HLJ在肝细胞癌组织中的表达及生物学意义

第一章前言

肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）是严重威胁我国人民健康、临床上最常见的恶性肿瘤之一，具有高度的侵袭转移性，易发生肝内外的复发转移，预后恶劣。据统计全世界每年的新发病例30-100万，死亡病例与发病病例之比几乎达1：1[1]，而我国的肝细胞癌死亡率列全球首位[2]。经数十年不懈努力，肝癌临床研究取得了许多重大进展，部分肝癌病人因早期发现、早期诊断、早期治疗及综合治疗而获得较长期生存，但大部分病人确诊时已属中晚期，失去手术机会；而即使获得手术切除机会的患者其复发、转移率也相当高，加上肝癌本身对放疗、化疗的敏感性甚差，迫切需要研究和发展新的诊疗方法[3]。

现在是1页\一共有31页\编辑于星期一随着分子生物学技术的不断发展，肝癌转移复发预测分子水平的研究成为近年研究的重点和热点，进一步研究肝癌转移的基因改变、寻找新的肝癌异常表达或缺失基因发生，从基因水平认识肝细胞的发生、发展和转移的分子机制，从而为早期诊断治疗肝癌，判断预后，实行针对患者个体生物学特点的治疗提供新的方法。现在是2页\一共有31页\编辑于星期一热休克蛋白（Heatshockprotein，Hsp）是广泛存在于生物界中具有高度保守性质的蛋白质，在应激状态下可以被诱导表达[4]，根据同源程度及分子量大小可分为Hsp110、Hsp90、Hsp70和Hsp60、Hsp40、小分子Hsp(22～23kD)以及泛素等几个家族。热休克蛋白家族在细胞生长、发育、分化、基因转录等功能方面发挥重要的作用，其主要的生物学功能是在应激状态下保护细胞生命活动必需的蛋白质。热休克蛋白与不同功能的多种蛋白质形成复合体，并通过其结合和解离参与靶蛋白的折叠、亚基间装配、细胞内运输及降解，以调节靶蛋白的活性和功能，故热休克蛋白又被称作“分子伴侣”(molecularchaperone)[5-8]。近年发现HSP与肿瘤发生发展、生物学行为及其预后有较密切的关系[9]。现在是3页\一共有31页\编辑于星期一HLJ1是最新发现的Dnaj类Hsp40家族成员之一，定位于人类染色体1P31.1，HLJ1蛋白由337个氨基酸残基构成，分子量约40kDa，属于Hsp40家族[10]。HLJ1基因内含有一个能驱动其转录活性的区域，序列分析显示此区缺失TATA盒，存在一个CCAAT盒，并有四个转录因子YY1（Yin-Yang-1，又称NF-E1）的结合位点，这对调控HLJ1的表达是非常重要的[11]。现在是4页\一共有31页\编辑于星期一最新的研究证实，HLJ1参与了STAT1和P21WAF1信号路径，能够上调STAT1、P21WAF1的表达，同时下调CyclinD1的表达[12]。P21WAF1的表达上调和CyclinD1的表达下调能够减缓细胞分裂和肿瘤细胞的生长[13-17]。此外，HLJ1能上调钙粘蛋白E的表达并能抑制CD44的表达，从而降低细胞的侵袭力[18-19]。Chen等进行了筛选肿瘤侵袭和转移相关基因的实验，用基因芯片技术检测了一个肺癌侵袭性细胞系模型，发现HLJ1跟肿瘤侵袭转移相关。现在是5页\一共有31页\编辑于星期一HLJ1是一个新的抑癌基因，具有抑制细胞生长、增殖、侵袭、迁移，促进凋亡、参与细胞周期调控等作用，并与肿瘤的复发、转移密切相关。但目前国内外有关HLJ1在肝细胞癌中表达情况，HLJ1与肝细胞癌临床病理特征的关系等研究尚未见报道。因而，本课题将研究HLJ1在原发性肝细胞癌中的表达情况及其与肝细胞癌临床病理特征的关系。现在是6页\一共有31页\编辑于星期一第二章材料和方法2.1材料2.1.1标本收集及临床病理资料组织标本取自2005年3月至2006年12月中南大学湘雅医院外科手术切除的32例肝细胞癌组织和32例相对应的癌旁组织（距肿瘤边缘≥2cm），标本离体后迅速取材，一部分置入液氮速冻后转入-70℃超低温冰箱存放。在取材时务必注意避开坏死组织，全部病例均未接受包括肝动脉化疗栓塞术等在内的多种肿瘤治疗。现在是7页\一共有31页\编辑于星期一32例HCC中男性27例，女性5例，年龄27~62岁，中位年龄41岁；其中合并肝硬化的20例（62.5％），无肝硬化的12例（37.5％）；直径大于5cm的共21例（65.6％），小于或等于5cm的共11例（34.4％）；有静脉浸润的16例（50.0％），无静脉浸润的16例（50.0％）；单结节的21例（65.6％），多结节的11例（34.4％）；Edmonson分级Ⅰ－Ⅱ级的12例（37.5％），Ⅲ－Ⅳ级的20例（62.5％）。所有标本均经病理组织学检查证实诊断。现在是8页\一共有31页\编辑于星期一2.1.2主要试剂TRIZOL晶美生物科技公司RT-PCR试剂盒（DR019A）大连宝生物公司2.1.3引物所有引物均由上海英俊公司负责合成2.1.4主要仪器移液枪 Eppendorf低温高速离心机 EppendorfPCR仪 PerkinElmerDNA凝胶电泳设备 BioRad凝胶电泳成像分析仪BioRad现在是9页\一共有31页\编辑于星期一2.2方法2.2.1实验技术路线组织标本（32对）提取组织总RNART-PCR临床病理资料分析结果得出结论相关性分析现在是10页\一共有31页\编辑于星期一2.2.2RT-PCR检测法2.2.2.1RT-PCR引物设计分别从GeneBank中获取HLJ1和GAPDH的mRNA全长序列（详见附录）。利用Primer5引物设计软件设计引物。HLJ1引物：Forward：5’-ATATTGTGAAACCCGGAATG-3’Reverse：5’-TTTGCCTATTTATTTGACCC-3’产物长度325bpGAPDH引物：Forward：5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’Reverse：5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’产物长度500bp现在是11页\一共有31页\编辑于星期一2.2.2.2组织总RNA提取

取肝癌组织和癌旁组织各100mg/mlTrizol，置于消毒硏砵中，加入液氮使之易于研磨粉碎。研磨粉碎后，加入1mlTrizol，室温放置，解冻后继续研磨成浆。要研磨细致，不要留有组织残渣。成浆后吸入1.5mlEP管。冰上放置5分钟。加入0.2ml

氯仿，用力震荡30s，冰上静置5min。4℃12000转/min离心15min。取上清夜于另一EP管。加异丙醇0.5ml，震荡1分钟，冰上静置15min。4℃12000转/min离心10min，倒掉液体。加75％的酒精1ml，震荡1min。4℃7500转/min离心5min，倒掉液体，重复此步骤一次。短离心，将离心出来的残液用小Tip头吸净。EP管置于滤纸上晾干。根据产量用DEPC处理的水30µl-50µl，溶解RNA。琼脂糖凝胶电泳并测定OD值，分析提取RNA的纯度和浓度。现在是12页\一共有31页\编辑于星期一2.2.2.3第一链cDNA的合成逆转录合成第一链cDNA，操作按RT-PCR试剂盒（DR019A）说明书进行。整个操作过程中要戴口罩帽子，并始终在冰上操作，采用20µl反应体系。2.2.2.4PCR扩增新合成的引物12000转/min短暂离心，用消毒双蒸水稀释引物至100µM，将合成的第一链cDNA稀释至100µl，取10µl作为模板，加引物PCR扩增，采用20µl反应体系，进行30个循环。

现在是13页\一共有31页\编辑于星期一2.2.2.5电泳及分析结果

反应结束后取PCR产物4µl加2µl6×上样缓冲液，于1.5％的琼脂糖凝胶电泳（100V，15min），采用凝胶自动分析仪计算产物的光密度值。2.2.3临床病理特征研究

每例标本均需记录详细的临床病理特征，包括性别、肝硬化有无、结节数、肿瘤直径；肝癌组织有无静脉浸润及细胞分化程度资料由湘雅医院病理科提供。HCC细胞分化根据Edmonson-Steiner分级而定[21]：Ⅰ－Ⅱ级癌细胞在形态上较接近正常肝细胞，分化较高；Ⅲ－Ⅳ级癌细胞胞核大而深染，胞浆少，分化低。镜下见血管内有癌细胞浸润伴血管内皮染色不连续或见管腔内有癌栓存在，即为静脉浸润。肿瘤直径为肿瘤组织的最大直径。（见图4）现在是14页\一共有31页\编辑于星期一2.3实验设计与分组临床标本按取材部位不同分为HCC组（n1=32）和PCLT组（n2=32）。检测上述两组中HLJ1mRNA的表达，比较组间HLJ1mRNA的表达水平的差异。根据RT-PCR结果，以32例肝细胞癌中HLJ1mRNA表达量的均数X1与对应的32例癌旁组织中HLJ1mRNA表达量的均数X2的比值：X1/X2=0.61为界值，分为HLJ1低表达组(n1=18)和高表达组(n2=14)。每组再根据性别、肝硬化有无、肿瘤结节数目、肿瘤直径、有无静脉浸润、HCC细胞分化程度等临床病理特征分组，形成四方表格资料，比较HLJ1表达水平与HCC临床病理特征间的关系。现在是15页\一共有31页\编辑于星期一2.4统计分析方法全部数据采用SPSS11.5统计软件包进行统计学分析，计量资料的均数用X±SD表示，计量资料比较采用非配对t检验。计数资料的组间比较采用Fisher’s确切概率法。以P≤0.05作为差异具有显著性意义的界值。

现在是16页\一共有31页\编辑于星期一第三章结果3.1RNA质量检测

提取的组织RNA采用琼脂糖凝胶电泳检测，发现18S、28S条带明亮、清晰、锐利（图1）。同时检测了RNA在280nm和260nm的吸光度值，发现OD260/OD280（Ratio，R）比值均位于1.8~2.0之间（表1）。以上检测结果均证实，所提取的组织RNA质量良好，可用于后续的RT-PCR实验。现在是17页\一共有31页\编辑于星期一NLHCCPLCTHCCPLCT5S18S28S图1：组织RNA琼脂糖凝胶电泳图NL：正常肝组织；HCC：肝癌组织；PLCT：癌旁组织现在是18页\一共有31页\编辑于星期一表1：组织RNA在280nm和260nm的吸光度值及吸光度比值样品名称吸光度值比值260nm280nmNL37.0119.2931.92HCC60.49930.9861.95PLCT60.85331.491.93HCC62.45232.3271.93PLCT47.14824.1561.95现在是19页\一共有31页\编辑于星期一3.2HLJ1在HCC和PLCT中的mRNA表达水平

32例肝癌组织及32例对应的癌旁组织的RT-PCR结果显示，HCC组织中HLJ1mRNA的表达水平为1.18±0.82，PLCT组织中HLJ1mRNA的表达水平为1.92±1.15，HCC组织中HLJ1的mRNA表达水平显著性低于癌旁组织，差异具有显著的统计学意义（P<0.05）。（图2、图3）现在是20页\一共有31页\编辑于星期一HCCHCCPLCTPLCTHLJ1GAPDH325bp500bp图2：HLJ1RT-PCR结果琼脂糖凝胶电泳图HCC：肝癌组织；PLCT：癌旁组织HCCPLCT相对表达量图3：HLJ1RT-PCR统计分析直方图HCC：肝癌组织；PLCT：癌旁组织现在是21页\一共有31页\编辑于星期一3.3HLJ1mRNA表达与肝细胞癌临床病理特征的关系

结果显示，两者在肿瘤细胞分化程度（P=0.010）、静脉浸润（P=0.001）方面的差异具有显著性意义，而在性别、肝硬化有无、肿瘤结节数目和肿瘤直径方面无显著性差异。（图4，表2）现在是22页\一共有31页\编辑于星期一图4：肝癌细胞分化程度和静脉浸润的HE染色图（×400倍）A：正常肝组织；B：Edmonson-Steiner分级Ⅰ级；C：Edmonson-Steiner分级Ⅱ级；D：Edmonson-Steiner分级Ⅲ级；E：Edmonson-Steiner分级Ⅳ级；F：镜下静脉浸润，箭头所示。

ABCDEF现在是23页\一共有31页\编辑于星期一现在是24页\一共有31页\编辑于星期一第四章讨论

我们采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法，检测了32例肝癌组织及32例对应的癌旁组织中的HLJ1基因的mRNA表达水平。RT-PCR结果显示HCC组织中HLJ1mRNA的表达水平为1.18±0.82，PLCT中HLJ1mRNA的表达水平为1.92±1.15，两者间存在显著性差异，HCC组织中HLJ1mRNA表达水平显著下调（P<0.05）。Tsai等运用RT-PCR法测量HLJ1在71例非小细胞肺癌病人的癌与癌旁组织中的表达，亦发现HLJ1在癌组织中的表达低于癌旁组织，这与我们的研究结果一致[22]。研究证实，在HLJ1基因里有一个能驱动其转录活性的区域，序列分析显示此区缺失TATA盒，存在一个CCAAT盒，并有四个转录因子YY1（Yin-Yang-1，又称NF-E1）的结合位点，这也许对调控HLJ1的表达是重要的，转录因子YY1能够增强HLJ1启动子活性，过表达YY1能增加HLJ1的表达[23]。HLJ1基因在肝癌组织中下调表达，亦可能是通过转录因子YY1的转录调控所致，这有待于进一步的深入研究。现在是25页\一共有31页\编辑于星期一HCC的侵袭转移是一个多因素和多步骤的过程，其本身的各种生物学特性，比如细胞分化程度和静脉浸润等也决定了侵袭转移潜能的不同[24-30]。因此，我们分析了HLJ1mRNA表达水平与HCC临床病理特征之间的关系，探讨其可能的生物学意义。本研究中我们观察到HLJ1mRNA在分化程度高的HCC中表达要高于分化低者（P=0.010），在无静脉浸润的HCC中表达要高于有静脉浸润者（P=0.001）。肿瘤细胞的分化程度是判断HCC恶性程度的标准[21]，其分化程度越高，肿瘤细胞的形态和功能越接近正常组织，其恶性表现也就越低，表现为肿瘤的侵袭力和转移潜能显著降低。HCC的静脉浸润与HCC的血行转移密切相关，也是HCC恶性程度高，侵袭转移能力强的表现[24]。现在是26页\一共有31页\编辑于星期一HLJ1基因可能参与了肝癌的发生发展，并可能在肝癌细胞分化、侵袭转移中发挥重要作用。Tsai等[22]研究证实，低侵袭性肺腺癌中的HLJ1的mRNA表达水平比高侵袭性肺腺癌高。实时定量PCR测量发现，