微生物工业菌种与培养基

微生物工业菌种与培养基第一页，共170页。（1）所需培养基易得，价格低廉；（2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等）（3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短（4）单产高（选择野生型、营养缺陷型或调节突变株）（5）抗病毒能力强（6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好（7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保证安全微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：

第二页，共170页。二、工业上常用的微生物微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工等方面。微生物的代谢产物多，已超过1300多种，而用于大规模工业生产的不足100多种；微生物酶有近千种，而工业上用的不过40－50种。微生物具有巨大的潜力可挖掘。工业上常用菌种举例：第三页，共170页。

1、常用的细菌大肠杆菌应用：对谷氨酸定量分析，生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。

第四页，共170页。

乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作

第五页，共170页。枯草芽孢杆菌应用：生产淀粉酶第六页，共170页。2、酵母菌种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母红酵母、面包酵母应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪第七页，共170页。第八页，共170页。啤酒酵母红酵母第九页，共170页。面包酵母第十页，共170页。3、霉菌曲霉属应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶第十一页，共170页。应用：酱油、酱类（淀粉酶）第十二页，共170页。米曲霉应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲和酱油制曲第十三页，共170页。应用：生产甲义丁二酸第十四页，共170页。

毛霉应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作第十五页，共170页。根霉种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉应用：酿酒第十六页，共170页。第十七页，共170页。青霉菌第十八页，共170页。应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶第十九页，共170页。

4、放线菌种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素第二十页，共170页。三、生产用菌种的保藏及选育（一）菌种保藏

1、目的：提高菌种存活率，减少菌种的变异，保持原来优良的生产性能。

第二十一页，共170页。2、原理：根据菌种的生物生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖处于休眠状态。

保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠的环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，以达到降低其代谢活动，延长保存期的目的。第二十二页，共170页。

3、菌种保藏的方法：斜面保藏法、矿物油保藏法、砂土保管保藏法、真空冷冻干燥法、冷冻法、液态真空干燥法、琼脂穿刺封口保藏法、曲法保藏、麦粒保藏法、无水硅胶保藏法。

（1）斜面保藏法：在4℃左右的冰箱保藏，每隔一定时间进行移植培养后再继续保藏，如此反复。优点：方法简单、存活率高，具有一定的保藏效果。缺点：菌种仍有一定的强度的代谢活动条件，保存时间不长，传代多，菌种容易变异。适用菌种：细菌、酵母、防线菌、霉菌第二十三页，共170页。（2）矿物油保藏法将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层高于斜面末端1cm，然后放于冰箱中保存。适用菌种：适用于除细菌外的其它菌种（3）砂土管保藏法利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两步。适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对干燥敏感的细菌（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以及酵母不适用。第二十四页，共170页。（4）真空冷冻干燥法先在菌悬液加入保护剂（如：脱脂牛奶、血清等）然后在较低温度下使成冻结状态，最后减压抽干。

特点：它是菌种保藏中最有效的一种方法。保存期可达一年至数十年之久，并且存活率高，变异率低。单使手续麻烦，需要一定的设备。

适用菌种：对于不长孢子或长的很少孢子的真菌保藏效果不佳。第二十五页，共170页。（5）其他保藏方法冷冻法：分低温冷冻（－20℃）与超低温冷冻（－196℃）两种。适用于细菌、真菌、病毒等的保藏液态真空干燥法：菌体在恒温液态条件下进行真空干燥。适用于包括细菌、病毒，特别适用于冷冻干燥保藏效果不佳的菌种。琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产孢子细菌的保藏第二十六页，共170页。曲法保藏：将麸皮与水按比例混合，灭菌后接入菌种，待孢子长成后即为成曲。将试管放入盛有氯化钙的干燥器中，干燥后低温保藏。适用于有大量孢子的霉菌和某些放线菌的保藏。麦粒保藏法：麦粒灭菌后接入菌液，培养有菌丝或孢子时，置通风、避光、干燥处保藏。适用于一些放线菌、芽孢杆菌、酵母的保藏。无水硅胶保藏法：将细胞悬浮液和等体积的脱脂灭菌牛奶混匀，加入装有无水硅胶的试管中，然后将试管放于干燥器内，室温或4℃保藏。对于细菌和真菌效果都较好。第二十七页，共170页。国内外菌种保藏机构菌种是一个国家的重要资源，世界各国对菌种的保藏都极为重视。世界上有700多家菌菌种保藏机构，其中国际知识产权组织承认的法定的保藏机构仅有28家。第二十八页，共170页。

1、我国的微生物菌种保藏机构1）普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）中科院微生物所，北京，中科院武汉病毒研究所2）农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）中国农业科学院土壤肥料研究所，北京（ISF）3）工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）中国食品发酵工业科学研究院，北京，（IFFI）4）医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）中国医学科学院皮肤病研究所，南京卫生部药品生物制品检定所，北京中国医学科学院病毒研究所5）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）中国医学科学学院抗生素研究所，北京四川抗生素工业研究所，成都华北制药厂抗生素研究所，石家庄6）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）农业部兽医药品检察所，北京第二十九页，共170页。2、国外主要的微生物菌种保藏机构

1）美国标准菌种收藏所（ATCC）2）美国冷泉港研究所（CSH）3）日本东京大学应用微生物研究所（IAM）4）日本东京科研化学有限公司（KCC）5）日本大阪发酵研究所（IFO）6）英国国立标准菌种收藏所（NCTC）7）美国国立卫生研究所（NIH）8）美国农业部北方开发利用研究部（NRRL）第三十页，共170页。（二）菌种选育1、选育的目的改善菌种的特性，使产量提高，改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等2、选育的方法：A、自然选育；B、生产选育；第三十一页，共170页。

C、诱变育种；

1、常用的诱变剂：2、诱变育种中需要考虑的若干因素（1）选择合适的出发菌株产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广（2）复合诱变剂的使用单一诱变剂重复使用后突变的效果不好，可用复合诱变剂来扩大诱变幅度，提高诱变效果。第三十二页，共170页。（3）诱变剂量的选择凡是能增加变异的幅度又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量。（4）变异菌株的筛选第三十三页，共170页。3、新诱变因子及诱变技术（1）低能离子束诱变：离子注入是20世纪80年代兴起的一种表面处理技术。这种相互作用过程大致分为能量沉积、动量传递、离子注入和电荷交换等四个原初反应过程，在10－19－10－13s中间时发生。荷能离子注入除具有Y射线能量沉积引起机体损伤的特征外，还具有动能交换产生的级联损伤，表现为遗传物质原子转移、重排或基因的缺失。还有慢化离子、移位原子和本底元素复合反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造成的损伤。离子注入通常采用N+、H+、Ar＋。离子注入生物学效应显示出一些不同于辐射生物学的特征，相当于物理和化学诱变两者相结合的复合诱变效应（2）激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变（3）原生质体诱变第三十四页，共170页。D、细胞工程育种E、基于代谢调节的育种；组成型突变株的选育、抗分解调节突变株的选育、营养缺陷型等等F、代谢工程育种改变代谢途径、扩展代谢途径、转移或构建新的代谢途径第三十五页，共170页。G、基因重组育种；H、蛋白质工程育种；定点突变技术、定向进化技术（易错PCR、DNA随机重组）；J、组合生物合成育种；第三十六页，共170页。表型的确定基因基础特定生物体获得希望表型的基因修饰生物K、反向生物工程育种第三十七页，共170页。举例：1、米曲霉高产酸性蛋白酶菌株的选育2、温度诱变选育透明质酸产生菌3、不同诱变方法对米曲霉酶系的影响第三十八页，共170页。四、防止菌株衰退的措施菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁殖能力降低、发酵产品的得率降低1、衰退的可能原因（1）、基因突变（2）、分离现象第三十九页，共170页。2、防止菌种衰退的方法

A、从菌种选育方面考虑B、尽量减少传代次数C、创造良好的培养条件D、利用不易衰退的细胞传代E、采用有效的菌种保藏方法第四十页，共170页。3.菌种复壮方法

①纯种分离法；②淘汰已衰退的个体③采用其它方法：诱变因素处理，再进行单菌落分离；选择合适的培养基第四十一页，共170页。第二节种子扩大培养

一、优良种子应具备的条件1、菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短。2、菌种生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和种子培养液的特性等符合要求第四十二页，共170页。3、菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求4、无杂菌污染，保证纯种发酵5、菌种适应性强，能保持稳定的生产能力第四十三页，共170页。二、种子扩大培养的任务和培养类型1、任务：获得大量的活力强的种子，以便在发酵罐的发酵培养过程中尽可能地缩短迟滞期。根据菌种生长速度快慢来决定扩大培养的级数；放线菌（生产抗生素）三级放大，（其中链霉素须四级扩大）；细菌生长较快，用二级放大培养（斜面菌种→一级种子摇床培养→二级种子罐培养→发酵罐）第四十四页，共170页。第四十五页，共170页。2、培养类型（1）静置培养法（厌气性发酵）；（2）通气性培养（好气性发酵）；作为种子扩大培养的方法：①液体培养法（三角瓶摇床震荡或转式培养）；第四十六页，共170页。②表面法培养：液体表层；③固态法培养。第四十七页，共170页。大规模工业生产的培养方法及特点：园盘制曲机A、固体培养（曲法培养）浅盘固体培养深层固体培养第四十八页，共170页。B、液体培养浅盘液体培养液体深层培养：目前几乎所有的好气发酵均采用此法；第四十九页，共170页。C、载体培养：用天然（或人工）多孔材料代替麦麸之类固态基质作微生物生长的载体，营养成分可严格控制。D、两步法液体深层培养：在酶制剂和氨基酸生产中应用较多。控制菌体在不同生长期的条件。（营养生长与代谢产物积累时条件不同）第五十页，共170页。三、影响种子质量的主要因素

1、培养基：主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。

选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。种子培养基是培养菌体的（以菌体增殖为主要目的），应该是糖份少而氮源多些。但种子罐与发酵罐培养基成分趋于一致时，可缩短发酵生产的周期，但在各成分的数量（原料配比上），应根据培养目的而定。第五十一页，共170页。2、种龄与接种量3、斜面冷藏时间4、温度：温度直接影响生长和酶的合成；第五十二页，共170页。5、pH值：对微生物有明显的影响。

各种微生物都有生长和合成酶的最适pH。培养基pH值在发酵时要受菌体代谢的影响。调节方法（使之保持适当的pH值）有三种法：用酸碱溶液中和法；使用缓冲溶液法；使用生理缓冲剂；第五十三页，共170页。6、通气搅拌：（溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用）搅拌：促进氧的溶解与营养物质及代谢产物的分散。通气量的多少以溶解氧的多少来衡定（溶解氧浓度应不低于临界溶氧浓度）。通气过程中，影响溶解氧的因素：菌种（丝状影响最大）；培养基性质；培养阶段；发酵罐的结构；第五十四页，共170页。7、泡沫：危害：影响微生物对氧的吸收；妨碍CO2的排除；减少设备利用率（有效容积减少）；造成跑料，导致染菌；消泡方法：（1）消泡剂：天然动植物油、石油化工矿物油；改性油，表面活性剂（有机硅聚合物）；（2）机械消泡：（3）改变培养基成分：第五十五页，共170页。8、染菌的控制

染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严、菌种不纯；第五十六页，共170页。9、种子罐级数种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于控制，减少染菌；种子罐级数取决于：①种子的性质（生长繁殖性能）；②孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）；③孢子发芽及菌丝繁殖速度；④发酵罐中种子的最低接种量；⑤种子罐与发酵罐的容积比；第五十七页，共170页。在生产中应注意种龄与接种量：种龄：过老过嫩都不好；细菌以对数生长期为宜（霉菌也是）；酵母以二倍体细胞为好；接种量：依据具体的发酵类型和工艺条件而定。第五十八页，共170页。第二章培养基的制备与灭菌第五十九页，共170页。1、培养基的组成？如何选择培养基？2、如何制备培养基？3、如何对培养基进行灭菌？第六十页，共170页。第一节培养基的原材料一、培养基的营养成分及用途

光光能自养自养菌氢、硫、氨化能自养1.能源亚硝酸盐、亚铁盐碳水化合物等有机物石油天然气和石油化工产品（如醋酸）异养菌

功能：生长、繁殖需要；第六十一页，共170页。

碳酸气2.碳源淀粉水解糖、糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等石油、正构石蜡、天然气醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础；第六十二页，共170页。

有机氮：黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、蛋白胨、3.氮源酵母粉、鱼粉、发酵菌丝体、酒糟水等

无机氮：

尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐功能：构成菌体、含氮代谢物；第六十三页，共170页。

磷酸盐、钾盐、钙盐等矿物盐4.无机盐铁、锰、钴等微量元素功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性，调节渗透压，调节pH值，维持氧化还原电位；第六十四页，共170页。5.特殊生长因子：硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等

功能：酶的辅助部分，维持生命活动；第六十五页，共170页。6．发酵的促进剂与抑制剂发酵培养基中某些成分的加入有利于调节产物的形成，而并不促进微生物的生长，这些物质包括前体、促进剂和抑制剂第六十六页，共170页。1）、前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构没有多大的变化，但产物的产量却因加入前体而有较大的提高。

如：在青霉素生产中加入玉米浆，青霉素产量可从20u/mL增加到100u/mL，研究发现玉米浆中的苯乙胺被有限结合到青霉素分子中，从而提高了青霉素G的产量。第六十七页，共170页。2）、促进剂：指那些既不是营养物又不是前体，但却能提高产量的添加剂。比如在酶制剂发酵过程中，加入诱导物、表明活性剂及其它一些产酶促进剂（比如吐温80、植酸、洗衣粉等）第六十八页，共170页。3）、抑制剂：在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另外一些代谢途径活跃，从而获得人们所需要的某种产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。

例如：微生物发酵生产甘油中，例如亚硫酸氢钠，它与代谢过程中的乙醛生成加成物。第六十九页，共170页。7.水分功能：生化反应均在水溶液中进行第七十页，共170页。二、培养基的类型

1.依营养物质的来源分类天然培养基；合成培养基，也称组合培养基（多用于定量研究）；半合成培养基，（用的最多，在部分天然有机碳源、氮源、生长因子的基础上，适当加入一些化学药品）；第七十一页，共170页。2.依培养基的物理状态来分：1）固体培养基A、凝固培养基：即遇热可融化，冷却后则凝固的固体培养基B、非可逆性凝固培养基：指有血清凝固成的固体培养基或由无机硅胶配成的凝固后即不能再融化的固体培养基C、天然固体培养基：由天然固体状基质直接制成的培养基，如麸皮，米糠，木屑等D、滤膜：是一种坚韧且带有无数微孔的醋酸纤维薄膜，把它制成圆片状覆盖再营养琼脂或浸有培养液的纤维衬垫上，就形成了具有固体培养基性质的培养条件。第七十二页，共170页。2）半固体培养基配置好的液体培养基中加入0.5%左右的琼脂作为凝固剂，形成的培养基称之微半固体培养基。主要用于菌种鉴定，观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等第七十三页，共170页。3）液体培养基；培养基中80～90%是水。第七十四页，共170页。3.依培养基的用途来分1）、孢子培养基2）、种子培养基3)、发酵培养基4）、补料培养基5）、加富培养基6）、选择培养基7）、鉴别培养基8）、增殖和保存培养基9）、富集培养基10）、测定培养基第七十五页，共170页。三、发酵培养基的选择

一）、配置培养基的原则1、根据不同微生物的营养需要配置不同的培养基2、注意各营养物质的浓度和配比3、调节适宜的物理化学条件4、根据培养微生物的目的配置5、尽量使用廉价易得的原料第七十六页，共170页。1、生态模拟2、查阅文献3、借助优选法或正交试验法精心设计培养基配方4、实验比较实验的规模一般由定性到定量，由小到大。发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实验确定，配制时兼顾原料来源、成本及工艺管理；（举例1，2，3）二）、配置培养基的方法第七十七页，共170页。培养基配方举例

牛肉膏蛋白胨培养基(常用的细菌培养基)

牛肉膏5克蛋白胨10克NaCl5克水1000毫升pH7.2～7.4(琼脂15～20克)高氏一号培养基(常用的放线菌培养基)

可溶性淀粉20克KNO31克K2HPO40.5克MgSO40.5克NaCl0.5克FeSO40.01克水1000毫升琼脂15～20克pH7.4～7.6第七十八页，共170页。察氏培养基(培养霉菌用)蔗糖20克NaNO33克K2HPO41克KCl1克MgSO40.5克FeSO40.01克琼脂20克水1000毫升自然pH无氮培养基(培养自生固氮菌用)葡萄糖10克NaCl0.2克KH2PO40.2克CaSO4·2H2O0.1克MgSO40.2克CaCO35克琼脂20克水1000毫升自然pH伊红-美蓝培养基(检查肠道细菌用)蛋白胨10克K2HPO42克乳糖10克琼脂25克，水1000毫升，pH7.62％伊红水溶液2毫升0.5％美蓝水溶液2毫升将乳糖、伊红、美蓝分别灭菌后，加入灭菌的培养基中摇匀，倒平板。第七十九页，共170页。四、原料转换及意义1、节约原料，减低单耗，提高发酵单位和总收率；2、开拓新的原料资源和微生物资源：野生植物淀粉、植物纤维、木屑水解物、石蜡、醋酸、乙醇第八十页，共170页。第二节淀粉水解糖的制备

一、淀粉水解糖的制备方法1、酸解法：定义：以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法.优点：设备要求简单，水解时间短（20min），设备生产能力大缺点：高温高压下进行，设备要求耐腐蚀、耐高温、耐高压，副反应多，对原料要求严格，淀粉颗粒不宜过大，淀粉乳浓度不能过高。第八十一页，共170页。2、酶解法：（双酶水解法）

定义：用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。一般分为两步：第一步是利用α－淀粉酶将淀粉液化转为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化。第二步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，称为糖化。也称双酶法第八十二页，共170页。α-淀粉酶（液化）葡萄糖淀粉酶（糖化）优点：1、反应条件温和。2、酶的专一性强，副反应少3、可在较高的淀粉乳浓度下水解4、糖液的营养物质丰富5、糖液色泽浅，无苦味，有利于糖液的精制缺点：时间长（2～3）天，要求的设备多，糖液过滤困难。第八十三页，共170页。3、酸酶结合法酸酶法酶酸法第八十四页，共170页。二、淀粉酸水解理论基础

淀粉水解成葡萄糖的反应过程中同时发生这：水解反应、复合反应、分解反应；其中水解反应是主要的。复合反应：葡萄糖分子间经1-6糖苷键结合成龙胆二糖（有苦味）、异麦芽糖和其他低聚糖（合称复合低聚糖）。分解反应：葡萄糖羟甲基糠醛有机酸、色素等第八十五页，共170页。㈠淀粉的水解反应1.淀粉水解过程颜色变化：蓝色暗紫紫红褐暗红红浅红

第八十六页，共170页。2、淀粉酸水解反应动力学属于单分子一级反应类型：K：反应速度常数，由反应条件（如温度、酸度等）而定C：淀粉浓度第八十七页，共170页。3、影响酸水解的因素酸的种类主要因素浓度（酸的浓度、淀粉的浓度）水解温度第八十八页，共170页。（二）、葡萄糖的复合反应及其影响因素复合反应：在淀粉的酸糖化过程中，水解生成的葡萄糖受酸和热的影响，葡萄糖分子之间通过糖苷键相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖。第八十九页，共170页。影响复合反应的因素：1、淀粉浓度的影响（用DE值表示葡萄糖纯度）：DE值＝还原糖/干物质×100％2.、酸的影响：第九十页，共170页。（三）葡萄糖的分解反应及其影响因素

葡萄糖5’-羟甲基糠醛乙酰丙酸、蚁酸、有色素物质；影响因素：浓度、温度、pH值；第九十一页，共170页。第三节糖蜜前处理

一、糖蜜的来源与特点二、糖蜜前处理的方法1、加酸通风沉淀法（冷酸通风处理法）：糖蜜加水稀释到500Bx加入0.2～0.3％浓硫酸，通入压缩空气1h静置澄清8h，取上清液。第九十二页，共170页。2、加热加酸沉淀法（热酸通风沉淀法）：糖蜜加水稀释到40％加适量硫酸调节pH值到4～4.5放入澄清槽加热至80～90℃，通风30min保温70～80℃8～12小时，取上清液。第九十三页，共170页。3、添加絮凝剂澄清处理法：糖蜜稀释至30～40Bx加硫酸调pH3～3.8加热至90℃添加8ppm聚丙烯酰胺（PAM），搅拌均匀静置1小时，取上清液。第九十四页，共170页。三、谷氨酸发酵糖蜜前处理

1.糖蜜预处理法活性炭处理法树脂处理法亚硝酸处理法2.添加化学药剂处理法添加青霉素法添加表面活性剂添加抗氧剂法3.追加糖蜜法4.营养缺陷型变异株法第九十五页，共170页。第四节其他原料的处理一、纤维素及发酵废液的处理（一）、利用纤维素废料生产SCP稻草、麦秆、玉米的茎和叶、甘蔗渣、废纸等流程如下：第九十六页，共170页。纤维原料粉碎水解中和澄清过滤发酵罐培养分离废液种子营养盐菌体浓缩磨碎干燥成品第九十七页，共170页。

（二）利用柠檬酸中和滤液生产酵母

酵母菌种斜面一级种子二级种子离心分离中和废液盐酸调pH3.5发酵干燥粉碎包装二次废液用于发酵培养基的配置等第九十八页，共170页。二、亚硫酸盐废液的处理（一）亚硫酸盐制浆废液生产酒精和蛋白质1、亚硫酸盐纸浆废液生产酒精2、亚硫酸盐纸浆废液发酵生产蛋白质3、亚硫酸铵法非木材制浆废液培养SCP

（二）亚硫酸盐废液发酵生产乳酸三、木屑水解液发酵生产衣康酸第九十九页，共170页。第五节培养基灭菌一、消毒与灭菌在发酵工业中的应用消毒：指用物理和化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消灭杂菌和防止杂菌污染第一百页，共170页。二、灭菌方法：干热灭菌、湿热灭菌、物理灭菌（射线、微波等）、化学灭菌（各种化学药品）；1、干热灭菌法灼烧灭菌、在电热或红外线在设备内加热主要用于保持干燥的物料、器具等第一百零一页，共170页。

2、湿热灭菌法

借助蒸汽释放的热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。优点：1）蒸汽来源容易，操作费用低廉，本身无毒2)蒸汽具有很强的穿透力，灭菌易于彻底3）蒸汽均有很大的潜热，冷凝后的水分有利于湿热灭菌4）蒸汽输送可借助本身的压强，调节方便，技术管理容易缺点：1)设备费用高2）不能用于怕受潮的物料灭菌第一百零二页，共170页。3、射线灭菌紫外线、高速电子流的阴极射线、X射线和Y射线化学药品灭菌法（1）第一大类：表面消毒剂高锰酸钾溶液：0.1～0.25%、漂白粉、75％的酒精、新洁尔灭和杜灭芬、甲醛37％、戊二醛、过氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚类第一百零三页，共170页。（2）第二大类：抗代谢药物化学结构与微生物必须的代谢物类似例如：磺胺类化合物取代氨基苯甲酸（3）第三大类：抗生素

第一百零四页，共170页。三、加热灭菌的原理

1.、微生物的热阻：微生物对热的抵抗力；致死温度、致死时间2、微生物的热致死动力学：对数残留定律第一百零五页，共170页。一级反应：用N表示残留活菌个数，则活菌的减少率（死亡率），与N呈线性关系，即：式中，K是反应速度常数，对灭菌来讲，是活菌的比热致死速率常数，单位是min-1，其值与菌的种类和加热温度有关，需通过实验才能测定。第一百零六页，共170页。积分边界条件：N0→Nθ；t0=0式中，θ灭菌时间（s）；N0灭菌开始时，培养基中杂菌个数（个）；Nθ经过灭菌时间θ后，残存的活菌数（个）。

第一百零七页，共170页。3、热致死反应的速度常数KK是表达微生物耐热性的特征常数，与微生物的种类和灭菌温度有关。K越小，微生物越耐热第一百零八页，共170页。第一百零九页，共170页。第一百一十页，共170页。4、灭菌温度的选择式中ΔE为菌体死灭反应的活化能（J/mol），它是菌体死灭反应的特征常数，所以，不同菌其热死灭反应的ΔE不同。第一百一十一页，共170页。第一百一十二页，共170页。四、影响培养基灭菌的其他因素培养基成分、pH值、培养基中的颗粒、泡沫第一百一十三页，共170页。五、分批灭菌与连续灭菌一）、分批灭菌的操作过程（实罐灭菌）1）培养基的预热培养基先加热到80－90℃，然后再导入蒸汽升温到120－180℃。目的：1）防止直接导入蒸汽时由于培养基与蒸汽的温度过大而产生大量的冷凝水使培养基稀释2）防止直接导入蒸汽所造成的泡沫急剧上升而引起的物料外溢。方法：先将排气阀打开第一百一十四页，共170页。2）培养基灭菌从各路通入蒸汽（进气口、排料口、取样口），温度升到120－130℃，保温30min第一百一十五页，共170页。2、分批灭菌的注意事项1）各路蒸汽进口要畅通，防止短路逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。2）排气量不宜过大，以节约蒸汽3）灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却，以避免罐压迅速下降产生负压而吸入外界空气，或引起发酵罐破坏。4）在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基将倒流入过滤器。第一百一十六页，共170页。（二）、连续灭菌：1、连续灭菌优点：1）可以采用高温短时灭菌；2）发酵罐利用率高；3）蒸汽负荷均衡；4）热效率高；5）可采用自动控制，降低劳动强度；第一百一十七页，共170页。2、连续灭菌流程第一百一十八页，共170页。第一百一十九页，共170页。第一百二十页，共170页。六、培养基与设备、管道灭菌条件1、灭菌锅内灭菌2、种子培养基实罐灭菌3、发酵培养基实罐灭菌4、发酵培养基连续灭菌5、消泡剂灭菌6、补料实罐灭菌7、尿素溶液灭菌第一百二十一页，共170页。作业：1、微生物发酵培养基的碳源、氮源主要包括哪些物质。2、简述发酵工业常用的灭菌方法。3、试画出两种不同的培养基连续灭菌流程图。4、有一株枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，请设计一种优化培养基的方案，使该培养基适合该菌株能产酶能力（淀粉酶）。第一百二十二页，共170页。第二篇发酵机制发酵机制：微生物通过其代谢活动，利用基质（底物）合成人们所需要的代谢产物的内在规律积累的产物微生物菌体酶代谢产物厌气发酵：酒精、甘油、乳酸、丙酮、丁醇等好气发酵：有机酸、氨基酸、蛋白质、核苷酸、抗生素、维生素等第一百二十三页，共170页。代谢控制发酵：人为的改变微生物的代谢调控机制，使有用的代谢产物过量的积累。发酵机制研究的内容：1.微生物的生理代谢规律（就是各种代谢产物合成途径及代谢调节机制）；2.环境因素（营养条件、培养条件等）对代谢的影响及改变代谢的措施；第一百二十四页，共170页。第三章糖厌气性发酵产物积累机制

厌气发酵产物：酒精发酵、甘油发酵、同型乳酸发酵、丙酮丁醇发酵、混合酸发酵等

第一百二十五页，共170页。第一节糖酵解途径及调节机制

葡萄糖经EMP途径：C6H12O6+2ADP+2Pi+2NAD2CH3COCOOH+2ATP+2NADH2第一百二十六页，共170页。葡萄糖ATP6-P-葡萄糖6-P-果糖1.6-二P果糖3-P-甘油醛3-P-甘油酸丙酮酸乙酰CoA琥珀酸CoA草酰乙酸乳酸乙醇GTPATPADPCitAlaNADH2NADATPATPF·APEPNADHADPADPADPATPcAMPATP抑制PEP：磷酸烯醇丙酮酸Ala：丙氨酸F·A：脂肪酸Cit：柠檬酸糖酵解和糖新生的控制己糖激酶磷酸果糖激酶丙酮酸激酶1.6-二P果糖第一百二十七页，共170页。一、糖酵解途径（EMP）的特点：1.是除兰绿藻之外的几乎所有生物葡糖分解的共同途径,广泛存在于各种细胞中，每个反应都不需氧。2.分为两个阶段3.糖酵解有10多个反应，都在酶的作用下完成；a.激酶b.变位酶c.异构酶d.脱氢酶4.其他糖类（如淀粉、乳糖等）作为碳源和能源时，通过葡萄糖或其他中间产物并入EMP途径。第一百二十八页，共170页。3-磷酸甘油醛1·3-二磷酸甘油酸NAD+＋HNADH2所形成的NADH2要迅速被氧化成NAD，以使糖酵解反应继续进行。释放出的H2被不同受体接受，从而形成不同的产物。5.丙酮酸去路不同第一百二十九页，共170页。在无氧条件下，丙酮酸主要发生如下变化：（1）在乳酸中，乳酸；同型乳酸发酵（2）在酵母中，乙醇；酒精发酵（3）在梭状芽孢杆菌中，丁酰CoA、丁醛、丁醇、丙酮、乙醇；丙酮丁醇发酵。第一百三十页，共170页。二、糖酵解调节机制调节点主要是三个激酶：己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶，所催化的三个反应是不可逆的，只参与糖酵解，不参与糖的新生。而激酶的活性是受细胞能荷调节的。第一百三十一页，共170页。[(ATP)+1/2(ADP)]/[(ATP)+(ADP)+(AMP)]为一定的比例，该比例叫能荷。当体系中ATP含量高时，ATP抑制磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶的活性，使酵解减少。当需要能量时，ATP分解为ADP、AMP，这样ATP减少，ADP增加、AMP增加→能荷降低→激酶活性增大；无机磷也是调节者，它能解除6-磷酸葡萄糖对己糖激酶的抑制，加快糖酵解。第一百三十二页，共170页。葡萄糖ATP6-P-葡萄糖6-P-果糖1.6-二P果糖3-P-甘油醛3-P-甘油酸丙酮酸乙酰CoA琥珀酸CoA草酰乙酸乳酸乙醇GTPADPAMPATPADPCitAlaNADH2NADATPATPF·APEPNADHADPADPADPATPcAMPATP抑制激活PEP：磷酸烯醇丙酮酸Ala：丙氨酸F·A：脂肪酸Cit：柠檬酸糖酵解和糖新生的控制第一百三十三页，共170页。第二节酒精发酵机制一、酒精生成机制丙酮酸丙酮酸脱羧酶CO2+乙醛（酵母菌酒精发酵Ⅰ型）NADH+HNADH+乙醇+以丙酮酸脱羧产生的乙醛作为H受体产生乙醇。焦磷酸硫胺素、Mg2＋乙醇脱氢酶第一百三十四页，共170页。二、巴斯德效应

在好气条件下，酵母菌发酵能力降低（细胞内糖代谢降低，乙醇积累减少）；不仅存在于酵母中，也存在于具有呼吸和发酵能力的其他细胞中。在好气条件下，糖代谢进入TCA环柠檬酸↑ATP↑抑制磷酸果糖激酶的合成6-P-果糖↑（积累）6-P-葡糖↑（积累）反馈抑制己糖激酶抑制葡糖进入细胞内葡糖利用降低同时，在好气条件，丙酮酸激酶活性降低。丙酮酸激酶活性降低也是由于磷酸果糖激酶活性降低所致。第一百三十五页，共170页。丙酮酸激酶活性↓磷酸稀醇式丙酮酸↑反馈抑制己糖激酶活性糖酵解速度↓三、酒精发酵中的副产物酵母菌酒精发酵主产物：乙醇、CO2副产物40多种醇（杂醇油）醛（糠醛）酸（琥珀酸）酯甲醇第一百三十六页，共170页。（一）杂醇油的生成

1、酒精发酵中高级醇形成的途径（1）氨基酸氧化脱氨作用缬氨酸异丁醇异亮氨酸活性戊醛酪氨酸酪醇苯丙氨酸苯乙醇

亮氨酸＋ɑ－酮戊二酸ɑ－酮异己酸转氨酶+谷氨酸异戊醇异戊酸醇脱氢酶第一百三十七页，共170页。（2）由葡萄糖直接生成ɑɑ－酮酸（碳原子低的）活性乙醛ɑ－酮酸（碳原子高的）还原、异构、脱水醇＋缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸醇第一百三十八页，共170页。（3）正丙醇的形成苏氨酸ɑ－氨基－2－丁烯酸脱水酶ɑ－丁酮酸脱氨脱羧醛正丙醇还原第一百三十九页，共170页。2、影响杂醇油形成的条件（1）菌种（2）培养基组成（3）发酵条件第一百四十页，共170页。（二）琥珀酸的生成在发酵液中加入谷氨酸，可增加琥珀酸的产量（三）酯类的生成（四）糠醛、甲醇等的生成第一百四十一页，共170页。第三节甘油的合成机制

酵母菌中的乙醇脱氢酶活性很强，乙醛作为氢受体被还原成乙醇的反应进行得很彻底，因此，在乙醇发酵中甘油的生成量很少。1.如果采取某些手段阻止乙醛作为氢受体时，磷酸二羟丙酮则替代乙醛作为氢受体形成甘油，这样发酵转为甘油发酵（酵母Ⅱ型发酵）。NaHSO3可作为抑制剂：乙醛+NaHSO3乙醛亚硫酸氢钠↓第一百四十二页，共170页。2ATP2ADP2ADP2ATPCO2NaHSO3NAD﹢NADH+H﹢NADH+H＋NAD﹢H2OPi酵母菌酒精发酵Ⅱ型葡萄糖1.6-二磷酸果糖3-磷酸甘油醛磷酸二羟丙酮丙酮酸乙醛乙醛HSO3α-磷酸甘油甘油第一百四十三页，共170页。2.酵母菌在碱性环境条件下（pH7.6），由于乙醛生成等量的乙酸和乙醇，因此乙醛作为氢受体的作用也被抑制；这时磷酸二羟丙酮成为氢受体。这样，发酵产生的总的产物为甘油、乙醇、乙酸。（酵母Ⅲ型发酵）第一百四十四页，共170页。葡萄糖1、6-二磷酸果糖3-磷酸甘油醛丙酮酸乙醛乙醇磷酸二羟丙酮α-磷酸甘油甘油NADH+HNADH﹢﹢酵母菌酒精发酵Ⅲ型2ADP2ATPCO2乙酸加Na2CO3或NaOH第一百四十五页，共170页。第四节乳酸发酵机制乳酸发酵乳酸菌的同型乳酸发酵（产物中只有乳酸）明串珠菌等的异型乳酸发酵（产物除乳酸外尚有乙醇，CO2）一、同型乳酸发酵多数乳酸菌不具有脱羧酶，丙酮酸不能脱羧生成乙醛，而能在乳酸脱氢酶作用下作为氢受体被还原成乳酸。第一百四十六页，共170页。二、异型乳酸发酵：分两种途径1、6-磷酸葡糖酸途径（磷酸酮解途径）2、双歧途径（也是磷酸酮解途径）葡萄糖2ATP4ATP2ADP4ADP3-磷酸甘油醛1·3-二磷酸甘油酸丙酮酸乳酸2NADNADNADH+H2NADH+H++第一百四十七页，共170页。葡萄糖ATPADP6－磷酸葡萄糖1NADNADH＋H＋6－磷酸葡萄糖酸2NADNADH＋H＋5－磷酸核酮糖35－磷酸木酮糖乙酰磷酸乙酰乙酰CoANADH＋H＋NAD乙醛NADH＋H＋NAD乙醇3－磷酸甘油醛乳酸ADPATPNADNADH＋H＋NADNADH＋H＋485766－磷酸葡萄糖酸生成乳酸和乙醇己糖激酶6－磷酸葡萄糖脱氢酶6－磷酸葡萄糖酸脱氢酶4.5－磷酸核酮糖－3－差向异构酶5.磷酸解酮酶6.磷酸转乙酰酶7.乙醛脱氢酶8.醇脱氢酶第一百四十八页，共170页。葡萄糖ATPADP6－磷酸果糖6－磷酸果糖ADPPi4－磷酸赤藓糖3－磷酸甘油醛7－磷酸景天庚酮糖5－磷酸木酮糖5－磷酸核糖乙酰磷酸ATP乙酰5－磷酸木酮糖5－磷酸核酮糖乙酰磷酸2分子3－磷酸甘油醛乳酸ADPATPNAD＋NADH＋H＋NAD＋NADH＋H＋ADPATP3分子乙酸葡萄糖经双歧途径发酵生成乳酸和乙酸13245676-磷酸果糖解酮酶转二羟基丙酮基酶转羟乙醛基酶5－磷酸核糖异构酶5－磷酸核酮糖－3－差向异构酶5－磷酸木酮糖磷酸酮解酶乙酸激酶第一百四十九页，共170页。第四章柠檬酸发酵机制

柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。

性质：分子式C6H8O7，分子量192.12

有两种形式水合物：100℃时融解，密度1.542g/cm3(18℃)

无水物：无色晶体或粉末，熔点153℃

有强酸味。溶于水、乙醇和乙醚

第一百五十页，共170页。

用途：1）食品行业2）医药行业3）化工行业4）其它行业

柠檬酸的生产：1874年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体；1913年首次实现利用黑曲霉发酵生成柠檬酸。第一百五十一页，共170页。一、柠檬酸合成途径葡萄糖丙酮酸柠檬酸乙酰-CoA草酰乙酸EMP途径氧化脱羧羧化第一百五十二页，共170页。

1953年，Jagnnathan等证实了黑曲霉中存在EMP途径的所有酶；

1954年，Shu提出葡萄糖分解代谢中约80％走EMP途径；

1958年，MeDomough等发现黑曲霉还存在HMP途径的酶，但HMP途径主要存在于孢子形成阶段；1954－1955年，Ramakrishman和Martin研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环；第一百五十三页，共170页。淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰CoA苹果酸草酰乙酸柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸α-酮戊二酸琥珀酸富马酸CO2Fe