酶工程制药培训资料课件

08酶工程制药S1酶工程制药概述S2固定化酶与固定化细胞S3酶的化学修饰S4酶工程研究的进展第一页，共八十一页。S1酶工程制药概述酶工程的概念酶工程（enzymeengineering）是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。第二页，共八十一页。S1酶工程制药概述酶工程的研究内容（1）酶的分离、提纯、大批量生产及应用开发（2）酶和细胞的固定化及酶传感器的研究（3）基因工程酶、遗传修饰酶（突变酶）（4）酶的分子改造与化学修饰、酶的结构与功能关系（5）有机相中的酶反应的研究（6）酶的抑制剂、激活剂的开发及应用（7）抗体酶、核酶、脱氧核酶的研究（8）模拟酶、合成酶、酶分子的人工设计、合成第三页，共八十一页。S1酶工程制药概述酶在医药领域的应用在疾病诊断方面的应用（1）根据体内原由酶活力的变化来诊断某些疾病（如利用谷丙转氨酶活力升高来诊断肝炎）（2）用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病（如利用葡萄糖氧化酶测定血糖含量来诊断糖尿病）在疾病治疗方面的应用——药用酶的生产在药物生产方面的应用——酶法制药在分析检测方面的应用第四页，共八十一页。S1酶工程制药概述酶法制药：是指利用酶的催化作用而制造出具有药用功效的物质的技术过程。主要技术包括:酶的催化反应酶的固定化酶的非水相催化酶法制药药用酶的生产第五页，共八十一页。S1酶工程制药概述青霉素酰化酶：制造半合成青霉素和头孢霉素11--羟化酶：制造氢化可的松L-酪氨酸转氨酶：制造多巴-酪氨酸酶：制造多巴核糖核酸酶：生产核苷酸类物质蛋白酶和羧肽酶：将猪胰岛素转化为人胰岛素酶法制药：是指利用酶的催化作用而制造出具有药用功效的物质的技术过程。酶法制药药用酶的生产第六页，共八十一页。S1酶工程制药概述酶法制药药用酶的生产第七页，共八十一页。S1酶工程制药概述将猪胰岛素转化为人胰岛素酶法制药药用酶的生产第八页，共八十一页。S1酶工程制药概述药用酶的生产：是指生产可用于预防和治疗疾病的酶。主要技术包括:

药用酶的发酵生产药用酶的分离纯化药用酶的分子修饰酶法制药药用酶的生产第九页，共八十一页。S1酶工程制药概述酶法制药药用酶的生产第十页，共八十一页。S1酶工程制药概述酶法制药药用酶的生产第十一页，共八十一页。S1酶工程制药概述酶法制药药用酶的生产第十二页，共八十一页。S1酶工程制药概述酶法制药药用酶的生产至2004年2月美国FDA批准的生物技术药物

产品商品名公司首次批准时间适应证Reteplase，t-PA突变体Retavase(大肠杆菌)Centocor1996.10急性心梗Rasburicase，尿酸降解酶Elitek(酵母)Sanofi-Synthelabo2002.7血浆尿酸症alteplase,tPAActivase(CHO)Genentech1987.11急性心梗，脑中风，肺栓塞urokinase，尿激酶Abbokinase(胎肾细胞)Abbott2002.10肺栓塞Laronidase，粘多糖--L-艾杜糖醛酸水解酶Aldurazyme(CHO)Genzyme2003.4粘多糖贮积病Imiglucerase，葡糖脑苷脂酶Cerezyme(CHO)Genzyme1994.5Gaucher's病Algasidasebeta，半乳糖苷酶-Fabrazyme(CHO)Genzyme2003.4Fabry's病dornasealfa，DNA酶Pulmozyme(CHO)Genentech1993.12囊性纤维化Tenecteplase，t-PA突变体TNKase(CHO)Genentech2000.6急性心梗第十三页，共八十一页。S2固定化酶与固定化细胞从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第十四页，共八十一页。从游离酶到固定化酶均相酶反应系统的缺点：1、水溶液中的游离酶只能一次性使用：既造成酶的浪费，又会增加产品分离的难度和费用，影响产品的质量2、游离酶很不稳定，容易变性、失活从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第十五页，共八十一页。从游离酶到固定化酶固定化酶的概念：通过载体将酶限制或固定于特定的空间位置，使之既不易随水流失，又能发挥酶的催化作用，这样的酶制剂就称之为固定化酶（immobilizedenzyme），制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化酶的最大特点：既具有生物催化剂的功能，又具有固相催化剂的特性。从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第十六页，共八十一页。从游离酶到固定化酶1、可以多次使用，且酶的稳定性提高固定化的葡萄糖异构酶：60-65℃，1000h固定化黄色短杆菌的延胡索酸酶：反应1年活力不变2、酶与底物和产物易于分开：产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高固定化酶的优点从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第十七页，共八十一页。3、反应条件易于控制：

可实现转化反应的连续化和自动控制4、利用效率高：

单位酶催化的底物量增加，用酶量减少5、比水溶性酶更适合于多酶反应从游离酶到固定化酶固定化酶的优点从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第十八页，共八十一页。连续的多酶反应主要缺点:固定化时，酶活力有损失从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第十九页，共八十一页。固定化的方法物理法结晶法化学法共价结合法分散法交联法物理吸附法包埋法网格型离子结合法微囊型从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第二十页，共八十一页。化学法：共价结合法酶与载体以共价键结合

——使用和报道最多的方法！载体无机物（玻璃、陶瓷）天然有机物（多糖、蛋白质）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙）从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第二十一页，共八十一页。化学法：共价结合法载体-反应基团活性基团（-SH）相关基团活化（-OH、-COOH、-NH2等）双功能试剂（戊二醛）酶-反应基团

-/ε-氨基，-/-/-羧基羟基、巯基、咪唑基、酚基等优点：结合牢固，酶不易脱落缺点：反应剧烈，酶活回收低（30%）从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第二十二页，共八十一页。从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞化学法：共价结合法第二十三页，共八十一页。化学法：交联法双功能/多功能试剂，酶-酶以共价键结合（不需要载体！）酶-反应基团氨基（N末端）、ε-氨基、巯基、酚基、咪唑基交联剂：戊二醛从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第二十四页，共八十一页。从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞化学法：交联法第二十五页，共八十一页。包埋法：网格型凝胶，细微网格包埋材料：合成高分子（聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂）天然高分子（淀粉、明胶、胶原、海藻胶等）从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第二十六页，共八十一页。包埋法：微囊型半透膜，颗粒颗粒直径通常为几微米到几百微米，比网格型要小得多，有利于底物与产物的扩散从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第二十七页，共八十一页。包埋法网格型、微囊型优点：1、酶活回收高——不需要酶蛋白的氨基酸残基参与反应2、适合于小分子底物和产物缺点：酶也易失活——包埋时发生化学聚合反应但可设计反应条件改善从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第二十八页，共八十一页。固定化酶的方法比较从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第二十九页，共八十一页。固定化酶的性质固定化也是一种化学修饰，酶本身的结构必然受到扰动酶固定化后，扩散限制效应、空间障碍、载体性质造成的分配效应等因素必然对酶的性质产生影响从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第三十页，共八十一页。固定化酶的性质1、酶活力变化：多数情况下，酶活降低Km增大——与底物的亲和力下降2、酶稳定性变化

热稳定性提高——最适温度酸碱稳定性提高——最适pH对有机溶剂、酶抑制剂稳定性提高贮藏稳定性提高从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第三十一页，共八十一页。从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞固定化酶的性质第三十二页，共八十一页。固定化细胞固定化细胞：受物理、化学等因素，被限制自由移动的细胞，保留催化活性，并可反复或连续使用。——在固定化酶的基础在发展而来——基因工程菌从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞第三十三页，共八十一页。S3酶的化学修饰从天然酶到修饰酶酶的化学修饰的方法化学修饰酶的药用价值化学修饰酶的局限性第三十四页，共八十一页。从天然酶到修饰酶工业用酶稳定性问题

对热、酸碱、重金属、抑制剂、有机溶剂等——使用寿命短，工艺成本高药用酶：

体内半衰期（最适pH等因素）抗原性第三十五页，共八十一页。改造天然酶的策略1、遗传修饰

突变酶——蛋白质工程技术2、化学修饰

化学修饰酶——化学修饰试剂主要依据：1、氨基酸残基侧链及修饰剂的反应性2、结构与功能的关系第三十六页，共八十一页。化学修饰的种类1、酶的表面修饰2、酶的分子内部修饰3、与辅助因子相关的修饰1）大分子修饰2）小分子修饰3）交联修饰4）固定化修饰第三十七页，共八十一页。大分子修饰大分子修饰：一些可溶性大分子可通过共价键连接到酶分子表面，形成覆盖层，对于提高药用酶的稳定性、延长体内半衰期、降低或消除抗原性具有重要意义。对修饰剂的要求：1、具有较大分子量2、良好的生物相容性和水溶性3、无毒性4、无免疫原性第三十八页，共八十一页。常用大分子修饰剂1、高分子聚合物

聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯醇（PVA）、聚丙烯（PAA）、聚赖氨酸2、天然生物大分子肝素、人血清白蛋白3、糖类及衍生物右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯、糖肽、聚乳糖第三十九页，共八十一页。常用大分子修饰剂产品商品名公司首次批准时间适应证humansomatropin人生长激素ProtropinSOMAVERT(PEG化)GenentechNektar/Pfizer1985.102003.3矮小症肢端肥大症rhG-CSF粒细胞集落刺激因子NeupogenNeulasta(PEG化)AmgenAmgen1991.22002.1白细胞减少interferon-2a干扰素-2aRoferon-APegasys(PEG化)RocheRoche/Nektar1986.62002.10乙肝、丙肝、白血病Kaposi's肉瘤等Interferon-2b干扰素-2bIntronAPEG-Intron(PEG化)Schering-PloughSchering-Plough1986.62001.8乙、丙肝、白血病、Kaposi's肉瘤等聚乙二醇（PEG）具有良好的水溶性和生物相容性，FDA认证：体内无毒性、无残留、无免疫原性至2004年2月，FDA批准的生物技术药物有4个经PEG修饰第四十页，共八十一页。化学修饰酶的药用价值提高热稳定性——工业用酶改善酶学性质——工业用酶改变最适pH值——工业用酶/药用酶

提高对各类失活因子的抵抗力——工业用酶/药用酶

消除抗原性——药用酶

延长体内半衰期——药用酶

改变组织分布能力——药用酶第四十一页，共八十一页。改变最适pH值酶修饰剂天然酶修饰酶猪肝尿酸酶白蛋白10.57.4-8.5糜蛋白酶肝素8.09.0吲哚-3-链烷羟化酶聚丙烯酸3.54.5-5.5猪肝尿酸酶PEG8.29.0改变最适pH值提高抗失活能力消除抗原性延长体内半衰期改变组织分布能力第四十二页，共八十一页。提高抗失活能力失活因子主要是水解酶和酶抑制剂过氧化氢酶：PEG修饰，抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解的能力明显提高尿激酶：白蛋白修后，抗胃蛋白酶水解和抗胎盘抑制剂的能力都增加可能机制：修饰剂产生空间屏蔽，有效地阻挡了水解酶或抑制剂的进攻，或者酶分子中对水解酶或抑制剂发敏感基团被修饰而起到了保护作用。

改变最适pH值提高抗失活能力消除抗原性延长体内半衰期改变组织分布能力第四十三页，共八十一页。消除抗原性酶修饰剂抗原性精氨酸酶PEG消除尿酸酶PEG消除SOD人血清白蛋白消除-葡萄糖苷酶人血清白蛋白消除L-Asn酶PEG消除链激酶PEG降低改变最适pH值提高抗失活能力消除抗原性延长体内半衰期改变组织分布能力第四十四页，共八十一页。消除抗原性改变最适pH值提高抗失活能力消除抗原性延长体内半衰期改变组织分布能力PFG和人血清白蛋白：在消除酶的抗原性上效果比较明显，这是目前比较公认的；PVP修饰酶：在重复用于体内后，会诱导机体产生抗体而使酶失活；糖类物质（包括右旋糖苷）：亦不容易消除酶的抗原性，在体内仍可诱发过敏反应。修饰酶的抗原性与修饰剂有关：第四十五页，共八十一页。延长体内半衰期酶修饰剂天然酶修饰酶精氨酸酶右旋糖苷1.4h12h尿酸酶白蛋白4h20hSOD白蛋白6min4h腺苷酸脱氢酶PEG30min28hL-Asn酶PEG2h24h改变最适pH值提高抗失活能力消除抗原性延长体内半衰期改变组织分布能力第四十六页，共八十一页。改变组织分布能力一些酶经化学修饰后，对组织的分布能力就有所改变，能在血液中被靶器官选择性地吸收，使更多的酶达到靶器官，更好地发挥药物的治疗效果。α-葡萄糖苷酶：白蛋白修饰，有利于肝细胞摄入辣根过氧化物酶：聚赖氨酸修饰，细胞的摄入量增加，对细胞的穿透能力能够增加100倍改变最适pH值提高抗失活能力消除抗原性延长体内半衰期改变组织分布能力第四十七页，共八十一页。脂质体包埋脂质体包埋属于酶的固定化修饰之一1、酶的表面修饰2、酶的分子内部修饰3、与辅助因子相关的修饰1）大分子修饰2）小分子修饰3）交联修饰4）固定化修饰改变最适pH值提高抗失活能力消除抗原性延长体内半衰期改变组织分布能力第四十八页，共八十一页。脂质体包埋脂质体：天然脂类和/或类固醇组成的微球体；酶分子包埋其中后，可通过细胞的膜融合或内吞作用而进入细胞内应用：药用酶（如SOD、溶菌酶等）

半衰期短，免疫原性——化学修饰

不易进入人体细胞——脂质体包埋改变最适pH值提高抗失活能力消除抗原性延长体内半衰期改变组织分布能力第四十九页，共八十一页。化学修饰酶的局限性1、某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的2、化学修饰酶的构象或多或少都有一些改变——在结构与功能研究中不利3、酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，但非极性侧链在维持酶的空间构象方面也有重要作用第五十页，共八十一页。S4酶工程研究的进展基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶人工模拟酶有机相酶反应第五十一页，共八十一页。基因工程酶酶的来源早期酶的生产多以动植物为主要原料（至今仍用）植物：蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等动物：胰蛋白酶、脂肪酶、凝乳酶、溶菌酶等

生产周期长，受到季节、气候等限制目前工业上应用的酶大多采用微生物发酵来生产随着酶制剂应用范围的日益扩大，使得单纯依赖动植物来源的酶已远远不能满足要求。基因工程酶：DNA重组技术，蛋白质工程技术基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第五十二页，共八十一页。基因工程酶基因工程酶是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学相结合的产物。其构建主要包括三个方面：基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶1、酶基因的克隆和表达利用基因工程菌生产药用酶2、酶基因的遗传修饰

突变酶3、酶的遗传设计合成自然界中没有的酶蛋白质工程第五十三页，共八十一页。核酶与脱氧核酶基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第五十四页，共八十一页。核酶与脱氧核酶锤头型核酶基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第五十五页，共八十一页。核酶与脱氧核酶发夹型核酶基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第五十六页，共八十一页。核酶与脱氧核酶脱氧核酶基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第五十七页，共八十一页。核酶与脱氧核酶基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第五十八页，共八十一页。核酶与脱氧核酶基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第五十九页，共八十一页。抗体酶机体免疫系统可产生108-1010不同的抗体分子，抗体分子多样性赋予它几乎无限的识别能力，因此将抗体开发成适合特定用途的酶很有意义1969年，Jencks根据Pauling的化学反应过渡态理论预言，如果找到针对某个反应过渡态的抗体，将其加入到该反应体系中，就可观察到这个抗体对相应化学反应的催化效应基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第六十页，共八十一页。抗体酶1975年，单克隆抗体制备技术的出现为抗体酶制备技术的开发铺平了道路1986年，美国加州Lerner和Schultz领导的研究小组同时报道了成功制备出具有催化能力的单克隆抗体——催化抗体（catalyticantibody），也叫抗体酶（abzyme）迄今已成功地开发出天然酶所催化的6大类酶促反应和数十种类型的常规反应的抗体酶基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第六十一页，共八十一页。抗体酶抗体酶具有双重功能：识别抗原靶目标及特定的催化功能，在医疗上有着广泛的应用：1、设计抗体酶杀死特殊的病原体2、抗体酶活化处于靶部位的药物前体，以降低药物毒性，增加其在体内的稳定性基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第六十二页，共八十一页。抗体酶例1：Landry等获得可催化可卡因降解的单克隆抗体，可用于戒毒，阻断可卡因上瘾基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第六十三页，共八十一页。抗体酶例2：抗癌药物5FdU（5-氟脱氧尿嘧啶）不但抑制肿瘤细胞的DNA合成，也抑制正常细胞的DNA合成，毒性很大，然而5FdU的前体化合物却是无毒的。当5FdU的前体化合物遇到识别肿瘤细胞的抗体酶，才会释放出有毒的5FdU，杀死该部位的肿瘤细胞。基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第六十四页，共八十一页。抗体酶5FdU前体5FdU基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第六十五页，共八十一页。有机相酶反应基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第六十六页，共八十一页。有机相酶反应可以用来制备手性药物手性化合物，光学活性化合物——具有旋光性质生物体内的手性环境氨基酸、蛋白质：L-多糖、核酸中的糖类：D-手性药物：进入人体后，药理和生理作用与体内靶分子之间的手性匹配和分子识别能力有关。基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第六十七页，共八十一页。有机相酶反应60%40%10%90%基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第六十八页，共八十一页。有机相酶反应基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第六十九页，共八十一页。有机相酶反应许多手性药物的对映体具不同的药理作用1992年，FDA明确提出对手性药物的要求单一对映体手性药物研究新药中单一对映体占绝大多数II/III临床——80%为手性药物基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第七十页，共八十一页。人工模拟酶对热敏感、稳定性差和来源有限等缺点限制了酶的应用，1980S以来，研究和开发新催化剂——人工模拟酶人工模拟酶（enzymesofartificialimitation），简称人工酶或模拟酶，就是根据酶的作用机理，用人工方法合成的具有催化活性（底物结合部位和催化中心）的非蛋白质结构的化合物。基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第七十一页，共八十一页。人工模拟酶成功的例子：丝氨酸蛋白水解酶已可以用小分子化合物来模拟；在合成的聚乙烯亚胺上引入十二烷基和咪唑基，所形成的芳香硫酸酯酶比天然酶活力高100倍。基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第七十二页，共八十一页。人工模拟酶环糊精（cyclodextrin，简称CD），它是由多个D-葡萄糖1，4-糖苷键结合而成的一类环状低聚糖，略呈锥形的圆筒，其伯羟基和仲羟基分别位于圆筒较小和较大开口端。外侧亲水：羟基可与多种客体形成氢键内侧疏水性：C3，C5上的氢原子和糖苷氧原子组成疏水性空腔，能包结多种客体分子，很类似酶对底物的识别。基因工程酶核酶与脱氧核酶抗体酶有机相酶反应人工模拟酶第七十