目的基因的获得

目的基因的获得第1页/共119页第五章目的基因的获得第2页/共119页第五章目的基因的获得

对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。第3页/共119页第五章目的基因的获得

基因文库(genelibrary)概念又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。

按外源DNA片段的来源分基因文库分为：

基因组DNA文库从特定组织提取的染色体基因组DNA

cDNA文库

mRNA反转录成的cDNA拷贝

基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。第4页/共119页第五章目的基因的获得第5页/共119页一、基因组DNA文库的构建(一)基因组DNA文库的类型

根据所选用的载体可以分为：质粒文库噬菌体文库粘粒文库人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库等）载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体系列：容量为24kpcosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kb第6页/共119页一、基因组DNA文库的构建

用质粒载体构建基因组文库的流程

该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。第7页/共119页一、基因组DNA文库的构建用λ噬菌体载体构建基因组文库的流程第8页/共119页一、基因组DNA文库的构建用黏粒载体构建基因组文库的流程第9页/共119页一、基因组DNA文库的构建用酵母人工染色体构建基因组文库的流程第10页/共119页一、基因组DNA文库的构建用酵母人工染色体构建基因组文库的流程第11页/共119页一、基因组DNA文库的构建第12页/共119页一、基因组DNA文库的构建(二)基因组DNA文库的质量标准

一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力。载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆。克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。第13页/共119页一、基因组DNA文库的构建(三)基因组DNA文库构建的程序

1.载体DNA的制备；

2.高纯度大相对分子质量基因组DNA的提取和大片段的制备；

3.高纯度大相对分子质量基因组DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离；

4.载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；

5.重组克隆的挑选和保存。第14页/共119页一、基因组DNA文库的构建(三)基因组DNA文库构建的程序

1．载体DNA片段的制备

DNA分离纯化→限制酶切→脱磷酸化反应

2．供体DNA片段的制备总DNA分离纯化→物理切割法[超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）]或酶切法（内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。）→分离特定大小DNA片段

超声波～300bp，剧烈搅拌：～8Kb

部分酶切完全酶切

酶法分离特定大小DNA片段第15页/共119页一、基因组DNA文库的构建DNA的不完全酶切目的片段低熔点琼脂糖回收第16页/共119页一、基因组DNA文库的构建(三)基因组DNA文库构建的程序

3.载体与基因组DNA大片段的连接直接连接、人工接头或同聚物加尾。

（1）粘性末端直接连接：载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。

（2）人工接头法（adapter）

人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。接上人工接头粘性末端各种酶的接头可以向公司定做或购买。第17页/共119页一、基因组DNA文库的构建

(三)基因组DNA文库构建的程序

3.载体与基因组DNA大片段的连接

（3）同聚物加尾粘性末端CCCCCC末端转移酶第18页/共119页一、基因组DNA文库的构建

(三)基因组DNA文库构建的程序

4.重组DNA转化受体细胞

（1）根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞常见的宿主细胞：

DH5:用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株，可与pUC编码的－半乳糖苷酶氨基端实现互补。

HB101:

用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高

JM101:

可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌

JM109:

支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌

MZ-1:

温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体ＰＬ启动子质粒载体的宿主菌第19页/共119页一、基因组DNA文库的构建第20页/共119页一、基因组DNA文库的构建(四)基因组文库的大小理论值:基因组文库的克隆数目＝基因组DNA总长/DNA插入片段的平均长度。例如：细菌基因组DNA总长度=3×106kb

酶切后的DNA片段平均长度=15kb

基因组文库的克隆数=3×106kb/15kb=2×105个克隆第21页/共119页一、基因组DNA文库的构建

(四)基因组文库的大小

（必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任何碱基序列。）经验值：

N—基因组文库克隆总数

P—在基因组文库中目的基因DNA片段的出现概率

f—插入片段大小与基因组DNA大小比值N=Ln(1–P)Ln(1–f)第22页/共119页一、基因组DNA文库的构建ln(1-0.99)ln[1-(2×104/4.6×106)]Nhuman==6.9×105

ln(1-0.99)ln[1-(2×104/3×109)]

这个例子说明用质粒载体（插入片断5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。N

E.coli=＝1.1×103Forexample:

期望值为0.99，插入片断为20kb的E.coli(4.6×106bp)和human(3×109bp)基因组的克隆数的计算第23页/共119页一、基因组DNA文库的构建克隆片段平均大小（bp）基因组大小/bp2×106（细菌）2×107

（真菌）2×109（动物）理论克隆数实际克隆数理论克隆数实际克隆数理论克隆数实际克隆数5×1034001831400018418600000276311010×10320091920009208300000138155020×1031004581000460315000069077440×10350278500230075000345386基因组文库应具有的克隆子数第24页/共119页一、基因组DNA文库的构建

(五)DNA文库的保存

1、影印膜滤保存法第25页/共119页一、基因组DNA文库的构建

(五)DNA文库的保存

2.液体培养基中扩增保存方法：从平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70oC储存（加终浓度为25%的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。第26页/共119页一、基因组DNA文库的构建

(五)DNA文库的保存

3.保存单个克隆子于含有甘油的培养基中

方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70oC或-25oC下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大第27页/共119页二、cDNA文库构建

真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都尽有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。第28页/共119页二、cDNA文库构建

cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反转录酶引物cDNAlibrary

利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。第29页/共119页二、cDNA文库构建cDNA文库的特点（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达（一般选用的载体都是表达型的）。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。cDNA文库既有种属特异性，也有组织特异性。基因特异性、器官特异性、代谢或发育特异性第30页/共119页二、cDNA文库构建

(一)cDNA基因文库构建的步骤细胞总RNA的提取和mRNA的分离第一条cDNA合成第二条cDNA合成双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖第31页/共119页二、cDNA文库构建基因重组反转录酶mRNAcDNA第32页/共119页二、cDNA文库构建

(一)cDNA基因文库构建的步骤

1.总RNA（totalRNA）提取和mRNA的分离纯化

提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。

mRNA的分离纯化（1）原理利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。

mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化

Column（柱）分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。第33页/共119页二、cDNA文库构建mRNA的分离纯化第34页/共119页二、cDNA文库构建

(一)cDNA基因文库构建的步骤

1.cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。

用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。反转录酶mRNAcDNA3’

5’

AAAAAAATTTTTTTOligodT引物第35页/共119页二、cDNA文库构建

降解mRNA模板

用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’

5’

5’

反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’

3’

5’

5’

引物cDNA第一链3’

5’

引物或RNaseH碱第36页/共119页二、cDNA文库构建

(一)cDNA基因文库构建的步骤

3.cDNA第二链合成（自身引导法和置换合成法）剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’第37页/共119页二、cDNA文库构建去掉发卡结构用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。核酸酶S1cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’第38页/共119页二、cDNA文库构建1．自身引导法第39页/共119页二、cDNA文库构建第40页/共119页二、cDNA文库构建

妙用RNaseH这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。

DNAPolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。第41页/共119页二、cDNA文库构建mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’RNaseHDNAligase去引物第42页/共119页二、cDNA文库构建置换合成法第43页/共119页二、cDNA文库构建第44页/共119页二、cDNA文库构建

(一)cDNA基因文库构建的步骤

4.cDNA与载体连接与转化受体细胞

同基因组文库相似第45页/共119页二、cDNA文库构建

cDNA文库构建的特殊方法

Okayama–Berg法

Okayama–Berg改进法

SMART(SwitchMechanismAtthe5’endofRNATemplates)方法聚合酶链式反应法（PCR法）第46页/共119页二、cDNA文库构建

Okayama-BergcDNA文库构建第47页/共119页二、cDNA文库构建Okayama–Berg改进法第48页/共119页二、cDNA文库构建第49页/共119页二、cDNA文库构建PCR法构建cDNA文库第50页/共119页二、cDNA文库构建

(二)cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-1n)p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）

:

某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）1n第51页/共119页二、cDNA文库构建基因组DNA文库与cDNA文库的比较第52页/共119页二、cDNA文库构建基因组DNA文库的优点

相对于cDNA文库，基因组文库的优点：

cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列；

cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难；从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。第53页/共119页二、cDNA文库构建cDNA文库的优点

cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。

cDNA文库的筛选比较简单易行。每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。

cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。

cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能第54页/共119页二、cDNA文库构建cDNA克隆的主要的缺点

cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。

cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。第55页/共119页三、目的基因的获得基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。第56页/共119页三、目的基因的获得目的基因用途很广，主要有以下几个方面：研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。研究生物种系进化与相关同源性。应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。第57页/共119页三、目的基因的获得基因工程的目的采用DNA重组技术从不同生物基因组中优良性状相关的基因克隆，转移同一生物基因组中，培育出具有高度应用价值的新物种。目的基因

那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，主要指结构基因。目的基因包括蛋白（酶）基因、抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物讲解相关的基因等。第58页/共119页三、目的基因的获得

(一)结构基因组成

1.原核生物的基因组成（1）基因区：操纵子形式存在，但各基因分别有ATG的起始密码子和TAA（TAG、TGA）的终止密码子。（2）启动区：RNApol识别、结合和开始转录的一段DNA核苷酸序列。5′TTGACATATAATA/G3′3′AACTGTATATTAT/C5′-35序列-10序列识别序列Pribnow框转录起点16～19bp5～9bp第59页/共119页三、目的基因的获得(一)结构基因组成

1.原核生物的基因组成第60页/共119页三、目的基因的获得(一)结构基因组成

1.原核生物的基因组成第61页/共119页三、目的基因的获得(一)结构基因组成

1.原核生物的基因组成（3）SD区：在起始密码子ATG上游约10bp处，有一个富含嘌呤的保守序列，其与16SrRNA3′端序列互补。

SD序列与起始密码子ATG之间的距离决定了mRNA在细菌中的转录效率。SD序列：5′AGGAGGU3′3′UCCUCCA5′16SrRNA第62页/共119页三、目的基因的获得

(一)结构基因组成

1.原核生物的基因组成（4）转录终止子和终止因子

转录终止子：一个基因或一个操纵子3′端，提供转录停止信号的DNA核苷酸序列。终止因子：协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子的蛋白。-independent第63页/共119页三、目的基因的获得Rhoproteindependenttermination第64页/共119页三、目的基因的获得

(一)结构基因组成

2.真核生物基因组成（1）基因区第65页/共119页三、目的基因的获得编码区非编码区非编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子(一)结构基因组成

2.真核生物基因组成（1）基因区第66页/共119页三、目的基因的获得(一)结构基因组成

2.真核生物基因组成（2）转录启动区mRNArDNAmDNAtDNArRNAtRNARNApoLIRNApoLIIIRNApoLIIaa3′5′构成核糖体NmRNAproteinP1P3P2P1、P2和P3个有不同的结构特点。第67页/共119页三、目的基因的获得(一)结构基因组成

2.真核生物基因组成（2）转录启动区①-25的TATAbox：起始双链解开，并决定转录的起始位点；②-80的CAATbox：可能与RNApol结合有关；③-100的GCbox：转录因子（如spI因子）的结合序列。

CAATbox和GCbox对转录起始效率较大的影响。第68页/共119页三、目的基因的获得(一)结构基因组成

2.真核生物基因组成（3）转录终止子：对真核生物转录的终止子信号和终止过程了解甚少。但在高等真核生物的细胞中，mRNA在靠近3′端区有一段非常conservativesequenceAAUAAA，这一序列为链的切断和pol(A)化提供了某些终止信号。不含SD序列，核糖体与mRNA5’端的帽子结构结合第69页/共119页三、目的基因的获得

(二)其他基因组基因的组成

1.质粒的基因少量结构基因、基因组成简单，启动子、编码区和终止子，无内含子。

2.病毒的基因多顺反子、重叠基因、有的基因含有内含子。

3.线粒体的基因能源代谢相关的基因、多顺反子、动物Mt基因没有内含子，而植物Mt基因含有内含子，有的没有。

4.叶绿体的基因光合作用相关的基因，多顺反子形式进行转录，具有原核生物相似的启动子。第70页/共119页三、目的基因的获得色氨酸的合成分5步完成。每个环节需要一种酶，编码这5种酶的基因紧密连锁在一起，被转录在一条多顺反子mRNA上，分别以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表，编码了邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。第71页/共119页三、目的基因的获得

(三)基因的排列基因组的每个基因一般一个一个直线排列在DNA分子上，并且两个基因之间存在非编码的间隔序列，但存在一些特殊排列。

1.重叠基因(overlappinggenes)---ATG--------TCATGCCCAA----ATGAGGC--------------Vp2StartVp1StartVp3Start核苷酸序列彼此重叠的基因，即不同基因共用同一段DNA的核苷酸序列，他们的核苷酸序列彼此重叠。第72页/共119页三、目的基因的获得

(三)基因的排列

2.重复基因（repeatedgeneorduplicatedgene）原核生物基因组—单拷贝基因真核生物基因组—约30%的基因是多拷贝例如：免疫球蛋白基因、组蛋白基因

2006年3月15日报道：随着多种生物基因组被破译，科学家证明生物的新基因是通过基因重复获得的。美中两国科学家组成的研究小组在最近的研究中证明，进化理论所推断的“重复基因中的一部分可能产生新功能，有助于生物对环境适应”的论断是正确的。第73页/共119页三、目的基因的获得

(三)基因的排列

3.加倍基因

多倍体生物中的基因，与重复基因相似高等生物：2n=两套基因组原核生物：n=一套基因组蓝藻：多倍性染色体，存在多套基因，不易获得基因突变体第74页/共119页三、目的基因的获得

(三)基因的排列

4.基因重排有的基因组中，同一基因簇处在不同细胞中时，基因排列会发生变化。第75页/共119页三、目的基因的获得目的基因分离是基因工程研究和应用的关键内容不同基因组类型的基因组大小、基因组成和基因排列各不相同

根据不同的实验要求，采用不同的途径和方法分离目的基因分离的基因promoterorterminator编码区：只分离ORF操纵子：启动子、功能相关的编码基因和终止子有功能的基因：启动区、编码区和终止区第76页/共119页三、目的基因的获得

(四)目的基因的分离方法根据不同类型基因组的大小、基因组成和基因排列方式不同，采用以下的方法可以把目的基因从基因组中分离出来。直接分离法化学合成法聚合酶链式反应（PCR）分离法基于基因文库的分离法第77页/共119页三、目的基因的获得

(四)目的基因的分离方法

1.直接分离法（1）限制性核酸内切酶酶切分离法对已知序列的DNA分子；对已知定位的目的基因；其它DNA分子可与基因组文库相结合；

缺点：该方法适于从基因组简单的生物体中分离目的基因，如病毒等第78页/共119页三、目的基因的获得(四)目的基因的分离方法

1.直接分离法（2）物理化学法根据基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等的差异，从生物基因组中分离目的基因。

密度梯度离心法

单链酶解法

分子杂交法第79页/共119页三、目的基因的获得(四)目的基因的分离方法

1.直接分离法（2）物理化学法

密度梯度离心法：其原理是GC含量高DNA片段的浮力密度较高，而富含ATDNA片段的浮力密度低，利用密度梯度超速离心技术可以分离GC含量较高的目的基因片段。海胆基因组DNAGC含量63%的rDNARE酶切离心方射性标记

mRNA杂交分离rRNA基因第80页/共119页三、目的基因的获得(四)目的基因的分离方法

1.直接分离法（2）物理化学法

单链酶解法GC63%rDNATm1Tm2Tm3＜＞Tm2：97℃S1酶切得到rDNA第81页/共119页三、目的基因的获得(四)目的基因的分离方法

1.直接分离法（2）物理化学法分子杂交法（Molecularhybridization)

ssDNA与其互补的核苷酸序列配对形成dsDNA，这就是分子杂交的原理。

Beckwithetal.(1969)应用DNA-DNA分子杂交技术，分离得到了E.coli

的Lacoperon的β-半乳糖苷酶基因。缺点：仅在理论上有重要意义，在实践上很难应用第82页/共119页三、目的基因的获得(四)目的基因的分离方法

1.直接分离法双抗体免疫法：抗原、抗体结合原理，条件：纯化目的基因的天然蛋白、制备抗天然蛋白的抗体。431243H2N431243（蔗糖梯度离心）含mRNA的核糖体复合体酚.绿仿抽提RT-PCRcDNAmRNA二抗Aboligo-dT柱层析黄色葡萄球菌的ProteinA可以代替二抗第83页/共119页三、目的基因的获得(四)目的基因的分离方法

1.直接分离法

利用酶促反转录法分离基因：主要用于合成分子质量较大，转录产物mRNA易分离目的基因。

例如：哺乳送物的网织红细胞中的珠蛋白mRNA（占总mRNA的90%），用以上方法建立cDNA文库，得到珠蛋白基因。mRNAcDNAdcDNA第84页/共119页三、目的基因的获得

(四)目的基因的分离方法

2.化学合成法

1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。

化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的第85页/共119页三、目的基因的获得(四)目的基因的分离方法

2.化学合成法固相磷酸三酯合成过程DNA合成仪第86页/共119页三、目的基因的获得

(四)目的基因的分离方法

2.化学合成法用途：

直接合成基因（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA（2）有些基因比较短，化学合成费用较低合成引物（20mer左右）合成探针序列定点突变合成合成带有定点突变的基因片断。

合成人工接头或衔接物EcoRIAdaptorEcoRILinker第87页/共119页三、目的基因的获得

(四)目的基因的分离方法

3.基于PCR的分离法

PCR法定向扩增目的基因的基本原理

PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。第88页/共119页三、目的基因的获得

(四)目的基因的分离方法

3.基于PCR的分离法

（1）直接从基因组中扩增提取基因组DNA作模板根据目的基因序列设计引物

PCR扩增

适合扩增原核生物基因。

真核生物基因组含有内含子！第89页/共119页三、目的基因的获得原核基因组部分原核细胞提取基因组DNAPCR扩增第90页/共119页三、目的基因的获得

(四)目的基因的分离方法

3.基于PCR的分离法

（2）从mRNA中扩增:RT-PCR提取基因组totalRNA反转录合成总cDNA作模板根据目的基因序列设计引物

PCR扩增

适合扩增真核生物基因。

原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。第91页/共119页三、目的基因的获得目的基因的引物1反转录成目的基因cDNA第一链目的

基因cDNA第二链PCRmRNA目的基因的引物2第92页/共119页三、目的基因的获得

(四)目的基因的分离方法

3.基于PCR的分离法

（3）同源序列克隆法

依据：自然界的长期进化中，一些蛋白质的基因编码序列保持着高度的保守性，在生物的种属之间，基因编码序列有着很高的同源性。方法：根据同源序列设计引物进行PCR扩增，利用PCR产物进行RACE扩增或结合DNA文库进行分离目的基因。第93页/共119页三、目的基因的获得第94页/共119页三、目的基因的获得根据已知基因序列或同源序列分离目的基因第95页/共119页三、目的基因的获得5'-RACE

第96页/共119页三、目的基因的获得3'-RACE

第97页/共119页三、目的基因的获得

(四)目的基因的分离方法

4.基于基因文库的分离法大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤。第98页/共119页三、目的基因的获得

(四)目的基因的分离方法

4.基于基因文库的分离法

核酸杂交法

原理：将基因文库的菌落或噬菌斑原位转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜之后，进行裂解，释放DNA并且固定在膜上，利用特异的核酸探针进行筛选，根据碱基配对原则筛选到目的基因。第99页/共119页三、目的基因的获得第100页/共119页三、目的基因的获得(四)目的基因的分离方法

4.基于基因文库的分离法

核酸杂交法

关键是获得杂交探针，何谓是探针？如何获得探针？

获得核苷酸探针的方法：

1）“基因园”：同源基因筛选

2）寡核昔酸简并引物探针：对目的基因的表达产物的氨基酸序列有所了解，则可以从这些氨基酸序列倒过来推导出核酸的可能序列，合成寡核昔酸作为探针

3）EST部分测序

第101页/共119页三、目的基因的获得第102页/共119页三、目的基因的获得

(四)目的基因的分离方法

4.基于基因文库的分离法

应用表达文库分离克隆的目的基因（免疫学分离法）

当没有可用的核苷酸序列供作筛选基因文库的探针时，将cDNA克隆在表达载体上，再导入大肠杆菌寄主细胞然后通过对蛋白质产物的鉴定，分离克隆的真核目的基因。特点：

1）表达的蛋白质以融合蛋白质的形式存在，其中原核蛋白质的氨基酸序列是整合在真核蛋白质的一个末端，不易被原核细胞中的有关蛋白酶消化降解，因而显得比较稳定，可以得到较高的表达水平。

2）cDNA片断必须置于启动子序列下游，在其控制之下；按正确的取向和读码结构插入，确保产生正确的蛋白质。第103页/共119页三、目的基因的获得

(四)目的基因的分离方法

4.基于基因文库的分离法

应用表达文库分离克隆的目的基因筛选的方法：

1）利用抗体筛选表达文库；

2）测定蛋白质的功能；

3）用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合位点的DNA片断作探针筛选表达文库。第104页/共119页三、目的基因的获得将菌落或噬菌斑原位复制到膜上处理之后蛋白质暴露，与第一抗体温育漂洗未结合的抗体，加入经标记的第二抗体能与第一抗体结合抗体筛选表达文库第105页/共119页三、目的基因的获得(四)目的基因的分离方法

4.基于基因文库的分离法

应用表达文库分离克隆的目的基因

2）测定蛋白质的功能生物化学研究表明，存在Ca＋＋离子的条件下，钙调蛋白能与许多种酶结合形成稳定的复合物。将放射性同位素标记得钙调蛋白用作探针筛选cDNA表达文库，鉴定能够表达出与它特异性结合的目标蛋白质的阳性克隆。

3）用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合位点的DNA片断作探针筛选表达文库鉴定能够表达出与特定DNA片断（真核启动子中与转录因子结合的DNA元件）结合的目标蛋白质的克隆。第106页/共119页三、目的基因的获得

(四)目的基因的分离方法

4.基于基因文库的分离法

应用表达