碱性磷酸酶比活力测定

碱性磷酸酶比活力测定第1页/共13页碱性磷酸酶比活力的测定第2页/共13页1.学习分光光度法测定的原理和方法2.掌握碱性磷酸酶比活测定的方法一、目的要求第3页/共13页二、原理（一）、比色分析法光的互补示意图1.物质的颜色和波长：可见光：波长（λ）400—760nm紫外光：λ小于400nm红外光：λ大于760nm2.溶液的颜色和光吸收的关系：溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。第4页/共13页3.物质浓度，液层厚度与光吸收的关系（Lambert--Beer定律）：当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D）与溶液的浓度（C），液层的厚（L）以及入射光的强度（I0）有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定律。第5页/共13页4.待测溶液浓度的计算：（1）标准管法：在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D）值，然后计算：C未知=（D未知/D标准）×C标准（2）标准曲线法：分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（D）值。在一定浓度范围内，溶液浓度（C）与其光密度（D）之间呈直线关系。以各管D为纵坐标，C为横坐标，绘制标准曲线。待测溶液D值测出后，在曲线上查出C。第6页/共13页1%浓度，1cm厚度溶液中测得：K=E1cm1%或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K=ξC=D/E1cm%,或C=D/ξ常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度,带入上式即可求得C。（3）消光系数法：第7页/共13页（二）、酶活力在37C下，以5mmol/LpNPP为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2mmol/LMg2+的测活体系中每分钟催化产生1mol/LpNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。第8页/共13页酶活性测定前处理1、2号样品稀释50倍（用洗脱液稀释）3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释）4号样品不稀释（用洗脱液稀释）蛋白浓度测定前处理1、2号样品稀释100倍（用洗脱液稀释）3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释）4号样品对倍稀释（用洗脱液稀释）第9页/共13页12支试管，1-4做两组平行测定管，01-04作为空白对照管号空白（01-04）1-12-23-34-45mMpNPP(mL)各0.2mL

Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL

H2O(mL)各0.50mL混匀，37℃，5分钟酶液（mL）/各0.1mL37℃，精确反应10分钟0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mL酶液（mL）0.1mL

OD405nm第10页/共13页蛋白浓度测定1.测定100μg/mL牛血清白蛋白溶液的OD值；2.将稀释后的样品在280nm下测定吸光度；3.以洗脱液作空白。蛋白浓度按下式计算：第11页/共13页数据处理单位时间0.1