应用生物化学

应用生物化学第1页，共44页，2023年，2月20日，星期六离心技术（centrifugaltechnique）

是根据颗粒在匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为发展起来的一种分离分析技术。第2页，共44页，2023年，2月20日，星期六一、离心技术的应用

1.用于生物、医学、化学等实验室分析研究的，转速从每分钟几千到几万转以上，此类技术的使用目的在于分离和纯化样品，以及对纯化的样品有关性能进行研究。

2.用于工业生产的，如化工、制药、食品等工业大型制备用的离心技术，转速都在每分钟5000转以下。第3页，共44页，2023年，2月20日，星期六第4页，共44页，2023年，2月20日，星期六第5页，共44页，2023年，2月20日，星期六二、离心机基本组件1.低速离心机

转子速度控制系统最高转速在6000rpm以下实验室中常用于分离制备。2.高速离心机

系列转子速度控制系统温控系统最高转速在25,000rpm以下常用于生物大分子的分离制备3.超速离心机系列转子速度控制系统温度控制真空系统常用于分离亚细胞器、病毒粒子、DNA、RNA和蛋白质分子。第6页，共44页，2023年，2月20日，星期六

转子(Rotor)固定角式转子(fixed-anglerotor)水平转子(Swing-bucketrotor)垂直转子(verticalrotor)带状转子(zonalrotor)连续转子(continuousrotor)第7页，共44页，2023年，2月20日，星期六1.固定角式转子离心管在离心机中放置的位置与旋转轴心形成一个固定的角度,角度变化在14-40°之间。第8页，共44页，2023年，2月20日，星期六固定角式转子第9页，共44页，2023年，2月20日，星期六角式转子的特点：（1）重心低,转速可较高（2）样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管的直径;（3）“管壁效应”：

有一定的角度,在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀,此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。

第10页，共44页，2023年，2月20日，星期六2.水平转子（1）转子静止时,处在转子中的离心管中心线与旋转轴平行；（2）转子旋转加速时,离心管中心线由平位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋转轴成90°角。第11页，共44页，2023年，2月20日，星期六第12页，共44页，2023年，2月20日，星期六第13页，共44页，2023年，2月20日，星期六水平转子的特点：

（1）转子的重心位置较高（2）样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径（3）对于多种成分样品分离特别有效（4）常用于速率区带离心和等密度离心第14页，共44页，2023年，2月20日，星期六三、基本原理1.转速

（1）rpm

RevolutionsPerMinute为每分钟转速（转/分）（2）ω角速度：每秒转过的弧度数(弧度/秒)

1弧度即为弧长等于半径的圆弧所对的圆心角

ω＝2πrpm60第15页，共44页，2023年，2月20日，星期六2.离心力Centrifugalforce(F)

F离心力=mω2rm:质量

ω:旋转角速度

r：旋转体离旋转轴的距离第16页，共44页，2023年，2月20日，星期六3.相对离心力Relativecentrifugalforce(RCF)RCF就是实际离心力转化为重力加速度的倍数，通常用×g表示

RCF＝F离心力/F重力＝mω2r/m·g=ω2r/g

＝

1.118×10-5×(rpm)2×r半径第17页，共44页，2023年，2月20日，星期六4.离心转速换算公式（rpm与g）离心速度1000rpm与1000g有什么区别？（Eppendorf5415C1000g对应3066rpm）（BOECOM-241000g对应3222rpm）g（RCF）＝1.118×10-5×(rpm)2×r半径运用离心力列线图换算rpm与g第18页，共44页，2023年，2月20日，星期六离心力列线图第19页，共44页，2023年，2月20日，星期六5.沉降系数

Sedimentationcoefficient(S)样品颗粒的大小

形状

密度

溶剂的粘度、密度

离心加速度

S=

X1:离心前粒子离旋转轴的距离

X2:离心后粒子离旋转轴的距离2.1×102logX2/X1rpm2(t2-t1)第20页，共44页，2023年，2月20日，星期六6.沉降速度Sedimentationvelocity定义：指在强大离心作用下，单位时间内物质运动的距离。V=

ω2rd2(ρp-ρm)18ηd：球形粒子的直径ρp：粒子的密度ρm：介质的密度η：流体介质的粘度数r：粒子距离心轴垂直半径第21页，共44页，2023年，2月20日，星期六四、离心分离方法制备型超高速离心机的几种分离方法：A．差速离心：

速率区带法（ratezonal）B．密度梯度离心法：

等密度离心法（isopycnic）第22页，共44页，2023年，2月20日，星期六

A．差速离心：利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别,在同一离心条件下,沉降速度不同,通过不断增加相对离心力,使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。差速离心的特点是操作简单，但分离纯度不高。第23页，共44页，2023年，2月20日，星期六主要细胞成分的大小细胞核

4-12m质膜

3-20m高尔基体

1-2m线粒体

0.4-2.5m溶酶体/过氧化物酶

0.4-0.8m微粒小泡

0.05-0.3m第24页，共44页，2023年，2月20日，星期六匀浆组织的差速离心（Ⅰ）1000g/10min去掉上清3000g/10minetc.第25页，共44页，2023年，2月20日，星期六匀浆组织的差速离心（Ⅱ）组织匀浆

–1000gfor10min上清

from1–3000gfor10min上清

from2–15,000gfor15min上期

from3–100,000gfor45min1000g沉淀:细胞核,质膜层3000g沉淀:大线粒体,高尔基管15,000g沉淀:小线粒体,溶酶体,过氧化物酶100,000g沉淀:微粒

第26页，共44页，2023年，2月20日，星期六差速离心（Ⅲ）固定角转子:短沉淀路径Fmax>Fmin水平转子:长沉淀路径Fmax>>>Fmin第27页，共44页，2023年，2月20日，星期六密度屏障不连续梯度

连续梯度B、密度梯度离心第28页，共44页，2023年，2月20日，星期六对不同粒子怎样进行密度梯度分离?低密度高密度中等密度第29页，共44页，2023年，2月20日，星期六ρp=ρm即

ρp-ρm=0V=0

粒子平衡

ρp>ρm

即ρp-ρm>0V>0

粒子达到某一位置后就达到平衡

ρp<ρm即ρp-ρm<0V<0

粒子逆着离心方向上浮V=

ω2rd2(ρp-ρm)18η从方程式预测

第30页，共44页，2023年，2月20日，星期六密度梯度离心过程15234第31页，共44页，2023年，2月20日，星期六1）速率区带法（ratezonal）根据样品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速率（S）分离。将所需分离的样品小心地加至密度梯度溶液的顶部。样品在梯度溶液表面形成一负梯度。由于不同大小的粒子在离心力作用下，在梯度中移动的速度不一样，所以经过离心后会形成几条分开的样品区带。注意：样品粒子的密度（ρp）必须大于梯度液注中任一点的密度（ρm

）。离心过程必须在区带到达管子底部前停止。50000rpm×15min50000rpm×20minSTOP第32页，共44页，2023年，2月20日，星期六2）等密度离心法（isopycnic）根据粒子的不同密度来分离。离心过程中，粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带。

密度梯度的选择要使梯度的范围包括所有待分离粒子的密度。样品可以在密度梯度液粒上面或均匀分布在密度梯度中。经离心后，样品粒子达到它们的平衡点。注意：平衡后粒子的分离完全由其密度决定，与时间无关。

第33页，共44页，2023年，2月20日，星期六123粒子密度（ρp）<最大介质密度（ρm

）

等密度离心法第34页，共44页，2023年，2月20日，星期六不连续梯度等密度离心法的离心结果连续梯度

密度屏障III第35页，共44页，2023年，2月20日，星期六五.

梯度溶液的制备(一).梯度材料的选择原则:1、与被分离的生物材料不发生反应。2、可达到要求的密度范围,且在所要求的密度范围内,粘度低,渗透压低,离子强度和pH变化较小。3、不会对离心设备发生腐蚀作用。4、容易纯化,价格便宜或容易回收。5、浓度便于测定,如具有折光率。第36页，共44页，2023年，2月20日，星期六（二）常用的梯度材料：

糖类:

蔗糖、甘油、聚蔗糖、右旋糖酐、糖原无机盐类:CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、NaCl、KBr等有机碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等硅溶胶:

Percoll。蛋白质:牛血清白蛋白非水溶性有机物:氟代碳等第37页，共44页，2023年，2月20日，星期六(三).梯度材料的应用范围

1.蔗糖:

水溶性大，性质稳定，渗透压较高，最高密度可达1.33g/ml,价格低，容易制备。常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料制备有较大的渗透压,不宜用于细胞的分离。第38页，共44页，2023年，2月20日，星期六2.聚蔗糖:

商品名Ficoll,渗透压低，粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞

第39页，共44页，2023年，2月20日，星期六

3.氯化铯:

离子性介质，水溶性大，最高密度可达1.91g/ml重金属盐类,在离心时形成的梯度有较好的分辨率。被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，价格较贵。第40页，共44页，2023年，2月20日，星期六

4.卤化盐类:

Br和NaCl可用于脂蛋白分离KI和NaI可用于RNA分离,其分辨率高于铯盐NaCl梯度可用于分离脂蛋白NaI梯度可