几种土壤酶的测定方法

土壤酶的测定方法（一）蔗糖酶方法：比色法1试剂配制（1）20%蔗糖（质量分数）（2）甲苯（3）pH=5.5醋酸盐缓冲液：取120ml冰醋酸用水稀释至1L（a），取164g无水CH3COONa溶于水并稀释至1L（b），将（a）与（b）二液按1:8混合再用pH计校正pH。⑷0.2MNa2HPO4-12H2O（5）钼溶液：配制5%钼酸铵水溶液（a）,再取200ml浓硫酸加800ml水（b）。使用前将（a）、（b）二液按1:1混合。（6）铜试剂：取50gCuSO4・5H2O溶于500ml水中（a）,取25gNa2CO3>25g酒石酸钾钠、20gNaHCO3和200gNa2SO4溶于水并稀释至1L再加几滴甲苯（b）。使用前将（a）、（b）二液混合。（7）葡萄糖标准溶液：将葡萄糖先在50-58^条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml苯甲酸溶液（饱和）中（5mg还原糖/ml）,即成标准葡萄糖溶液。再用标准液制成1ml含0.01-0.5mg葡萄糖的工作溶液。2标准曲线绘制：将（7）所述的葡萄糖标准溶液稀释成1mg/ml还原糖工作液。然后，取不同体积（0.5-50ml）工作液移于100ml容量瓶中，加入10mlpH=5.5醋酸盐缓冲液，用水稀释至刻度。吸取此液5ml移于100ml容量瓶中，加4ml铜试剂。在沸腾水浴上放置25min，冷却至室温。再加2ml0.2M磷酸氢二钠和5ml钼溶液，显色1min定容，在分光光度计上于578nm处比色，根据光密度值和浓度绘制标准曲线。3操作步骤取10g土壤（&填料）置于100ml容量瓶中，加2ml甲苯。15min后加10ml20%蔗糖和10mlpH=5.5醋酸盐缓冲液，置于37^恒温箱中培养24h。培养结束后，过滤并定容，按绘制标准曲线操作步骤显色、比色。试验设用水代替基质的对照（空白）。4蔗糖酶活性，以24h后10g土壤（&填料）中葡萄糖毫克数表示。（二）脲酶方法：比色法1试剂配制（1）pH=6.7柠檬酸盐缓冲液：取368g柠檬酸溶于600ml纯水中，另取295gKOH溶于水，再将二种溶液合并，用1NNaOH溶液将pH调至6.7，并用水稀释至2L。（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2ml甲醇和18.5ml丙醇，然后用乙醇稀释至100ml（a），保存在冰箱中。称27gNaOH溶于100ml水中（b），保存在冰箱中。使用前取（a）、（b）两液各20ml混合，并用纯水稀释至100ml备用。（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。（4）10%尿素液（质量分数）（5）甲苯（6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵（（NH4）2SO4）溶于水并稀释至1L，则得1ml含0.1mg氮的标准液。绘制标准曲线时，可再将此液稀释10倍供用。2标准曲线绘制：吸取稀释的标准液1、3、5、7、9、11、13ml，移于50ml容量瓶中，然后加纯水至20ml。再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。3操作步骤取5g风干样品（土壤&填料），置于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，15min后加10ml10%尿素液和20mlpH=6.7柠檬酸盐缓冲液。摇匀后在37°C恒温箱中培养24h。过滤后取3ml滤液注入50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。4计算：脲酶活性以24h后1g样品（土壤&填料）中NH3-N的毫克数表示。NH3-N（mg）=ax2式中：a-从标准曲线查的的NH3-N毫克数2-换算成1g样品的系数（三）磷酸酶方法：磷酸苯二钠比色法1原理：在碱性条件下，当存在氧化剂铁氰化钾时，酚被氧化成醍，醍又与4-氨基氨替比林络合呈玫瑰色，颜色深度与酚量相关，通过比色测定游离酚量。2试剂配制（1）pH=9.8氯化铵-氢氧化铵缓冲液：取20g纯氯化铵，溶于100ml浓氢氧化铵中。（2）8%铁氰化钾溶液：取8g铁氰化钾，溶于纯水中，稀释至100ml（此液只能用一周）。（3）2%4-氨基氨替比林溶液：取2g4-氨基氨替比林溶于水中，稀释至100ml（此液只能用一周）。（4）0.5%磷酸苯二钠溶液（质量分数）。（5）酚的标准溶液：酚原液-取1g重蒸酚溶于纯水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。酚工作液-取10ml酚原液稀释至1L（每毫升含0.01mg酚）。（6）甲苯3标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13ml酚工作液（0.01g/L），置于50ml容量瓶中，分别加入20ml纯水，再加入0.25ml缓冲液，0.5ml4-氨基氨替比林溶液，0.5ml铁氰化钾溶液。每次加入试剂要充分摇动，最后定容至50ml。在15min内，在分光光度计上于510nm处比色测定溶液的光密度，最后绘成标准曲线。4操作步骤:称取5g样品（土壤&填料），置于50ml三角瓶中，加5滴甲苯后再加20ml0.5%磷酸苯二钠，充分震荡后于37r恒温箱中，培养2h。取培养后的滤液5ml，并按绘制标准曲线所述方法显色，比色测定。5结果计算：磷酸酶活性，以2h后100g土壤&填料中P2O5的毫克数表示。PO（mg）=aX80x0.32x2.2925式中：a-5ml滤液中酚的毫克数80-换算为100g样品（土壤&填料）的系数0.32-以磷单位表示结果的系数（在磷酸苯二钠中，1个重量单位的酚，相当于0.32重量单位的磷）2.29-将P换算为P2O5的系数（四）蛋白酶方法：比色法1试剂配制（1）1%酪素溶液：用pH=7.4的0.2M磷酸盐缓冲液配制（质量分数）（2）0.1N硫酸（3）20%硫酸钠（质量分数）（4）2%茚三酮液：2g茚三酮溶于100ml丙酮（5）甲苯（6）甘氨酸标准溶液：取0.1g甘氨酸溶于水中，定容至1L，则得1ml含0.02mg氨基氮的标准溶液。再稀释10倍制成工作液2标准曲线绘制：分别吸取工作液1、3、5、7、9、11ml移于50ml容量瓶中，加1ml茚三酮，冲洗瓶颈后在沸水浴上加热10min，将获得的着色溶液用纯水稀释至刻度。在分光光度计上于500nm处比色测定颜色深度。以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标，绘制曲线。3操作步骤：称取4g样品（土壤&填料），置于50ml三角瓶中，加20ml1%酪素液和1ml甲苯，小心振荡后用木塞塞紧，在30^恒温箱中放置24h。培养结束后，于混合物中加2ml0.1N硫酸和12ml20%硫酸钠液，以沉淀蛋白质，然后离心15min（6000转/分）。取上清液2ml，置于50ml容量瓶中，按绘制标准曲线显色方法进行