原核生物的转录及调控

原核生物的转录及调控第1页，共67页，2023年，2月20日，星期六转录：在DNA指导的RNA聚合酶催化下，以DNA链的一条链为模板，按照碱基配对原则合成RNA链的过程。不对称转录：在DNA双链分子中，转录通常只在DNA的一条链上进行，另一条链则不能转录，但可能对转录起调节作用，这种转录方式称不对称转录。转录单位：就是从启动子到终止子的一段DNA序列。第一节转录概述第2页，共67页，2023年，2月20日，星期六一、基因的编码链和有意义链

模板链：用于转录RNA的链称为模板链，或负（－）链，又称无义链。编码链：与模板链互补的DNA链称为编码链，或正（＋）链，又称有义链。第3页，共67页，2023年，2月20日，星期六二、转录的基本要点

底物：NTP；模板：反义链；方向：5’→3’；酶：RNA

pol；产物：RNA单链第4页，共67页，2023年，2月20日，星期六转录和复制：都是遗传信息的传递第5页，共67页，2023年，2月20日，星期六三、转录起始位点转录起点位点核苷酸为＋1。上游序列upstream：转录起点的前面的序列，用负数码（－）表示，起点前一个核苷酸为－1。下游序列downstream：

转录起点的后面的序列，用正数码（＋）表示。没有编号为○的碱基。第6页，共67页，2023年，2月20日，星期六第7页，共67页，2023年，2月20日，星期六第二节原核生物转录的相关酶类

一、E.coliRNA聚合酶E.coli只有一种聚合酶；E.coliRNApol全酶由5种亚基组成，即α2ββ’ωσ，480kD；α2ββ’ω构成核心酶，核心酶与σ因子构成全酶。

第8页，共67页，2023年，2月20日，星期六E.coliRNA聚合酶的基本性质第9页，共67页，2023年，2月20日，星期六RNApolymerase

inprok.σβααβ’CoreEnzymeHoloEnzyme

forelongationforinitiation依靠静电作用力依靠空间结构非专一性与非特异DNA结合专一性与特异DNA结合半衰期；60’半衰期；数小时cover60bp

σβα

αβ’第10页，共67页，2023年，2月20日，星期六RichardBurgessandAndrewTravers(1969)150kD160kD70kD40kDCartoonillustratingseparationofthesubunitsofE.coliRNApolymerasebySDS第11页，共67页，2023年，2月20日，星期六1、核心酶：催化磷酸二酯键的形成α亚基：2个，功能多样（核心酶的组建因子、促进双链的解开和重新聚合、启动子识别、促进RNApol与DNA模板链上游转录因子结合）β亚基：1个，结合核苷酸底物，催化磷酸二酯键的形成；β’亚基：碱性强，与模板链结合；二、RNA聚合酶各亚基的功能第12页，共67页，2023年，2月20日，星期六2、σ因子：Reusable；修饰RNApol的构型；识别启动子，但无催化活性。不同原核生物具有基本相同的核心酶，但σ亚基有所差别，决定了原核生物基因的选择性表达。第13页，共67页，2023年，2月20日，星期六3、原核生物RNA聚合酶抑制剂：利福平（Rifampin）：与细菌RNApolβ亚基结合，阻碍转录的起始作用；利链菌素（

streptolydigin）：与细菌RNApolβ亚基结合，抑制转录的延伸。肝素：与细菌RNApolβ’亚基结合，阻碍其与模板DNA的结合。第14页，共67页，2023年，2月20日，星期六第三节原核生物转录的过程

RNA的转录包括promotion，elongation，termination

三过程；从promoter到terminator称为transcriptionalunit；原核生物中的转录单位多为

polycistron；转录起始点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值。+1

-10

+10upstreamstartpointdownstream第15页，共67页，2023年，2月20日，星期六一、转录的起始

关键：全酶能以很高的亲和性结合在启动子promoter；启动子：RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段DNA序列。第16页，共67页，2023年，2月20日，星期六promoter由两个重要部分组成

（一）原核启动子的结构第17页，共67页，2023年，2月20日，星期六●-70~-40：upelement（上游元件）CAP-cAMPbindingsite

●-35~-10：corepromoter（核心启动子）

RNApol.bindingsite

基因表达调控的正控制位点CAP：

CatabolitegeneActivatorProteincAMPAcceptorProtein（cAMP受体蛋白）（分解代谢基因激活蛋白）第18页，共67页，2023年，2月20日，星期六1、核心启动子：

SextamaBox：（Rsite）TTGAC（SextamaBox）-35site。RNApol.looselybindingsitePribnowBox：

TATAAT（pribnowBox）-10site。RNApol.firmlybindingsite（Bsite）Initiationsite：+1site。RNAtranscriptionalstartpoint（Isite）A/G-35(R)-10(B)+1(I)RNA第19页，共67页，2023年，2月20日，星期六l

SextamaBox与PribnowBox间距17bp，有利于RNApol启动l

-35Boxor-10Boxmut.

间距趋近于17bp，upmutation间距远离于17bp，downmutation17bp的间距比17bp的序列对转录更为重要-35Boxand-10Boxmut.

→转录效率下降100倍→转录效率下降1000倍第20页，共67页，2023年，2月20日，星期六2、上游元件：

CAP-cAMPbindingsite（Activatorregion，AR）当：ARI+CAP-cAMP●ARI：CAP-cAMP的强结合位点（-70~-50）●

ARII：CAP-cAMP的弱结合位点（-50~-40）cooperativeeffect提高ARII的结合效率IR-70

ARI-40ARII

IR

-50第21页，共67页，2023年，2月20日，星期六

RNApol

ARII+CAP-cAMP复合体：促使-35

box附近GC岛区的双螺旋结构稳定性降低，-10

box的解链温度降低，有利于转录启动

ARIARIIGCIsland-35-10

●NullARII→

RNAo-10Boxbuttranscriptionoff

●

ARII+CAP-cAMPpromotionRNAo-35Boxinto-10Boxstartingtranscription

RNApol

RNApol第22页，共67页，2023年，2月20日，星期六α-CTDCAP-cAMPARIARIIARIARIIActivationtranscription

Upelement+CAP-cAMP＋RNAPolymerase复合体

CAP-cAMP与RNAPolymerase的α-CTD结合，激活转录

第23页，共67页，2023年，2月20日，星期六（二）原核基因转录的起始

1、σ因子的作用：降低全酶与一般DNA的非专一性结合力（20000倍）；增强全酶与启动子Rsite、Bsite的专一性结合力（100倍）；导致RNA链的延伸缓慢第24页，共67页，2023年，2月20日，星期六Promoter与σfactor间的结合专效性●决定了strongpromoter&weakpromoter；★-35box,-10

box的差异影响启动子与RNApol中σ因子的结合能力；★不同启动子的-35，-10box间存在较为保守的标准序列（标准启动子）；★σfactorisresponsibleforrecognitionofconsensussequenceofpromoterandonlyrequiredforinitiation.第25页，共67页，2023年，2月20日，星期六2、RNA

pol与启动子的结合σ因子识别启动子上结合位点。RNApol全酶与-35box结合→封闭型启动复合物；酶向-10box移动，并与之牢固结合，促使-10box及起始位点处发生局部解链→开放型启动复合物；DNA解螺旋扩展到-10box下游17bp范围。第26页，共67页，2023年，2月20日，星期六3、转录起始位点的决定酶与-10box的结合，决定了第一个起始碱基的选择。第一个被转录的碱基离-10

box的保守T约6~9nts。mRNA的起始位点多为G，其次为A

，很少为U,起始点核苷酸的两侧分别为C和T。第27页，共67页，2023年，2月20日，星期六4、三元复合物的形成和σ因子的解离RNA合成一开始，就形成模板-RNA

pol-RNA的三元复合物。σ因子解离，核心酶与模板的亲和性下降到非特异性结合的水平，RNA

pol在DNA链上变得容易移动，为链的延伸创造了条件；游离的σ因子可以重新进行功能循环。第28页，共67页，2023年，2月20日，星期六转录的起始核心酶在σ因子帮助下特异性结合到DNA上；RNA

pol与启动子-35box结合，形成封闭型起始复合物；酶滑动到-10box，转变成为开放型起始复合物，启动子活化，双链解开，模板链暴露，插入最初的2个核苷酸；酶继续加上开头的几个NTP，形成三元起始复合物，在RNA链合成了8～9个碱基后，σ因子解离，转录开始。第29页，共67页，2023年，2月20日，星期六ModeloftheinteractionbetweenE.coilRNApolymeraseholoenzymeandapromoterDNAIncorporatingthefirstfewNt第30页，共67页，2023年，2月20日，星期六二、原核生物转录的延伸

RNA

pol沿着模板链移动，RNA链不断延伸，并保持三元复合物的结构；转录泡中的DNA螺旋前开、后合，RNA延长，不断脱离DNA；RNA链的延伸速度不是恒定的，在模板富含GC的区域，转录就会减慢/停顿。第31页，共67页，2023年，2月20日，星期六17bp螺旋解开长度12bpDNA-RNA复合体长度第32页，共67页，2023年，2月20日，星期六影响RNA延伸速度的因素：①RNA

pol；②暂停信号：导致转录速度突然出现变化的特殊序列。GC富集区：产物RNA不易释放；IR：产物形成茎环结构，妨碍上游的模板恢复双链。③其他配基：ppNpp、NusA蛋白。第33页，共67页，2023年，2月20日，星期六NusAprotein：

★69Kd,acidprotein★RNApol-attachingfactor★

ImpelRNApol.pausinginterminatorfor1’-15’andwaitingforRhofactortostoptranscriptionofRNA

★Afterinitiation→substitutingσ→NusA+coreE

antitermination

Nproteinutilizationsubstance第34页，共67页，2023年，2月20日，星期六NusAbindstopolymerase,andNbindstobothNusAandboxBofthenutsiteregionofthetranscript,creatingaloopinthegrowingRNA.Thiscomplexisrelativelyweakandcancauseantiterminationonlyatterminatorsnearthenutsite(Theseconditionsexistonlyinvitro.).(NutNbindingsite

)antiterminationNprotein第35页，共67页，2023年，2月20日，星期六三、原核生物转录的终止

转录的终止依赖于RNA产物的特定序列；原核和某些真核生物的终止子要求转录产物RNA3’端具有发夹的二级结构，茎部富有GC序列；终止子的分类：根据终止反应是否需要ρ蛋白第36页，共67页，2023年，2月20日，星期六1、不依赖于ρ因子的终止子（强终止子）结构特点：RNA具有一个发夹结构（富含GC）和随后polyU片段。作用机制：RNApol+发夹结构→转录暂停→后随杂合分子不稳定的poly(U-dA)→RNA容易从模板上脱落→RNA-DNA-RNApol解聚→转录终止第37页，共67页，2023年，2月20日，星期六第38页，共67页，2023年，2月20日，星期六2、依赖于ρ因子的终止子（弱终止子）

ρ因子：55kD，六聚体。能够利用水解ATP释放的能量使RNA从三元复合物中释放出来；结构：仍然具有茎环结构，但GC碱基对含量较少，下游也缺乏polyU结构。

第39页，共67页，2023年，2月20日，星期六第40页，共67页，2023年，2月20日，星期六1、2、3、第41页，共67页，2023年，2月20日，星期六终止类型回文序列后随序列不依赖ρ因子的终止子富含GC富含U依赖ρ因子的终止子不富含GC不富含U第42页，共67页，2023年，2月20日，星期六第四节原核生物转录的调控基因表达的调控主要发生在转录水平；转录水平上的调控是最为经济、灵活，又是最为重要、复杂的调控；①确定需要转录基因的起始位点；②精细调节基因表达的水平；③cisfactor与transfactor严格又灵活的互作；④保证RNApol的连续转录，准确终止。第43页，共67页，2023年，2月20日，星期六一、原核转录调控的相关概念

（一）诱导和阻遏：诱导：酶的合成取决于特定物质（常为substrate）的存在。如培养基中乳糖的存在促进了E.coli的半乳糖苷酶的合成；阻遏：当培养基中某种物质（常为product）含量较高，细胞就关闭合成这种物质的能力。如培养基中Trp的存在抑制了E.coli

Trp的合成；第44页，共67页，2023年，2月20日，星期六（二）调控的效应物调节蛋白+小分子物质→原核操纵子的诱导/阻遏。这些小分子是基因表达的调节物质--效应物。诱导物（inducer）：与调节蛋白结合，使其从DNA分子上脱落下来，RNApol开始转录。辅阻遏物（co-repressor）：与调节蛋白结合，可以提高调节蛋白与操纵基因的亲和性，进而关闭结构基因的转录。第45页，共67页，2023年，2月20日，星期六（三）正调控和负调控

正调控：调节蛋白与操纵子结合后促进转录的进行。负调控：调节蛋白与操纵子结合后抑制转录的进行。正、负调控都存在着诱导和阻遏。第46页，共67页，2023年，2月20日，星期六positiveactiveinactiveInd.Rep.①正调控+诱导调节蛋白无活性→转录不进行诱导物+调节蛋白→有活性调节蛋白→转录进行②正调控

+阻遏调节蛋白有活性→转录进行辅阻遏物+调节蛋白→无活性调节蛋白→转录不进行第47页，共67页，2023年，2月20日，星期六negativeactiveinactive阻遏蛋白有活性→转录不进行诱导物+阻遏蛋白→无活性阻遏蛋白→转录进行③负调控

+诱导④负调控+阻遏阻遏蛋白无活性→转录进行辅阻遏物+阻遏蛋白→有活性调节蛋白→转录不进行Ind.Rep.Negative第48页，共67页，2023年，2月20日，星期六二、操纵子理论（operonconcept）定义：原核生物基因表达和调控的单元。包括：①结构基因：编码控制某一代谢途径的相关的酶；②调控元件：是调节结构基因转录的一段DNA序列，包括启动子和操纵基因；③调节基因：其产物（调节蛋白）能够识别并结合操纵基因，决定结构基因的转录与否。第49页，共67页，2023年，2月20日，星期六（一）lac操纵子（lactoseoperon）：1、lac操纵子的结构调节基因（I）：编码阻遏物（Repressor）。启动子（Promoter，P）：RNA

pol的结合位点；操纵基因（Operator，O）：进入结构基因的开关；结构基因：Z（β-半乳糖苷酶）、Y（β-半乳糖苷透过酶）、A（β-半乳糖苷乙酰基转移酶）；第50页，共67页，2023年，2月20日，星期六β-半乳糖苷酶：水解含β-半乳糖苷键的底物，如乳糖。β-半乳糖苷透过酶：使外界的β-半乳糖苷能透过E.coli细胞壁和原生质膜进入细胞内。β-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰CoA+β-半乳糖苷→乙酰半乳糖。当E.coli需要利用培养基里的乳糖时，前2种酶是必需的，而最后1种酶则是非必需的。第51页，共67页，2023年，2月20日，星期六

没有乳糖→lacI编码的阻遏蛋白具有活性→牢固结合到操纵基因O上→结合在启动区的RNApol不能通过→Z、Y、A不能转录（和表达）2、lac操纵子的负向调控机制负调控+诱导第52页，共67页，2023年，2月20日，星期六

加入乳糖→乳糖（诱导物）与阻遏蛋白结合→阻遏蛋白构象变化→阻遏蛋白从操纵基因上脱落→RNApol开始Z、Y、A基因的转录→表达→乳糖被利用第53页，共67页，2023年，2月20日，星期六3、lac操纵子CAP的转录激活作用正调控CAP：二聚体，可同时与DNA、cAMP结合；G存在→细胞内[cAMP]↓→CAP二聚体不能单独与DNA结合→lac操纵子关闭G缺乏→细胞内[cAMP]↑→CAP与cAMP结合→CAP-cAMP复合物+lac操纵子启动子上游

→DNA链发生90o弯曲→增强RNApol与启动子的结合→lac操纵子打开→Z、Y、A基因转录、表达第54页，共67页，2023年，2月20日，星期六CAP第55页，共67页，2023年，2月20日，星期六乳糖操纵子的协同调节(coordinateregulation)负向调节与正性向调节协同合作阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋白从lacO上s释放仍无转录活性结论：lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖第56页，共67页，2023年，2月20日，星期六（二）trp操纵子Trp的合成：一系列酶促反应的结果（分支酸→邻氨基苯甲酸→吲哚甘油磷酸→Trp）；1、trp操纵子的阻遏系统－转录起始的调节有Trp：Trp结合并激活阻遏蛋白，阻断转录；无Trp：阻遏蛋白无活性，操纵子基因开始转录。第57页，共67页，202