线粒体基因组结构与疾病

线粒体基因组结构与疾病第1页/共66页绪论线粒体的功能：真核细胞的重要细胞器，能量转换系统或细胞动力站线粒体的发现及其研究：第2页/共66页1894年，Altmann用显微镜观察到动物细胞中存在颗粒状，杆状结构，命名为生命小体，认为系细菌共生于细胞内产生（内共生假说）1897年，Benda将其命名为线粒体（mitochondrion）1900年，Michacles用JanusgreenB染色细胞，发现Mt可借氧化还原反应使染料变色，提出Mt是细胞氧化的场所。第3页/共66页1946年Claude用差速离心法获得线粒体组分。1950年，Schneider和Hogeboom用蔗糖密度梯度离心法分离得到Mt细胞器。第4页/共66页1952年，Palad和Sjostrand用电镜观察到Mt超微结构。1948年Green证明了Mt含有全部三羧循环的酶。1949年，Kennedy和Lehninger发现脂肪酸的氧化在线粒体进行。第5页/共66页1965年，Racher证实线粒体内膜突出的球形颗粒为ATP合酶。1976年，Hatcfi纯化了呼吸链四个独立的复合体，明确了Mt内膜的酶系组成。第6页/共66页1980年，Mitchell提出了氧化磷酸化偶联的化学渗透学说（chemiosmotictheory）。1963年，Nass观察到线粒体内存在DNA分子，随后发现线粒体具备自主遗传信息传递的酶类，如DNA聚合酶、RNA聚合酶、核蛋白酶、氨基酸活化酶等。第7页/共66页1981年，Anderson完成了人类线粒体基因组全部序列的测定。1986年，Chomyn等明确了mtDNA编码的所有基因及其定位。第8页/共66页1988年，Holt发表文章证实mtDNA缺失与线粒体肌病的关系；Wallace发表文章证实mtDNA错义突变与Leber´s母系遗传性视神经病变（LHON）的关系。由此提出了“线粒体DNA病”（mitochondrialDNAdiseases)的概念。研究发现mtDNA异常与许多重大疾病相关，比如心脏病、糖尿病、早老性痴呆（Alzheimer´sDiseases）、帕金森氏病（Parkinson´sDiseases）和衰老（ageing）。第9页/共66页§1Mt的形态结构一、形态、数目和分布

形态：多种多样，常见线状、颗粒状。数目：每个细胞内含Mt数目差异很大，需能多的细胞数目多。分布：位于需能较多的部位第10页/共66页二、结构

Mt的电子显微镜超微结构（seenextpage）内膜外膜嵴和基粒基质：各种生物氧化的酶，mtDNA和其他信息分子第11页/共66页第12页/共66页三、再生和起源1.再生：重新合成

起源于非Mt结构现存线粒体的分裂：同位素Mt膜标记实验证实该学说。2.起源：

内共生假说及存在问题分化假说及存在问题第13页/共66页§2Mit基因组结构与遗传信息传递1963、64年发现mtDNA1981年，人、小鼠mtDNA全序列测定1989年，大鼠mtDNA全序列测定研究DNA结构及信息传递的良好模型——MW小，较易纯化第14页/共66页一、mtDNA基因组结构

裸露的闭合环状DNA分子，占细胞总DNA的1%人全长16569bp（14-18kb）

不与组蛋白结合，不含内含子

由重链（H）和轻链（L）二链组成，H富含嘌呤，L富含嘧啶，密度离心分为两条带而得名第15页/共66页编码37个基因：22个tRNA编码基因2个rRNA编码基因13个多肽基因：复合体I（NADH-CoQ氧化还原酶，ND）中7个基因，ND1，2，3，4，4L,5，6复合体IV（cyt氧化酶，CO）CO-I，II，III三个基因复合体III中的一个亚基cytb复合体V中Fo二个亚基ATPase6，ATPase8第16页/共66页第17页/共66页二、mtDNA复制

半保留方式——同核基因组，但不局限在S期只有一个复制起始点——和原核生物一致（质粒一个复制起始点，但为双向复制）OH——位于D环区（12点至1点之间），顺时针复制，循环一周，DNA聚合酶为核基因编码OL——位于9点，当H链复制到此处时，开始复制，逆时循环一周第18页/共66页

复制结束形成2条H2条L相同链的拆离，H、L链的配对2分子mtDNA

复制时间：2小时

第19页/共66页第20页/共66页三、mtDNA转录

只有一个共同的启动子，位于D环区——与核基因不同HSP和LSP分别启动各自链的转录

HSP1——生成两个rRNA，tRNAphe、tRNAvalHSP2——生成其他tRNA和mRNA第21页/共66页第22页/共66页

转录含有一条DNA链的全长拷贝转录生成后在限制性内切酶作用下，裂解成rRNA、tRNA和mRNA，不含信息的其余90%很快被分解。

转录后加工：

tRNA-CCA尾；mRNA-polyA尾mRNA5’端无帽子结构基因无内含子，mRNA不需剪接（低等酵母有内含子)第23页/共66页

线粒体转录因子（mTF1）：增强RNA聚合酶对启动区域序列的辨认。线粒体转录终止因子（mTERF）：结合在16srRNA基因和tRNAleu基因之间，阻断HSP1启动的转录，而对HSP2无效。第24页/共66页四、mt蛋白质合成

所有RNA，均由mtDNA编码，无RNA输入Pr合成在mt独有的55s核糖体上进行，并形成多聚体28s39s12s16srRNA第25页/共66页

mt遗传密码表与通用密码表不同——见书表22种tRNA（细胞质中存在32种），反密码子与密码子配对不严格

Pr合成体系与原核细菌相似：由N-甲酰蛋氨酸tRNA起始放线菌酮——抑制胞质蛋白合成，不抑制mt和细菌氯霉素——抑制细菌和mt蛋白合成，不抑制胞质蛋白合成转录、翻译紧密连接：多聚核糖体与DNA相连（二者均在mt基质内，无核结构分隔）第26页/共66页五、mt的半自主性

半自主性：只能合成自身需求的蛋白质等物质的一部分多数由核基因编码，在胞质合成然后转入MtMt复制、转录、翻译对核基因有一定的依赖性，受到核基因的控制。

第27页/共66页第28页/共66页细胞质中蛋白质输入线粒体组成mt蛋白质来源小部分由mtDNA编码大部分由核DNA编码，合成之后输入mt由核基因编码的mt蛋白质见下表-第29页/共66页第30页/共66页蛋白质输入线粒体过程中需要的重要成分蛋白质前体（precursor）分子中的导肽（presequences）通常位于前体分子的N末端，约20到80氨基酸。导肽分子内含有靶向信号（targetingsignal）负责靶向和辨认线粒体膜受体；有的导肽分子中在靶向信号下游尚含定位信号（localizationsignal），决定蛋白质分子在线粒体中的具体定位，如内膜、膜间腔等）第31页/共66页导肽的氨基酸组成：富含带正电荷的碱性氨基酸，有助于于和mt表面受体结合并进入带负电荷的mt基质富含羟基氨基酸，如丝氨酸缺乏或少见酸性氨基酸此种氨基酸组成有利于形成双亲性的螺旋结构，有利于穿过mt外膜脂质双分子层第32页/共66页少数多肽没有可切除导肽：如ADP/ATPcarrier（AAC），其定位信号位于三个同源片段的C末端，将其定位于内膜；外膜孔蛋白没有可切除导肽，但在N端有定位信号；位于膜间隙的cytC没有导肽，尚不清楚其定位信号。第33页/共66页受体蛋白前体输入mt，首先与mt外膜表面的受体相结合受体类型：MOM19和MOM72（moitochondrialoutermembrane，MOM）从粗糙脉孢菌（neurosporecrassa）中分离出来

第34页/共66页MOM19能与大多数具有导肽的前体蛋白识别与结合，是主要的受体蛋白质，用抗MOM19抗体阻断MOM19，线粒体四个亚区（外膜、膜间隙、内膜和基质）的蛋白输入均受抑制。MOM19均匀分布在整个mt外膜表面MOM72定位与MOM19相似，位于外膜，N-末端疏水序列锚定于外膜，其余部分亲水片段游离于胞液中。MOM72能与不含可切除导肽的蛋白质分子特异性结合。第35页/共66页MAS20和MAS70（mitochondrialassembly，MAS）从酵母中分离得到，其结构和功能与MOM19和MOM72相同。受体间可形成复合体：如MAS37-MAS70亚复合体

MAS20-MAS22亚复合体两种亚复合体可形成四聚体复合体，与前体分子的不同区域结合。第36页/共66页共同输入通道（commonimportsite，channel，poreorgeneralinsertionprotein，GIP）与受体结合的前体蛋白最终经共同输入通道进入mt，MOM38（酵母ISP42）是外膜输入通道蛋白质广义的受体复合物包括受体蛋白和GIP，或称receptor-GIP复合体第37页/共66页转位接触点（translocationcontactsite，membraneadhesionsite）当蛋白质前体进入mt时，从mt外膜、内膜之间接触点插入，外膜受体和输入通道位于或接近于接触点处。第38页/共66页内膜蛋白质输入装置主要由MIM17，23和44构成MIM17，23形成通道MIM44（酵母ISP45）和mit-Hsp70合作起转位作用将蛋白质推进至基质

前体蛋白质进入内膜需要ATP和膜电位ψ

第39页/共66页分子伴侣（molecularchaperones）分子伴侣介导多肽链形成正确的组装和空间构象，但它们本身并不参与最终构象的组成。分子伴侣大多数是热休克蛋白（heatshockprotein，HSP）第40页/共66页mt蛋白质输入过程中分子伴侣起重要作用：导肽转位；蛋白质前体胞液片段解折叠；蛋白前体跨膜运动；新输入的蛋白质在mt基质中重新折叠成自然构象。

参与mt蛋白质输送过程的HSP主要是ct-HSP70和mt-HSP70。ct-HSP70具有解折叠酶活性，防止新生肽链的结合，聚积；mt-HSP70在肽链未进入mt基质前维持蛋白质的解折叠状态，推进多肽链进入基质；进入基质后，mt-HSP70具有使多肽链重新折叠成正确构象的作用。第41页/共66页第42页/共66页新输入的蛋白质加工过程mt基质加工肽酶（matrixprocessingpeptidase）：切除导肽加工肽酶激酶（processing-enhancingprotein，PEP）：可提高MPP活性至50倍基质中间肽酶（matrixintermediatepeptidase，MIP）：切除第二段导肽内膜蛋白酶I（innermembranepeptidaseI）：切除位于膜间隙和内膜的蛋白质前体第二段导肽

第43页/共66页线粒体蛋白质输入过程中的重要分子（图示）第44页/共66页§3Mt基因组结构异常与疾病线粒体病：mt异常影响细胞能量供应，从而影响细胞的正常功能，所致疾病称为线粒体病（mitochondrialdiseases）。常累及脑、肌肉和眼等对能量需求较高的组织和器官。线粒体DNA病：mt病的研究已从mt的形态功能变化进入到分子水平，mt基因组（DNA）结构的异常所导致的疾病，或相关疾病称为线粒体DNA病。第45页/共66页一、mtDNA结构异常的主要类型

mtDNA易受损伤：无组蛋白和DNA结合蛋白的保护；复制快速但无校读功能（proof-reading）；缺乏修复机制；mtDNA突变率较核DNA高17倍干细胞mtDNA异常导致家族性疾病；体细胞mtDNA异常导致散发性疾病和年龄相关性疾病。第46页/共66页类型：点突变：（编码基因：结构基因、tRNA和rRNA基因；非编码区）缺失：缺失类型多样，最常见是 4997bp（5kb普通缺失）。插入重复（insertionsandduplication）：mtDNA上插入一段核苷酸片段形成mtDNA基因序列的重复。第47页/共66页二、mtDNA异常所致的经典疾病——线粒体肌病（mitochondrialmyopathy）第48页/共66页第49页/共66页三、mtDNA异常与衰老和神经退行性疾病

1.MtDNA异常与衰老衰老的自由基学说氧自由基积累——mtDNA损伤，超过一定阈值（threshold）——细胞中线粒体结构、功能退化——细胞OXPHS（oxidativephosphorylation）能力下降，ATP生成减少——细胞衰老或死亡，主要累及代谢旺盛器官：脑、肌肉、心脏等。第50页/共66页第51页/共66页

2.MtDNA结构异常随年龄而增加常见缺失突变，以4977bp和7436bp最常见，mtDNA缺失发生年龄随受累组织和缺失类型而异。点突变报道较少，mtDNA3243A——G突变，成人较婴儿高5~10倍。第52页/共66页1999年，Michikawa等发现mtDNA调控区（D-loop和相临的转录启动序列）存在衰老相关特异性的点突变，几乎均为碱基的替换，如285T——C，368A——G，383I（插入）和414T——G，在14例年龄超过65岁的老人中发现10例具有上述点突变，而在13例青年中未发现一例具有上述点突变。该特异性点突变的频率（即含突变mtDNA占总mtDNA的比例）约为20%。（Science，286：774-779，1999）。第53页/共66页

2.MtDNA异常与神经退行性疾病

Alzheimer`sdisease：老年始发的神经退行性疾病，为西方老年人的第四位死因，表现为记忆缺失（amnesia）、失语（aphasia）和失认（agnosia）三A症状。病理学特征：脑中出现老年斑（senileplaques，SP）和神纤维缠结（neuropathologicaltangles，NFT）。第54页/共66页相关基因：第55页/共66页MtDNA变化

点突变ND2基因5460G——AorT（实验未能重复）

ND13397A——GtRNAgln4336A——G（conflictingresults）Asn5705T——G16srRNA3196G——AmtCoI，CoII（missensemutations）——late-onsetAD（contaminationnDNA）

缺失AD病人<75岁5kb缺失较对照组高（6-15倍）>75岁5kb缺失较对照组降低老年性记忆减退动物模型较记忆正常组，mtDNA5kb缺失比例增高。第56页/共66页

Parkinson`sdisease（PD）：另一种常见的老年性神经退行性疾病，又名震颤麻痹，以运动减少，肌肉强直和震颤为主要症状。主要病理变化是位于脑黑质的DA神经元变性和消失。PD病人脑黑质的mt复合物I活性降低39%，II~IV活性正常，其小分子量亚单位降低，具体分子机制尚不明确。第57页/共66页PD病人脑mtDNA5kb缺失较对照组无增加在PD病人脑中发现和AD相似的点突变第58页/共66页但mtDNA全序列分析，PD病人和相同年龄对照组之间这些突变的频率没有明显差异（B.B.R.C,290：1593~601，2002）

最新研究发现PD易感基因，NR4A2，其编码一组核受体超家族，是黑质多巴胺神