形成局部双链TaqDNADNA25－30PCRPCRTaqDNA4种dNTP、适宜的缓冲液体系、模板DNA。引物设计的原则：15－30两个引物之间不应当存在互补序列引物本身不应存在互补序列引物与非特异性扩增区序列的同源性不应超过7038个碱基在待扩增区外不应有互补序列5’103’端不应有连续3GC。引物的3’端确定要与模版配对。PCR到达平台期所需PCR循环次数取决于：样品模版的拷贝数、PCR的扩增效率以及DNA聚合酶的种类和活性，以及非特异性产物的竞争25次以上的循环。PCR隔离不同操作区，包括样品制备区、PCR操作区和反响产物分析区严格试验操作设立试验比照：阳性比照、阴性比照、试剂比照筑巢PCR：先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用一对内侧引物以大片段为模板扩增猎取目的基因。筑巢PCRPCR多重PCR：DNA样品中不同序列的PCRDNA否存在某些基因片段的缺失或突变。PCR3DNAPCRPCR定同一种属细菌的不同种类。原位PCR:以组织固定处理细胞内的DNARNA为靶序列，进展PCRPCR。原位PCRDNARNA。原位PCR胞定位、组织分布和靶基因表达检测的重要手段。RT－PCRRNAPCRRNA，在反转录酶作用下合成cDNAcDNA为模版通过PCRRT-PCR目前从组织或细胞中获得目的基因以及对序列的RNA进展定性定量分析的最有效方法之一。PCR〔RealtimePCR〕:RealtimePCR得在PCR反响中产生的荧光信号与PCRPCRDNA5’端有一个荧光报告分子，3’端有一个荧光淬灭分子。没有扩增反响时，探针保持完整，无荧光信号释放。随着PCR的进展，TaqDNA5’-3’外切核酸酶就会将该探针逐步切断，报告荧光基团一旦与淬灭基团分别，便产生荧光信号。后者被荧光检测系统接收，用于数据分析。基因组DNA基因组DNA是指包含某一个生物细胞全部基因组DNADNA形式贮存着某一生物的全部基因组DNA基因组DNADNA大小的DNADNA片段的噬菌体，这就是基因组DNAcDNAcDNA文库是包含某一组织细胞在确定条件下所表达的全部mRNAcDNA列的克隆群体，它以cDNAcDNAmRNA经过反转录合成从cDNA，后者被克隆进入质粒或噬菌体载体，转化宿主细胞后可获得克隆群体。动物。导入基因的主要方式：显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法。基因打靶的必备条件：胚胎干细胞、打靶载体打靶载体的筛选标志：neo〔霉素〕阳性筛选标志；HSV-tk阴性筛选标志。基因敲除的根本程序：打靶载体的构建打靶载体导入ES基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种189．构建打靶载体的根本过程获得目的基因的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中从重组质粒中切除目的基因的大局部同源DNA序列，只留局部序列在线性质粒载体的两端将neo基因克隆到带有目的基因同源挨次的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源挨次的中间在目的基因同源挨次的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中DNA芯片技术：是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量DNA探针以显析，即可得出样品的遗传信息〔基因序列及表达的信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNADNA原位合成芯片DNA原位合成芯片：承受显微光蚀刻等技术在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片称为原位合成芯片。DNA微集阵列：将预先制备的