单克隆抗体制备过程中经过两次筛选

单隆体备程经两筛单克隆抗体制备过程中，总共有次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法不相同的。第一次筛选的原理与方法合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采择性培养液是在普通的动物细胞培液中加入次黄嘌呤喋（）腺嘧啶核苷酸（据胞中的DNA合有条径条途径是生物合成途“D途”酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作重要的辅酶参与这一过程，而HAT培液氨喋是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合的途。另一条径是应急途径或补救途径（“S径”用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转（HGPRT和腺啶核苷激化次黄嘌呤和胸腺啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因，在HAT培液中，未融合的效应细两个效B细融“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途”正常缺乏在体外培养液中增殖的能力般左会亡于髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷HGPRT），因此自身没有“S途”且径”又被氨基喋呤断，所以在培中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效细“S途”，又具有骨髓细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能HAT养液中选择性存活下来并不断增殖。第二次筛选的原理和方法：在实免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决簇刺激机体形成相对应的一种效应淋，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋胞的特异性是不同的经培筛选的杂交瘤细胞特异性也存在异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时能保证有些孔中是单细胞些胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中两次筛选的原理和方法是不相同的。单隆体备基原与程原理：B淋细抗原的刺激下，能够分化、殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这B细与分的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技即称为单克隆抗体技术。过程：）免疫脾细胞的制备制克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小。疫方决于所用抗原的性质。免疫法同一般血清的制备，也可采用内直接免疫法。）骨髓瘤细胞的培养与选在合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT活性的细不能在含8-AG的养基中存活瘤胞用10%小清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h液一次，使骨髓瘤细胞处于对数长期。）细胞融合的关:1术上的误差常常导致合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要败的。2合试验最大的失败原是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的菌操作技术。阳隆的筛选应早行常融后10作第一次检测早出现假阳性测法灵、而且简便快速。具体应用的方法根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常的方法有RIA法ELISA法疫荧光法等。其中ELISA法便RIA法准。性隆筛进行多次，均阳性时才确定阳性克隆进行扩增。）克隆化隆化的目的为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方很多，而最常用的是有限稀释法。（1）微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。（2）限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液一定的稀释后，按每1个接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞能保证单克隆化，

所以为获得稳定的单克隆细胞株经2～3的再克隆才成。应该注意的是化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避丢失有意义的细胞。（3）琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。但法不如有限稀释法好。（4）光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。）细胞的冻存与复苏）大规模单克隆抗体的备选的性胞应早抗体制备，因为融合细胞随养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的，有时甚至超过该备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平，水的蛋也少便于抗体的纯化。摘要

在单克隆抗体制备中两次提到筛问题，对于两次筛选的方法和目的始终是一些人的困惑，那两次筛选的目的和方法到底是什么。单克隆抗体制备过程中两次提到筛选，对于两次筛选中的目的和方法许多人也存在疑惑，那到底是如何筛选的呢？现总结如下：第一次筛:首（效应B淋胞和骨髓瘤细胞进行杂交时可能出现的况应该先弄清楚，（一）可能的情况有：1（）B淋细胞和（效B淋胞的融2（）B淋细胞和骨髓细胞的融合（即杂交瘤细胞）3骨细和骨髓瘤细胞的融合（即瘤瘤细胞）4单髓细胞5个（应B淋胞（二）筛选的目的————获得交瘤细胞（三）筛选的方法用选择性培养基来完成，即HAT培。含有次黄嘌呤、氨基喋呤和腺嘧啶，其中氨基喋呤可阻D合成的主要途径。主要途径阻断后，靠应急途径即H（黄呤呤磷酸核糖转移酶）和胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤成DNA，缺其中一种合成不能发生。用于交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢陷型细胞内均无TK或HGPRT以或融合骨髓瘤细胞在HAT培液将死亡细胞虽然有和TK在体外通培养条件下在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代因此只有杂交瘤细胞才能在HAT培液中生长繁殖。所以通过以上方法可以选择出杂瘤细胞，但虽然都是杂交瘤细胞，但可能是同一抗原的不同原决定基刺激产生的。所以产生抗体是不纯的。如不进一步提纯，这样得到的是多克隆抗体。所以就有了第二筛选。第二次筛选：要想获得单克隆抗，所以必须得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群，由的胞群产生的抗体才是真正意义的单克隆抗体。()筛的目的筛选只针对某一种特定的抗原决簇产生抗体的杂交瘤细胞，即得到由一个细胞分裂而成的一细胞群并且能产生所需抗体（二）筛选的方法1、离细胞置入多孔培养板的每孔中培养2检测每孔细胞是否生所注射抗原的抗体（即教材插图中提到的选出能产生特定抗体细胞群）所以筛选的条件是两层意思：单个细胞单孔培