微生物检测新技术专家讲座

Chap6微生物检测新技术微生物检测新技术第1页微生物检测：对送检样品中是否存在某种或各种特定微生物种或类群，应用各种方法进行判定和分型，也包含种之间判别。检测微生物：病毒、细菌、真菌和原生动物。微生物检测新技术第2页检测方法：微生物形态、生长特征、代谢类型、特异性酶反应、分子生物学技术。过程：选择性培养基分离纯菌落，进行多项生化试验：糖类发酵、氨基酸代谢、碳氮源利用和酶类、抑菌试验。时间：最少1d，有些长达7-10天。微生物检测新技术第3页微生物检测新技术包含：基于微生物酶反应特异性酶反应检测技术，包含显色反应和荧光反应检测技术；基于核酸反应杂交技术、PCR技术和基因芯片技术；基于抗原抗体相互作用免疫检测反应如免疫传感器技术。微生物检测新技术第4页第一节特异性酶反应技术原理及其应用1.微生物特异性酶反应检测技术原理利用微生物含有种属特异性酶特点，在培养基质中加入对应显色酶底物，经微生物生长代谢产生酶水解底物释放色原物质，使培养物着色从而进行目标微生物筛选判别。微生物检测新技术第5页显色培养基所采取显色酶底物主要包含两大类别：1）含有荧光显色底物：酶水解对应荧光底物后释放荧光色原在一定波长紫外光照射下使目标微生物培养物展现荧光。2）可见光显色底物：酶水解对应可见光显色底物后释放色原在可见光下可使目标微生物培养物显现特有颜色。微生物检测新技术第6页

色原-底物底物+颜色荧光化合物-底物底物+荧光微生物酶微生物酶紫外线微生物检测新技术第7页优点：分离与判定合二为一，省时、操作简便、敏感性和特异性较高。微生物检测新技术第8页2.微生物特异性酶类型及其底物种类检测酶主要有：糖苷酶、酯酶、脂酶、DNA酶、蛋白酶和磷酸酶。微生物检测新技术第9页2.1辛酸酯酶法快速检出沙门菌沙门菌中存在辛酸酯酶,它可用荧光底物4-甲基伞形酮辛酸酯(4-MU-caprylate)和显色底物SLPA-octanate等快速检测。微生物检测新技术第10页如MUCAP试剂含有4-甲基伞形酮辛酸酯,在C8酯酶作用下,底物游离出4-甲基伞形酮(4-MU),在Columbia琼脂上菌落添加一滴MUCAP,在UV下(366nm)观察1～5min,强烈蓝色荧光指示存在沙门菌。微生物检测新技术第11页SLPA-octanate是从C8脂肪酸和含酚生色团合成一个酯。这种酯被沙门菌水解产生一个显色酚并紧附在菌落上,经典沙门菌株显示红色菌落,而非沙门菌展现白色、乳白色、黄色或者透明菌落。微生物检测新技术第12页沙门氏菌显色培养基

微生物检测新技术第13页2.2丁酸酯酶法检测卡他性布兰汉球菌卡他性布兰汉球菌中存在丁酸酯酶。这种特征在奈瑟球菌科中大多数组员都没有。丁酸酯酶可用荧光底物4-MU-丁酸酯来检测。全部布兰汉球菌菌株试验展现阳性荧光反应。而奈瑟球菌属呈阴性。微生物检测新技术第14页2.3α-半乳糖苷酶(α-D-galactosides,α-D-GAL)

α-D-GAL可用来判别链球菌和肠球菌。牛链球菌和粪链球菌以及它们血清型可水解4-MU-α-D-半乳糖苷;包含α-D-GAL底物和比色淀粉试验选择性培养基可确认3种表现型微生物。(i)牛链球菌可进行α-D-GAL反应和淀粉比色反应;(ii)粪链球菌只进行α-D-GAL反应;(iii)粪肠球菌、鸟肠球菌、马肠球菌等2种反应均不进行。微生物检测新技术第15页2.4大肠杆菌与大肠菌群显色培养基大肠杆菌与大肠菌群计数显色培养基有荧光显色培养基与可见光显色培养基两种荧光显色培养基，普通采取MUG4-methylumbelliferyl--D-glucuronide检测大肠杆菌LECC液体培养基采取荧光显色原理和MPN计数方法，36±1℃培养18-24h能够同时检测大肠杆菌与大肠菌群大肠肝菌在紫外光下观察波长=365nm展现荧光，大肠菌群在可见光下观察展现蓝绿色，应用显色培养基检测大肠杆菌与大肠菌群，与传统培养方法比较而言只需培养24h便可同时检测大肠杆菌与大肠菌群，可大大缩短检测时间提升检测效率。微生物检测新技术第16页大肠菌群显色培养基

微生物检测新技术第17页2.5大肠杆菌O157:H7(E.coliO157:H7)检测大肠杆菌O157:H7商业显色培养基有两类。一类即荧光显色培养基如德国Merck企业开发FluorocultE.coliO157:H7，E.coliO157:H7生长菌落呈绿色，在紫外灯下观察没有荧光；另外一类是可见光显色培养基，如CHROMagar。陆桥企业开发E.coliO157显色培养基，E.coliO157:H7生长菌落呈紫红色，该培养基还能够检测产志贺样毒素(Stx)大肠杆菌。微生物检测新技术第18页李斯特菌显色培养基

微生物检测新技术第19页第二节基于核酸微生物检测新技术微生物检测新技术第20页1.菌种判定（16S-rDNA)

16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应DNA序列，存在于全部细菌染色体基因中，它内部结构由保守区及可变区两部分组成。其分子内存在可变区，显示出细菌不一样分类等级水平上特异性。而16SrDNA中还含有一些高度保守序列，其在在进化中改变很小。所以，利用16SrDNA独特序列特征，常可用作原核生物分类判定指标。

微生物检测新技术第21页16SrDNA长度大约为1500bp左右，每一个原核生物其长度略有差异，如大肠杆菌为1541bp,操作时候先提取总DNA，再利用保守区（clustalw或者blast分析下）设计16SrRNA引物进行PCR扩增，然后进行克隆测序，完了后去做下进化分析（用phylips做下进化树），这么大致就能够知道目标菌株分类地位了。微生物检测新技术第22页2.核酸探针将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其它方法标识，加入已变性被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列DNA区段形成杂交双链，从而到达判定样品中DNA目标，这种能认识到特异性核苷酸序列有标识单链叫DNA分子核酸探针或基因探针。微生物检测新技术第23页依据核酸探针中核苷酸成份不一样，可将其分成DNA探针或RNA探针，普通大多项选择取DNA探针；依据选取基因不一样分成两种，一个探针能同微生物中全部DNA分子中一部分发生反应，它对一些菌属、菌种、菌株有特异性，另一个探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，如编码致病性基因组，它对某种微生物中一个菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。微生物检测新技术第24页核酸探针应用：1)用于检测无法培养，不能用作生化判定、不可观察微生物产物以及缺乏诊疗抗原等方面检测，如肠毒素。2)用于检测病毒病，如检测肝炎病毒，流行病学调查研究，区分有毒和无毒菌株。3)检测细菌内抗药基因。4)分析食品是否会被一些耐药菌株污染，判定食品污染特征。5)细菌分型，包含rRNA分型。微生物检测新技术第25页2.PCRPCR可用于各种病原微生物同时检测或判定，它是在同一PCR反应管中同时加上各种病原微生物特异性引物，进行PCR扩增。微生物检测新技术第26页可用于同时检测各种病原体或判定出是那一型病原体感染，可系统组合有：1)肝炎病毒感染，在同一病人或同一供血者体内，有时存在各种肝炎病毒重合感染，有时是甲乙丙型肝炎病毒重合；有时可能是甲乙型肝炎病毒重合；有时是乙丙型肝炎病毒重合；2)肠道致病性细菌检测，如伤寒、痢疾和霍乱，有时含有较相同肠道症状，有痢疾霍乱同存一病人并同时发病；3)性病检测，如梅毒、淋病及艾滋病诊疗；微生物检测新技术第27页4)战伤细菌及生物战剂细菌检测，如破伤风杆菌、产气荚膜杆菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌等侦检；5)需