支原体双相培养法在泌尿生殖道分泌物检测的临床应用及评价

支原体双相培养法在泌尿生殖道分泌物检测的临床应用及评价

Summary：目的：通过支原体双相培养即固体和液体同时接种样本培养的方法，探讨其用于诊断Uu和Mh感染的临床运用价值，为后续临床应用提供依据。方法：对760例随机泌尿生殖道分泌物样本同时接种支原体固体和液体培养基，对相关实验数据进行统计分析，并对临床应用效果进行评价。结果：760例样本共分离出Uu285例阳性率37.5%，Mh97例阳性率12.8%，其中Uu+Mh有26例，总体阳性率为50.3%。其中有13例液体培养阳性样本，固体培养基未生长，经过液体转种固体培养基，均未观察到菌落。结论：采用固体和液体结合培养的方式虽然提高了检验成本，但固体培养降低了液体培养的假阳性，而液体培养提供固体培养不能提供的药物敏感性，双相培养法对泌尿生殖道支原体感染的检测具有更高的敏感性和特异性，支原体双相培养法可以在临床推广应用。Keys：解脲脲原体；人型支原体；双相培养；临床应用通讯作者：郭怀英单位：西南医科大学附属中医医院检验科支原体（mycoplasma）是细胞外生存的最小微生物，是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.2-0.3μm之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状，分枝状等多种态。支原体主要包括支原体属和脲原体属，其中解脲脲原体（Ureaplasmaurealyticum，Uu）和人型支原体（mycoplasmahomins，MH）是泌尿生殖道非淋菌性炎症中的最常见的病原体，与慢性前列腺炎、宫颈炎、阴道炎有着密切关系，是导致男女不孕不育的重要原因之一[1]。因此，准确检测Uu和Mh对临床诊断和治疗具有重要的指导意义。分离培养出病原体是诊断临床病原体感染的“金标准”。目前临床实验室对Uu和Mh的分离培养，主要采用Uu和（或）Mh液体培养基，经24-48h培养后通过液体变色来判断。实际上，采用这种液体培养方法不能真正地分离培养出支原体，而只是通过添加不同底物进行生化反应而间接判断结果，有假阳性结果，且存在较为严重的污染问题[1-2]。此外，支原体荧光定量PCR法检测临床生殖道样本中支原体具有快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好的优点，但受实验条件限制，影响其在实验室中开展[3]。Shepard等学者认为，固体培养法是诊断标本中有无支原体存在的最佳方法，尤其是固体培养基可以在低倍显微镜下直接观察到支原体特有的典型“油煎蛋”样菌落，是诊断支原体的可靠依据[4-6]。本报告旨在对分离解脲脲原体和人型支原体选择性固体培养和液体培养相结合的方法进行临床评价。1、材料与方法1.1试剂Uu和Mh液体选择分离培养基和固体选择分离培养基均由众爱生河北生物科技有限公司提供。1.2仪器二氧化碳培养箱（Thermo371，美国）、100μl定量移液器（Finnpipette，芬兰）、显微镜（Olympus日本）。1.3临床标本所有患者于2020年1月1日至2021年6月30日来本院妇科、泌尿外科和皮肤科门诊就诊的支原体感染疑似患者，标本含尿液、尿道或宫颈分泌物、精液、前列腺液等，共760例，其中男性126例，女性634例，年龄最小16岁，最大71岁，均由医生按试剂说明书要求用无菌拭子采集并立即送检。1.4方法1.4.1标本采集男性：清洁尿道口用无菌拭子取尿道口2.0-2.5cm分泌物或取尿沉渣（中段尿10-20ml，2000r/min离心10min）。

女性：取宫颈口内1-2cm处分泌物，取样前先用另一棉拭子拭净宫颈口外的分泌物，采样时拭子转动30s，取出时拭子不可碰到阴道壁，取样后立即送检。1.4.2标本接种取出试剂盒复温至室温并编号，先从未接种样本的培养瓶中取100μl的培养基液加入药敏板阴性对照孔。将采集标本拭子头放在固体选择分离培养基表面滚动划线接种后，再将拭子头插入液体培养基液中，充分洗涤，在瓶壁上挤干拭子，定量移液器分别取100μl已接种的培养基液体标本加在除阴性孔以外的各孔中。1.4.3培养固体选择分离培养基每组套内加一片CO2发生片（厂家配套），盖上盖。液体培养板每孔滴加1-2滴石蜡油，盖上盖。将剩下的培养基和药敏板以及固体培养基放在35℃、5%CO2培养箱中培养，24h、48h和72h分别观察结果。1.5结果观察1.5.1液体培养基观察阴性对照孔：培养后应为阴性，仍显清亮黄色液体，只有阴性对照孔为阴性时，其他反应结果才有意义,阳性对照孔：由黄色变成红色，且无混浊为阳性，显示有支原体生长。未由黄色变成红色，且无混浊为阴性，显示无支原体生长。如出现混浊则视为污染，结果无意义。观察时间：在培养24-48-72h后每天上午、下午各观察一次。结果判断：Uu≥104孔为Uu鉴定孔，Mh≥104孔为Mh鉴定孔。当阳性对照孔为阳性，Uu鉴定孔为阳性（培养24h，培养基由黄变红、清亮无混浊），表示Uu计数（ccu≥104），有临床意义，见图1（左）。当阳性对照孔为阳性，Mh鉴定孔为阳性（培养48h，培养基由黄变红、清亮无混浊），表示Mh支原体计数（ccu≥104），有临床意义，见图3（左）。当阳性对照孔为阳性，Uu鉴定孔和鉴定孔同时为阳性时，显示Uu、Mh混合感染，见图2（左）1.5.2固体培养基显微镜观察：在培养24-48-72h后每天上午、下午各一次将固体培养基放在显微镜下（10×10）仔细观察，找到典型Uu和或Mh菌落时可确认为阳性。若液体培养液变红，而固体培养基上无菌落，则从变色的液体培养液中吸取20μl，滴种在固体培养基上继续培养，下一次继续观察有无菌落生长。阳性结果包括Uu、Mh、Uu+Mh单纯或混合感染。2、结果2.1液体法和固体法生殖道支原体分离培养结果760例可疑标本中检出Uu285例；Mh97例；其中Uu+Mh26例；全阴性378例（表1）。大约85%的支原体在24h内可以观察到菌落，48h内固体和液体培养的阳性率几乎没有差别。表1760例标本生殖道支原体分离培养结果液体培养基固体培养基结果

例数结果

例数

变红无浑浊（Uu）孔295Uu生长282变红无浑浊（Mh）孔97Mh生长97变红有浑浊(Uu+Mh)孔3Uu生长3未变红365未生长378合计7607602.2Uu和Mh在固体和液体培养阳性结果菌落特点：Uu菌落在镜下呈棕褐色颗粒、棕褐色菌线或棕褐色团块样菌落（20-60μm），见图1（右）；Mh菌落在镜下典型的“油煎蛋”样菌落（100-300μm），中间较厚，有宽大的外围，见图3（右）；二者菌落相比，Mh比Uu大数倍。液体培养基阳性对照孔变红、Uu≥104孔变红，图1（左）,固体培养基镜下见Uu棕褐色菌落（箭头所示），图1（右），提示Uu感染；液体培养基阳性对照孔变红、Uu≥104孔和Mh≥104孔变红，图2（左），固体培养基镜下见Uu棕褐色菌落（箭头所示）和Mh油煎蛋样菌落（箭头所示），图2（右），提示Uu、Mh混合感染；液体培养基阳性对照孔变红、Mh≥104孔变红，图3（左），固体培养基镜下见油煎蛋样菌落（箭头所示），图3（右），提示Mh感染；液体培养基阳性孔变红且浑浊，Uu≥104孔变红且浑浊，固体培养基镜下观察到Uu菌落，见图4（左）提示有Uu和其他污染菌感染；液体培养基阴、阳性对照孔未变或变红，Uu≥104孔变红，图4（右），固体培养基镜下未见Uu菌落，提示Uu假阳性。图1为Uu阳性，镜下见Uu棕褐色菌落（箭头所示）图2为Uu+Mh阳性，镜下见Uu和Mh菌落（箭头所示）图3为Mh阳性,镜下见典型“油煎蛋”菌落（箭头所示）图4左为Uu假阴性，镜下见Uu菌落；图4右为Uu假阳性，镜下未见菌落3.分析讨论目前国内临床实验室对泌尿生殖道支原体检测，除少数科研院校及大医院是采用液体增菌加固体分离外，绝大部分医疗单位都是采用单纯液体变色法检测支原体。支原体在液体中生长有其不同于细菌的特点，因其个体微小，在增殖过程中不导致液体浑浊或生成沉淀，Uu分解尿素Mh分解精氨酸均生成胺，使液体培养基变碱，指示剂酚红在培养基中颜色由黄变红，所以临床上常将液体培养基在培养48h内变红且澄清者判定为支原体生长阳性。液体变色法操作简便，对仪器设备没有特殊要求，所以广受欢迎，多年来一直占据着支原体检测的主导地位[7-8]。支原体液体培养基在培养过程中颜色变红，仅是一种生化反应，这种生化反应并非支原体所特有，一旦标本中混有其它能分解尿素或精氨酸产氨的微生物存在，又未能被培养基中抑菌剂所抑制，这些非目的菌就生长并使培养基变混，即使有支原体生长，培养基变红，按照阳性判断标准，也会误断为阴性。本次评价了760例标本中固体培养检出Uu282例、Mh97例、其中Uu+Mh22例，Uu和Mh阳性率50.3%；而液体培养检出Uu295例、Mh97例、其中Uu+Mh22例，Uu和Mh阳性率为51.6%；在液体培养变红13例中，经过从变色的液体培养液中吸取20μl，滴种在固体培养基上继续培养后，均未找到典型菌落，说明液体培养存在假阳性；而有3例液体培养阳性对照和Uu和Mh对照孔变红且混浊，按照液体培养标准应判断为阴性，但却在固体培养基上找到了Uu菌落，说明液体培养也存在假阴性。3.1固体培养的优点：固体培养具有液体培养无可取代的优势，其一是Uu和Mh菌落可在48h内长出，菌落形态典型，不会出现假阳性或假阴性结果；其二是固体培养基污染少，即便有轻度污染也不会影响支原体生长和观察；其三可以在固体培养基上同时鉴别多种支原体；其四标本直接滚动涂划在琼脂表面，操作简便，镜下观察背景更清晰，利用划痕很快找到琼脂层面并在划痕附近找到支原体菌落。3.2结果可靠：液体培养观察鉴定和药敏试验结果，再结合固体培养基在镜下仔细观察典型的Uu和Mh菌落形态，准确性更高、24-48h出结果更快速，特异性好和选择性强，杜绝了单独使用液体培养所造成的假阴性和假阳性。3.3操作简便：不需要特殊仪器。试剂盒提供的CO2发生片给没有CO2培养箱的基层医院提供了便利，可以在基层医院推广应用。所以支原体双相培养结合固体培养基上的典型菌落和液体培养的药敏报告，为临床医生合理用药提供有力的依据。4.Reference[1]汪洪,章杰,吴有才,王涤宇,陈圣军.2009—2015年女性泌尿生殖道解脲支原体药敏趋势分析[J].安徽医药,2018,22(04):765-768.[2]邝兆威,陈艳清,贾建,符宏建.固体培养法和液体培养法检测在支原体感染诊断中效果分析[J].中国实用医药,2018,13(16):194-195.DOI:10.14163/ki.11-5547/r.2018.16.114.[3]倪红霞,刘志辉,郑学星,等.TaqMan探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用[J].吉林大学学报：医学版,2010,36:797-802.[4]EkielA,PietrzakB,Wiechu00aB,etal.Urogenitalmycoplasmasandhumanpapillomavirusinhemodialysedwomen.[J].Thescientificworldjournal,2013,(11):378-387.[5]GdouraR,KchaouW,ChaariC,etal.Ureaplasmaurealyticum,Ureaplasmaparvum,MycoplasmahominisandMycoplasmagenitaliuminfectionsandsemenqualityofinfertilemen[J].BmcInfectiousDiseases,2007,7(17):1-9.[6]Shepard,M.C.,LuncefordC.D.Ureasecolortestmedi