生物技术药物反义核酸和核酶专家讲座

朱俊铭年10月生物技术药品生物技术药物反义核酸和核酶第1页主要内容绪论动植物细胞培养生产医药用产品或原料转基因动植物作为药品生物反应器抗体工程药品干细胞与治疗性克隆基因工程疫苗与DNA疫苗基因药品反义核酸与反义技术生物技术药品新药与专利申报生物技术制药产业化个案生物技术药物反义核酸和核酶第2页反义药品生物技术药物反义核酸和核酶第3页主要内容一、反义核酸与反义技术反义核酸和反义技术概念反义核酸基本原理反义核酸种类反义核酸与反义技术应用二、核酶技术及其应用核酶概述核酶与RNA修复核酶技术在临床上应用核酶技术面临问题生物技术药物反义核酸和核酶第4页反义核酸和反义技术反义核酸(antisensenucleicacid)

是一段与靶基因某段序列互补天然存在或人工合成核苷酸序列

它可经过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平调整靶基因表示，含有合成方便、序列设计简单、轻易修饰、选择性高、亲和力高等特点反义核酸技术（antisensenucleicacidstechnology)

是依据核酸杂交原理设计，以选择性地抑制特定基因表示为目标一类核酸研究新技术

包含反义RNA(asRNA)、反义DNA(asDNA)、核酶(Rz)生物技术药物反义核酸和核酶第5页反义核酸基本原理绝大多数DNA由两条碱基互补单链组成，生物信息以核苷酸不一样排列次序编码在DNA链上，基因组形成单顺反子结构在DNA双链上被转录为RNA链为正义链，与其相对应链为反义链精心设计一段寡核苷酸与正义链互补，普通由7到30个核苷酸组成，将会阻断基因转录；或将含有反义序列载体导入细胞内，干扰特定基因表示利用这一原理能够在基因位点、前体mRNA、mRNA及蛋白水平，经过干扰特定基因功效限制细胞增殖、分化和凋亡生物技术药物反义核酸和核酶第6页反义基因治疗

DNADNA

RNARNA

反义RNA

阻断表示利用人工合成反义RNA或DNA导入靶细胞，控制细胞中间阶段使编码蛋白基因不能转录为mRNA或阻断翻译对应蛋白生物技术药物反义核酸和核酶第7页生物技术药物反义核酸和核酶第8页反义技术两种技术路线将表示与体内基因或mRNA互补序列基因转入体内，使细胞表示与目标基因互补mRNA，从而阻断目标基因表示体外合成mRNA互补核苷酸类似物，经过静脉注射等路径进入细胞，特异性地与目标mRNA作用以第二种为主来介绍生物技术药物反义核酸和核酶第9页反义核酸种类反义RNA：一类能与特异mRNA互补小分子质量、可扩散DNA转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异地抑制靶基因表示反义DNA：人工合成一小段反义寡核苷酸，与DNA或mRNA序列互补结合，封闭靶基因表示（ASODN）

理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象“封条”一样，阻断mRNA拼接、转录、翻译，下调特定基因表示生物技术药物反义核酸和核酶第10页反义RNA最初发觉反义RNA最先发觉于原核细胞，是由Tomizarna在1981年对质粒ColE1复制研究过程中发觉生物技术药物反义核酸和核酶第11页c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调整c-myc基因是禽类髓细胞病毒(AMN)MC-29V-myc细胞同源序列，与各种肿瘤发生发展相关Saito等研究发觉，c-myc基因有3个外显子，第一个外显子不编码蛋白质，它序列与第二个外显子互补，经过反义RNA与第二个外显子mRNA碱基配对而抑制基因表示在人Burkitt淋巴瘤中发觉c-myc基因失去了第一个外显子，从而使c-myc基因表示失控由此可见，反义RNA负调整被解除是细胞恶性转变原因之一生物技术药物反义核酸和核酶第12页c-myc基因——真核细胞中天然反义RNA调整c-myc互补RNAC-MYC生物技术药物反义核酸和核酶第13页反义RNA作用机制作用于外显子和内含子连接区，阻止mRNA前体剪接反义RNA与DNA结合时能阻止转录因子与DNA结合，从而阻止特定基因转录互补于特定mRNA非编码区，如SD序列或核糖体结合位点及其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译互补于特定mRNA编码区，抑制翻译或激活RNaseH使mRNA易被核酸酶降解作用于靶mRNA5’端，阻止帽子结构形成，影响mRNA成熟作用于PoIyA形成位点，阻止靶mRNA成熟及向胞浆内转运生物技术药物反义核酸和核酶第14页反义RNA作用机制DNApreRNARNAProteinm7G5'pppAA…AArRNA生物技术药物反义核酸和核酶第15页反义RNA取得路径化学会成法：利用核酸合成仪直接合成反义RNA体外转录法：利用带有噬菌体SP6或T7等开启子序列质粒，将特异基因DNA片段反向插入其多克隆位点中，在RNA聚合酶作用下体外合成特异性反义RNA细胞内转录法：利用基因重组技术，在适宜开启子和转录终止子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义RNA表示载体(病毒表示载体或质粒表示载体)，然后转染细胞并使之在细胞中稳定表示反义RNA生物技术药物反义核酸和核酶第16页反义RNA临床作用抗病毒：将特定病毒基因反向插入到表示性载体中，以构建反义RNA表示载体再将重组体导入真核细胞(病毒宿主细胞)中表示特异性反义RNA从而抑制特异有害基因表示或抑制病毒复制（疱疹病毒、流感病毒、人类免疫缺点病毒）抗肿瘤：设计出针对肿瘤细胞癌基因、突变基因、非正常表示基因及一些肿瘤相关病毒癌基因反义RNA以阻断这些有害基因表示，到达治疗肿瘤目标生物技术药物反义核酸和核酶第17页反义DNA与靶基因结合形式寡核苷酸与双股DNA结合，形成三股螺旋结构，竞争抑制激活转录蛋白与基因开启子结合，发挥其生物活性寡核苷酸与mRNA杂交形成了核糖核苷酸酶H(RNaseH)底物，激活RNaseH识别杂交体特异性地剪切杂交分子中mRNARNaseHASODNmRNATFO生物技术药物反义核酸和核酶第18页反义寡聚核苷酸与mRNA特异性结合，阻断翻译过程生物技术药物反义核酸和核酶第19页ANTISENSETECHNOLOGIESGENOMICSBASEDDRUGDISCOVERYPHARMACEUTICALSMOLECULARDIAGNOSTICSGENETHERAPYDRUGDELIVERYSYSTEMSRelationofantisensetechnologiestoothersegmentsofbiopharmaceuticalindustry反义技术与反义核酸应用生物技术药物反义核酸和核酶第20页利用反义RNA原癌基因失活疗法：

阻止或抑制原癌基因过分表示及抑制癌基因突变体mRNA成熟原癌基因调控细胞生长，增殖与分化正常情况下，表示受严格控制一旦调整失控，基因产物（生长因子，生长因子受体，胞内外传递信号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性增生，致癌治疗方法

依据已知癌基因核苷酸序列合成反义RNA

对应反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表示mRNA起始翻译位

点结合成RNA/RNA双链体

双链体阻止开启子与核糖体结合，或核糖体沿mRNA上移，抑制翻译反义RNA应用（一）生物技术药物反义核酸和核酶第21页

反义RNA应用（二）生物技术药物反义核酸和核酶第22页

反义RNA应用（二）生物技术药物反义核酸和核酶第23页

反义RNA应用（二）抗HIV-l作用：从翻译水平封闭基因表示，并干扰mRNA剪切、加工而实现抗病毒作用tat为HIV-l主要调整基因，编码反式激活因子Tat蛋白在逆转录病毒开启子LTR之后连接反义tat与多聚TAR构建物(LTR-25TAR-AS-TAT)，含有反义tat及TAR诱饵双重作用因为LTR开启子受Tat蛋白反式激活，使tat在HIV-l感染细胞中得以高表示将这种外源基因导入Molt-3T细胞系、CEM-SST细胞系及健康人外周血单个核细胞(PBMCs)，对试验及临床分离病毒株都有抑制作用gag是HIV-1结构基因，编码p24等病毒结构蛋白Veres等构建了逆转录病毒载体，在细胞内表示互补于gag区不一样长度反义RNA(225-1225nt)

在CEM-SST细胞及外周血CD4细胞都有抑制HIV-l复制作用长片段反义RNA抗HIV-l作用更加好，可能因为它能与不一样种HIV-lRNA结合而限制了病毒逃逸生物技术药物反义核酸和核酶第24页部分反义药品生物技术药物反义核酸和核酶第25页OligoCompanyStatus/RemarksISIS3521ISIS2503ISIS5132AP1OncomygNGAVI4557GenasenseGEM231GTI2040GTI2501LEafAONPAN346HERZYMEANGIOZYMEISISPharmaISISPharmaISISPharmaAntisensePharmaAVIBIoPharmaAVIBIoPharmaGentaHybridonLorusTherapeuticsLorusTherapeuticsNeoPharmPanaceaPharmaRibozymePharmaRibozymePharmaPIII(Affinitak)PIIIPIII针对肿瘤反义药品生物技术药物反义核酸和核酶第26页针对其它疾病反义药品OligoCompanyIndicationsRestenNGE2FDecoyAVIBioPharmaCorgentechCardiovasculardisorderISIS2302ISIS104838AVI4014ISISPharmaISISPharmaAVIBIoPharmaAutoimmune&InflammatoryDurasonEpiGenesisRespiratorydisorderAVI4126AVIBioPharmaUrologicalDiseaseISIS14803HEPTAZYMEHepBzymePNAbioticsNeuBioticsISISPharmaRibozymePharmaRibozymePharmaPanthecoAVIBiopharmaInfectiousDiseaseGEM92HGTV43HybridonEnzoAIDS&Relateddisease生物技术药物反义核酸和核酶第27页第一个反义药品——福米韦生Fomivirsen（ISIS2922）是FDA同意上市第1个反义药品商品名Vitravene美国ISISPharma企业研制瑞士CibaVisionOphthalmics企业申请1998年8月在美国首次上市核苷酸序列为5’-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3’硫代磷酸化修饰主要用于治疗艾滋病(AIDS)病人并发巨细胞病毒(CMV)性视网膜炎生物技术药物反义核酸和核酶第28页第一个反义药品——福米韦生1药效学1.1抗病毒作用机制主要依赖于反义作用，福米韦生与CMVmRNA特异序列互补结合，被RNA酶H识别，并使mRNA水解失活抑制CMV进入宿主细胞是序列非依赖性非反义作用1.2抗病毒活性对人类CMV病毒株AD169EC50为0.37μmoL此EC50为更昔洛韦（ganciclovir）l30～1901.3耐药性耐受高浓度福米韦生病毒突变株与福米韦生互补基因区并无改变，这表明耐药性不是互补基因区发生改变而引发生物技术药物反义核酸和核酶第29页第一个反义药品——福米韦生2药动学2.1兔体内药动学以14C标识福米韦生单次66μg剂量，玻璃体液中消除t1/2为62h给药10天后，仍对CMV复制有抑制作用，有22%福米韦生存在，其余78%则降解为短链代谢物视网膜中消除t1/2约为79h2.2猴体内药动学玻璃体液药品浓度与剂量曲线几乎为直线关系峰值浓度出现在给药2～3天后，14天后基本检测不到在每七天或每2周玻璃体内注入11、57和115μg后，玻璃体液中未发觉药品累积现象但屡次注射后，视网膜上出现药品累积现象福米韦生115μg单次给药，在视网膜中消除t1/2为78h生物技术药物反义核酸和核酶第30页第一个反义药品——福米韦生3临床疗效前3周每七天福米韦生165μg玻璃体内注射，以后每2周给药1次，用药组和对照组病情进展时间中位数分别为71和14天福米韦生能够降低病人体内CMV活性，呈剂量-效应关系病情发展到威胁视力病人，使用福米韦生后症状有所好转，病情进展显著延缓4不良反应最常见不良反应是暂时性眼内压升高和轻、中度眼前、后房炎症反应全部研究对象均未发生视网膜剥脱和全身毒性反应高剂量可引发少数病人外周视网膜色素从容及周围视力下降与眼外科手术相比，玻璃体内注射发生出血、眼内炎和视网膜剥脱风险要小得多生物技术药物反义核酸和核酶第31页第一个反义药品——福米韦生5适应证和禁忌证福米韦生为二线治疗药品，适合用于对其它治疗办法不能耐受或没有效果或有禁忌病人；禁用于2～4周内使用西多福韦（cidofovir）治疗病人，以免增加发生眼内炎危险性6与治疗CMV视网膜炎其它药品比较更昔洛韦、西多福韦和膦甲酸钠是CMV抑制剂，而非杀死剂；含有交叉耐药性；可产生肾毒性；插管给药、植入制剂费用昂贵、重复手术以及视网膜剥脱发生率高（28%）使应用受限福米韦生含有阻止病毒复制，疗效持久、用药次数少，不良反应少而轻，局部玻璃体内注射给药优于其它上述提及给药方法7展望生物技术药物反义核酸和核酶第32页受体介导转移技术受体介导DNA转运技术启发实现DNA和RNA转运例：脱唾液酸血清类粘蛋白(ASGP)受体

唾液酸血清类粘蛋白—唾液酸→ASGP

ASGP

+PL（多聚赖氨酸）→

ASGP-PL复合物反义RNA

+ASGP-PL复合物→

ASGP-PL-反义RNA复合物

ASGP-PL-反义RNA复合物→

肝细胞表面ASGP受体识别→吞噬→

释放→发挥作用优点：专一性强，抗降解能力强生物技术药物反义核酸和核酶第33页以聚合物微球为载体输送系统当前研究最多聚合物微球是聚丙交酯及乳酸一羟乙酸（LA-GA）以丙交酯和乙交酯为单体形成共聚物，降解属于水解反应产物均为人体正常代谢物，降解时间取决于两种单体配比和聚合物分子量组成结合复合体含有潜在转运反义核苷酸和核酶作用生物技术药物反义核酸和核酶第34页核酶技术及其应用核酶(Ribozyme)——一个含有核酸内切酶活性RNA分子，可特异性地切割靶RNA序列，含有解离后重复切割相同靶分子能力生物技术药物反义核酸和核酶第35页核酶发展简史1968年，FrancisCrick在他论文“基因密码起源”一文中提到：“可能第一个酶是含有复制能力RNA”，没有些人给予注意1987年，第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上，AlanWeiner做会议总结时重复了20年前FrancisCrick话，会议注意力已集中到最近发觉含有酶活性RNA分子上1989年，诺贝尔化学奖授予了分别独立地发觉含有酶活性RNA分子Thomas.R.Cech（ColoradoUniversity）SidneyAltman（YaleUniversity）生物技术药物反义核酸和核酶第36页ThomasR.Cech切赫，美国人因发觉RNA生物催化作用与S.Altman同获1989年诺贝尔化学奖独立发觉RNA不但被动地传递遗传信息，还能催化细胞内生命所必需化学反应，1982年公布其研究结果，1983年证实RNA酶活动以前，人们认为仅蛋白质才能起酶作用生物技术药物反义核酸和核酶第37页核酶发觉研究目标：rRNA中一些无意义序列，或内含子(intron)，怎样从RNA分子中剪切下来？研究对象：原生动物四膜虫(TetrahymenaThermophila)，只含一个RNA，除rRNA外还有一个由413个核苷酸组成插入序列(interveningsequenc，IVS)研究发觉：转录产物rRNA前体很不稳定，在鸟苷和Mg2+存在下切除本身IVS，使两个外显子拼接起来，变成成熟rRNA分子。催化反应是在无任何蛋白质酶存在下发生，称为自我剪接研究结论：

IVS含有类似蛋白酶功效，能够打断及重建磷酸二脂键rRNA前体能靠自己完成剪接过程，在一定条件下按一定方式盘绕，进而切割自己，以后再把保留部分连接起来。能够催化自由底物含有酶活性RNARNA分子含有本身断裂催化作用，以及酶活性另一个主要方面即催化其它分子反应生物技术药物反义核酸和核酶第38页SidneyAltman奥尔特曼（1939—）美国人因发觉RNA生物催化作用而获1989年诺贝尔化学奖1978年奥尔特曼发觉了核糖核酸(RNA)本身含有生物催化作用不但为探索RNA复制能力提供了线索，而且说明了最早生命物质是同时含有生物催化功效和遗传功效RNA，打破了蛋白质是生物起源定论生物技术药物反义核酸和核酶第39页S.Altman研究工作研究目标：t-RNA分子剪接过程研究发觉：在较高浓度镁离子和适量精氨酸参加下，核酸酶P（ribonucleaseP，RNaseP）中RNA能够切割tRNA前体5’端研究结论：过去都认为RNase

P催化作用由RNA和蛋白质共同完成，而该试验证实，RNase

P催化作用是由RNA完成，而其中蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象作用因为这类酶含有类似核糖核酸功效，而化学本质为核酸，所以被切赫称之为核酶生物技术药物反义核酸和核酶第40页核酶作用机制生物技术药物反义核酸和核酶第41页核酶分类剪切型核酶：这类核酶催化本身或者异体RNA切割，相当于核酸内切酶剪接型核酶：这类核酶含有核酸内切酶和连接酶两种活性剪切型核酶剪接型核酶依据催化反应锤头核酶I型内含子II型内含子发夹核酶丁型肝炎病毒(HDV)核酶RNaseP链孢霉线粒体(VS)核酶自体催化异体催化生物技术药物反义核酸和核酶第42页自体剪切型核酶-锤头型核酶锤头核酶是从类病毒中分离出来原来是一个顺式切割酶，将其分为酶链和底物链两部分后就转变为靶标特异性反式切割酶在预防有害基因表示上含有很大应用价值形状：长约30个核苷酸，呈球状构象，可粗略看成性折叠二级结构：3个超螺旋结构域和13个保守核苷酸残基组成：催化区和底物结合区性质：需要二价金属离子(Mg2+)作为它辅因子，核酶活性形式是一个RNA键合金属氢氧化物生物技术药物反义核酸和核酶第43页3个双螺旋区13个核苷酸残基保守序列剪切反应在右上方GUX序列3‘端自动发生生物技术药物反义核酸和核酶第44页发夹结构核酶1989年（Hample）研究烟草环斑病毒（sTRSV）负链RNA自我剪切反应，提出发夹结构（hairpinstructure）模型发夹核酶催化机制：金属离子在催化反应中起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高生物技术药物反义核酸和核酶第45页5‘3‘剪切位点自体剪切型核酶-发夹结构3个环和4个螺旋形成两个结构域剪切反应发生在底物识别序列GUC5‘端两个内部环中碱基及在螺旋区IIG11和底物中G+1都是酶发挥作用所必需生物技术药物反义核酸和核酶第46页肝炎病毒（HDV）核酶当前唯一一个哺乳动物细胞内含有天然核酶活性动物病毒起源于肝炎病毒反义RNA和基因组RNA，为单股环状负链RNA病毒结构特点：有3个由碱基配对形成茎，剪切时需要二价阳离子参加，结果产生5‘-OH和2’,3’-环磷酸生物技术药物反义核酸和核酶第47页剪切部位剪切部位自体剪切型核酶-斧头结构三个碱基正确茎需要二价阳离子产生5’-OH和2’,3’-环磷酸生物技术药物反义核酸和核酶第48页链孢霉线粒体（VS）核酶VS核酶球状，由5个螺旋结构组成，这些螺旋结构经过两个连接域连接起来，连接域对于催化反应很主要生物技术药物反义核酸和核酶第49页异体剪切型核酶－RNasePRNaseP是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切全部tRNA前体5‘端，除去多出序列，形成3’-OH

和5’-磷酸末端RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成体外：M1RNA具催化作用，蛋白质作为辅助因子体内：M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需RNaseP可剪切前体5’端41nt,5’端成熟不一样tRNA

5’端没有次序共同性，剪切准确性与剪切部位周围核苷酸次序无关，表明在RNaseP组分内没有引导序列，RNaseP所识别是底物高级结构生物技术药物反义核酸和核酶第50页剪切位点生物技术药物反义核酸和核酶第51页型内含子核酶一类含有酶催化功效内含子，转录成RNA后，能够自剪接其转录后可形成9个碱基配对形成特定二级结构，分别命名为P1至P9在剪接反应中，需要游离鸟苷作辅助因子能够用来修复体内有害突变基因生物技术药物反义核酸和核酶第52页G结合位点保守序列剪接部位引导序列G结合位点

I类内含子二级结构通式生物技术药物反义核酸和核酶第53页生物技术药物反义核酸和核酶第54页I型内含子催化其它RNA分子反应几个类型转核苷酸作用

2CpCpCpCpC

→CpCpCpCpCpC+CpCpCpC

水解作用

CpCpCpCpC

→CpCpCpC+pC

转磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpU→CpCpCpCpCpC+UpCpUp

去磷酸作用

CpCpCpCpCp

→CpCpCpCpC+Pi限制性内切酶作用̶CpUpCpUpN̶

+G→CpUpCpU+GpN̶生物技术药物反义核酸和核酶第55页II型内含子核酶由6个螺旋组成，分成3个部分：边界序列5’GUGCG···YnAG，（Y代表嘧啶，n代表任意核苷酸）3’茎环结构分支点次序

A处于未配对状态，有一游离2’-OH剪接机制：不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子(Mg2+)生物技术药物反义核酸和核酶第56页II型内含子核酶II型内含子有一个保守二级结构结构域V：高度保守，催化活性必需结构域VI：未配正确A提供2‘-OH生物技术药物反义核酸和核酶第57页II型内含子核酶生物技术药物反义核酸和核酶第58页II型内含子核酶剪接机制生物技术药物反义核酸和核酶第59页生物技术药物反义核酸和核酶第60页脱氧核酶指含有催化功效DNA分子称为脱氧核酶(DNAzyme)，又称酶性DNA在一定条件下可切割RNA分子特定位点内部磷酸二酯键脱氧核酶发觉深入延伸了酶概念含有水解酶活性脱氧核酶以RNA为底物脱氧核酶：包含“10-23”DRz和“8-17”DRz

以DNA为底物脱氧核酶：手枪型脱氧核酶含有N-糖基化酶活性脱氧核酶含有连接酶活性脱氧核酶含有激酶活性脱氧核酶生物技术药物反义核酸和核酶第61页10-23型脱氧核酶作用机理生物技术药物反义核酸和核酶第62页手枪型脱氧核酶自我剪切作用机理生物技术药物反义核酸和核酶第63页核酶与RNA修复核酶是天然含有催化能力RNA分子，能特异性地催化RNA剪接经过基因工程改造核酶，能够位点特异性地切割任意给定RNA分子剪接有两种形式：一是分子内不一样部分间剪接，称为顺式剪接；一是不一样分子间剪接，称为反式剪接反式剪接是修复RNA外显子突变主要方法能够把正常基因或含有类似功效基因对应片段，剪接到异常RNA上去，换下突变部分生物技术药物反义核酸和核酶第64页修复RNA结构缺点利用核酶剪接能力，可引入新基因功效或修复已经有基因缺点N.Lan等对镰形细胞贫血突变β珠蛋白mRNA进行了修复镰刀形细胞贫血是因为β珠蛋白基因第6密码子中一个A→T突变引发未起源于四膜虫组I内含子核酶改造，使之能专一性识别β珠蛋白mRNA突变位点上游特定序列将γ珠蛋白cDNA下游包含外显子在内对应片段连接到这一核酶3’端转染培养到病人外周血和脐带血干细胞后，均检测到β珠蛋白mRNA被剪接成β珠蛋白γ融合RNA分子，说明引入功效基因得到表示生物技术药物反义核酸和核酶第65页生物技术药物反义核酸和核酶第66页胎儿型血红蛋白(HbF，α2γ2)与成人型血红蛋白(HbA，α2β2)功效相近，所以γ珠蛋白引入，能够代偿βS珠蛋白所丧失功效，起到治疗镰形细胞贫血作用Tγγββ生物技术药物反义核酸和核酶第67页恢复正常剪接路径基因突变有时会在内含子中生成新剪接点，当然也是异常剪接点。它们与左邻右舍原来不起作用隐匿剪接点搭配起来，就会形成错误剪接因为原有正常剪接点并未丧失功效，只是作用被异常剪接抑制，所以用反义核酸经过碱基互补，封闭异常剪接点或其它剪接元件，就可堵住异常剪接路径，迫使剪接系统选择正确路径，形成正常RNA。这就间接地对RNA缺点作了“修复”剪接缺点型突变往往使mRNA失活，影响严重β地中海贫血是因为患者β珠蛋白基因突变，造成正常β链降低，红细胞内α和β链不平衡，缔合形成成人型血红蛋白（α2β2）少了或者完全没有引发已发觉190各种β地中海贫血突变型中，有一部分属于剪接缺点型生物技术药物反义核酸和核酶第68页CCC—CCC—CCCC反义RNA生物技术药物反义核酸和核酶第69页β地中海贫血我国常见内含子2第654位C→T突变（β654），就是在653位形成了一个新剪接点，同时又激活了其上游579位一个潜在剪接点，造成一段长度为73个碱基内含子2序列插入到外显子2和3之间，形成异常mRNA，引发地中海贫血表型因为突变基因原有正常剪接点并未遭到破坏，依然能够发挥作用，所以用反义核酸封闭异常653或579位点，就能迫使人体剪接系统回到正常剪接路径，降低异常mRNA形成反义封闭虽没有对β珠蛋白基因突变作任何修正，不过对突变RNA错误剪接方式作了纠正，所产生成熟mRNA能够指导合成正常珠蛋白链。生物技术药物反义核酸和核酶第70页调整蛋白质肽链百分比

突变基因异常表示，往往扰乱体内蛋白质肽链之间平衡，引发疾病反义封闭技术也可用来纠正基因表示紊乱。常见血红蛋白H病（慢性溶血性贫血）研究，就是一个比较理想范例正常人每个细胞有4个α珠蛋白基因，2个β珠蛋白基因，合成α和β链恰好缔合成四聚体α2β2生物技术药物反义核酸和核酶第71页血红蛋白H病假如在4个α珠蛋白基因中只有1个正常，其余3个丢失或有缺点，则红细胞中α链合成不足，β链相对过剩。多出β链自行聚合为四聚体β4，即血红蛋白H血红蛋白H不稳定，轻易解体生成游离β链，游离链在红细胞内沉淀形成H包涵体，附着在红细胞膜上，使膜受损失去柔韧性。这种红细胞易被脾脏破坏，造成血红蛋白H病血红蛋白H病基本病因是α链偏少，β链偏多，能够采取反义封闭表示偏多正常βmRNA，使β链合成降低，与本身不足α链在低水平上达成平衡，从而改进临床症状这一策略反其道而行之，不是修正，而是抑制基因功效，属于一个广义RNA功效修复生物技术药