生物制药工艺学氨基酸类药物氨基酸的生产方法讲义

其次章氨基酸类药物其次节 氨基酸的生产方法赖氨酸的发酵生产和产品的分别纯化工艺过程教学根本内容：直接发酵法直接发酵法的原理为细胞或其它有机物的过程。成相应的氨基酸，或微生物通过转氨酶作用，将一种氨基酸的氨基转移到另一种酮酸上，生成的氨基酸也称为初生氨基酸。大多数氨基酸均可通过以初生氨基酸为原料的微生物转化作用而产生。有些氨基酸可以以有机化合物和氨盐为前体，在相应酶作用下而产生。发酵法中氨基酸的碳链主要来自糖代谢中间产物，如草酰乙酸、α酸、赤藓糖-4-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、3-磷酸甘油酸及分枝酸等。直接发酵法分类5缬氨酸的发酵生产；使用养分缺陷型突变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸，如赖氨酸〔高丝氨酸缺陷、亮氨酸〔苯丙氨酸缺陷〕等；由氨基酸构造类似物抗性突变株生产氨基酸，如赖氨酸〔S-〔2-氨基乙酸〕-L-半胱氨酸〔AEC〕等；〔蛋氨酸、赖氨酸缺陷，α-氨基-βAHV〕等；以氨基酸的中间产物为原料，用微生物将其转化为相应的氨基酸，这一方法主要用于很难避开其反响调整机制，而难以用直接发酵法生产的氨基酸。L-色氨酸，用甘氨酸作为前体工L-丝氨酸。育，菌种培育、灭菌及接种发酵，产品提取及分别纯化等步骤。(二〕发酵法生产的氨基酸品种及工艺CO2、氨和水合成，动物体除8外界摄取外，其余非必需氨基酸均可通过体内氨基酸之间的转化或碳水化合物中间代谢物而合成，而微生物利用碳源、氮源及盐类几乎可合成全部氨基酸。大，工艺治理要求严格，生产周期长，本钱高。本文仅以LL-赖氨酸直接发酵法为例，说明发酵法的根本过程。1、L-异亮氨酸〔L-Isoleucine，L-Ile〕的制备C6H13NO2131.17，构造式为：工艺过程① 菌种培育种子培育基组成〔%〕为：葡萄糖 2 尿素 0.3 玉米浆 豆饼水解液0.1〔以干豆饼计〕 pH6.5。0.4，其余同一级种子培育基。一级种子培育：1000ml三解瓶中培育基装量为200ml，接种一环牛肉膏斜AS1.99830℃培育〔7cm105min〕16h。②灭菌、发酵发酵培育液组成〔%〕为:硫酸铵 4.5 豆饼水解液 0.4，玉米浆 2.0碳酸钙 4.5 pH7.2，淀粉水解复原糖初糖浓度 11.5。在5m3发酵罐中添加3吨发酵培育液，加热至118～120℃，1.1×105Pa压力，灭菌30min，马上通冰盐水冷却至25℃。接入1％菌种〔v／，维持0转／min的搅拌速度，升温至0～1℃，以／〔min〕60h24～50h0.60.27。③除菌体、酸化发酵完毕后，发酵液加热至100℃并维持10min，冷却过滤，滤液加工业pH3.5，过滤除沉淀。④离子交换、吸附分别1.5H732〔Φ40×mL0l／Ln速进展洗脱，分部收集洗脱液。⑤浓缩赶氨1／4，再浓缩至粘稠状。如此重复三次。⑥脱色、浓缩、中和上述浓缩物加去离子水至原体积的1／4，搅拌均匀，加2mol／L盐酸调2mol／LpH6.0，5℃沉淀过夜,过滤抽千，105℃烘干得：L-异亮氨酸半成品。⑦精制、烘干10kgL8L20L去离子水，加热至80℃，10kgpH10.5，过滤，滤液用碱调pH1.5，580L80℃搅拌溶解，适当浓度，用氨水调pH6.0，5℃放置结晶过夜。次日过滤收集结晶，抽干，于105L-异亮氨酸成品。检验0.3L-亮氨酸的规定一样。0.0015％，1.5ppm。作用与用途L-Ile2、L-赖氨酸〔L-Lysine，L-Lys〕的制备146.20，构造为：①菌种培育②灭菌、发酵发酵培育液成分〔％〕为淀粉水解糖13.5，磷酸二氢钾0.10.051.20.41.01.0，甘2.0，pH6.7lL〔5m35m331.01×105Pa118～120℃灭菌30min，3010％〔v／v〕比例接种，以1:0.6〔v／v〕通3042～51h180／min。③发酵液处理：离心除菌体；80℃加热；732;PH=5.0pH=8.0～14.0〔氨水洗脱〕发酵法的根本过程理，菌种培育、接种发酵，产品提取及分别纯化等步骤。氨基酸发酵方式主要是液体通风深层培育法，其过程是由菌种试管培育逐化和精制有关氨基酸，其分别纯化、精制方法及过程与水解法一样。直接发酵法实例指通过特定微生物在以糖为碳源、以氨或尿素为氮源以及其它成分的培育基中生长，直接产生氨基酸的方法。L-异亮氨酸的制备工艺流程菌种培育种子培育基组成〔％〕为：葡萄糖2，尿素0.3，玉米浆2.5，豆饼水解液0.1，pH6.5。二级种子培育基加菜籽油，其余同一级种子培育基。AS1.99830℃、16h。3.58h。逐级放大。灭菌、发酵发酵培育液组成〔％54，碳酸钙551％菌种，搅拌，发酵。除菌体，酸化发酵完毕后，发酵液加热至100℃并维持10min，冷却过滤，滤液加工业pH3.5，过滤除沉淀。离子交换、吸附分别上述滤液每分钟以树脂量1.5％的流速进H＋型732离子交换柱〔φ40×100cm),以100L60℃,0.5mol/L3L/min进展洗脱。分部收集洗脱液。浓缩赶氨脱色、浓缩、中和精制，烘干工艺过程评价点是产物浓度低，设备投资大，工艺治理要求严格，生产周期长，本钱高。酶法转化概述酶法是应用完整的菌体或自微生物细胞提取的酶类制备氨基酸的方法。赖氨酸、色氨酸等均可用酶法进展制备。在发酵工业中早在1973年就用固定化菌体的方法生产天冬氨酸。将酶或细胞进展固定化处理，再将固定化酶或细胞装填于适当反响器中制成所谓“生物反响堆相应氨基酸成品。其分别纯化和精制的原则及方法与水解法一样。者为单酶或多酶的高密度转化，而后者为多酶低密度转化。两者相比，酶工程胞可进展连续操作，节约能源和劳务，并可长期反复使用。如聚丙烯酰胺凝胶300固定化酶凡限制在肯定的空间范围内并能连续反复的使用的酶都称为固定化酶。法和包埋法。吸附法这是通过载体外表和酶分子外表间的次级键相互作用而到达固定目的的方法，又可分：物理吸附和离子交换吸附。π－电子亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法。纤维素、胶原、赛珞玢以及火棉胶等有机吸附剂。CM〔羧甲基〕－纤维素、DEAE〔二乙基氨基乙基〕－纤维素、DEAE－葡聚糖凝胶等。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂，50～150mgg共价偶联法制备固定化酶的方法。交联法载体间进展交联反响以共价键制备固定化酶。包埋法〔包括交联剂的作用进展聚合，将酶包埋于聚合物中以到达固定化的目的。N，N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂聚合而成。25nm进展包埋固定化的方法。脂质体包埋脂质体是指具有脂双层构造和肯定包裹空间的微球体。辅酶及偶联酶的固定化辅酶物质的固定化一般承受载体共价偶联法。工艺过程①菌种培育大肠杆菌〔Esscherichiacoli〕AS1.881的培育斜面培育基为一般肉汁培育基；〔％50•2，pH6.0,煮沸后过滤，500ml50～100m1。逐级扩大培育至1000～2023L规模。培育完毕后用1mol／LHCl调pH5.0，升温至45℃并保温1h，冷却至室温，转筒式高速离心机收集菌体〔含天冬氨酸酶，备用。德阿昆哈假单胞菌〔Pseudomonasdacunhae〕68斜面培育基组成〔％〕为蛋白胨0.25，牛肉膏0.52，酵母膏0.25，NaC10.5，pH7.02.0。种子培育基与斜面培育基一样，唯不加琼脂，250ml三角烧瓶中培育基装40m1。摇瓶培育基组成〔％〕为L-谷氨酸3.0，蛋白胨0.9，酪蛋白水解液0.5，0.05，MgSO4•7H2O0.01pH7.2，500ml80ml。种子摇瓶培育基中，30℃振荡培育24h，如此逐级扩大至1000～2023L的培育1mol／LHClpH4.75301h，用转筒式高速离心机离心收集菌体〔-天冬氨酸脱羧酶，备用。②细胞固定Ecoli的细胞固定取湿菌体20kg80L，生理盐水〔或离心后的培育清液L00％0.25％戊二醛溶液中。于53～5mm0.255℃过夜、E.coli，备用。假单胞菌体固定20kg40L，另取溶于生理盐水的5％角叉菜胶溶液85L，两液均保温至45℃后混合，冷却至5℃成胶。浸于600L2%KCl0.2mol／L己二胺的0.5mol／LpH7.0的磷酸缓冲液中，5℃KClL-天冬氨酸-β-脱羧酶的固定化细胞，备用。④转化反响37lmol／L〔1mmol／LMgC12，pH8.5〕〔＞95％〕L-AspL0.1mmol／L371.515×105Pa物反响堆Ⅱ，掌握到达最大转化率〔＞95％〕为限，收集转化液，用于制取L-丙氨酸。5)产品纯化与精制生物反响堆Ⅰ转化液经过滤澄清，搅拌下用1mol／LHCl调pH2.8，5℃结晶过夜，滤取结晶，用少量冷水洗涤抽干，105℃枯燥得L-Asp粗品。粗品155℃结晶过夜，滤取结晶，85L-Asp。60～7050％，70醇，580L－Ala。检验作用与用途CO2L-AspL-Ala〔1〕酶法是利用微生物特定的酶系作为催化剂，使底物经过酶催化生成所需的的可能。特点，但要将它们应用于工业化生产，还需要进一步的争论。如何获得廉价的合成底物和酶原是这一方法能否成功的关键。近年来，随着基因重组技术的进步，使酶法生产氨基酸技术更具有光明的前景。L-苯丙氨酸165.19，构造为：eeeD-PheL-PheAc-D-PheeeDL-PheL-Phe。DL-Phe①固定化氨基酰化酶的制备取DEAE-SephadexA-50浸泡后，依次用10倍量0.5mol／LHCl和0.5mol／LNaOH溶液搅拌处理30min，再用去离子水洗至中性，然后依次用0.1mol／L及0.01mol／L的pH7.01～2h，滤干备用。62mol／LNaOHpH6.7~7.0100L1kgDEAE-SephadexA-50的比例混合，于0～4℃搅拌吸附4～5h，滤取DEAE-3～41％甲苯后于冷库中贮存，备用。②ee17〔w／V／〕60Ac－DL－Phe。③酶水解5hL－Phe，固定化酶再用于转化。④分别纯化上述滤液用6mol／LHClpH4.8～5.135L010L80℃20LAc-D-Phe⑤精制取50L去离子水于100L反响罐中，加热至95~100℃，投入5kgL－Phe粗品，搅拌溶解，加药用活性炭0.25kg，搅拌脱色3min。趁热过滤，40℃ 95％乙醇用6mol／LHClpH5.5010L3～4803～4hL-PheL－Phe旋。Ac－D－Phe的消旋上述粗品及精品L-Phe母液及洗涤液合并后浓缩至60L100L18.5L25～45℃搅拌反响30min，冷却至室温，放置6hPHl.5～2.0，5℃结晶过夜，滤取3～520L40Ac－DL－Phe。98.5％～101.5％之间α〕D3～31H4～01.5ppm0.003%。含量测定：作用与用途L成苯丙氨酸氮芥及对氟苯丙氨酸等抗癌药的原料。化学合成法概述DL色氨酸、苯丙氨酸。兼用合成法的有苏氨酸和缬氨